Detección y análisis automatizados de exocitosis

Resumen

Desarrollamos un software automatizado de visión por computadora para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensibles al pH. Aquí, demostramos el uso de una interfaz gráfica de usuario y RStudio para detectar eventos de fusión, analizar y mostrar parámetros espaciotemporales de fusión y clasificar eventos en distintos modos de fusión.

Resumen

La microscopía TIRF de lapso de tiempo de GFP sensible al pH (pHluorin) unida a las proteínas SNARE de vesícula es un método eficaz para visualizar eventos exocíticos de vesícula única en cultivo celular. Para realizar una identificación y análisis imparcial y eficiente de dichos eventos, se desarrolló e implementó en MATLAB un enfoque basado en la visión por computadora. La canalización de análisis consiste en un algoritmo de segmentación celular e identificación de eventos exocíticos. El enfoque de visión por computadora incluye herramientas para investigar múltiples parámetros de eventos individuales, incluida la vida media de la desintegración por fluorescencia y el pico de ΔF / F, así como el análisis de células enteras de la frecuencia de la exocitosis. Estos y otros parámetros de fusión se utilizan en un enfoque de clasificación para distinguir distintos modos de fusión. Aquí, una GUI recién construida realiza la canalización de análisis de principio a fin. La adaptación adicional de la función K de Ripley en R Studio se utiliza para distinguir entre la ocurrencia agrupada, dispersa o aleatoria de eventos de fusión tanto en el espacio como en el tiempo.

Introducción

Las construcciones VAMP-pHluorin o el receptor de transferrina (TfR)-pHuji son excelentes marcadores de eventos exocióticos, ya que estos fluoróforos sensibles al pH se apagan dentro de la luz de la vesícula ácida y la fluorescencia inmediatamente después de la apertura del poro de fusión entre la vesícula y la membrana plasmática¹. Después de la apertura del poro de fusión, la fluorescencia decae exponencialmente, con cierta heterogeneidad que revela información sobre el evento de fusión. Aquí, se describe una aplicación de interfaz gráfica de usuario (GUI) que detecta y analiza automáticamente los eventos exocióticos. Esta aplicación permite al usuario detectar automáticamente eventos exocióticos revelados por marcadores sensibles al pH² y generar características a partir de cada evento que pueden ser utilizadas para fines de clasificación³ (Figura 1A). Además, se describe el análisis de la agrupación de eventos exocióticos utilizando la función K de Ripley.

Recientemente se informó de la clasificación automatizada de eventos exocióticos en diferentes modos exocióticos³. Se han descrito previamente dos modos de exocitosis, la fusión de vesícula completa (FVF) y la exocitosis de fusión de beso y corrido (KNR)^4,5,6,7. Durante la FVF, el poro de fusión se dilata y la vesícula se incorpora a la membrana plasmática. Durante KNR, el poro de fusión se abre transitoriamente y luego vuelve a sesar^4,5,8,9,10. Se identificaron cuatro modos de exocitosis en neuronas en desarrollo, dos relacionados con FVF y dos relacionados con KNR. Este trabajo demuestra que tanto FVF como KNR se pueden subdividir en eventos de fusión que proceden inmediatamente a la desintegración de la fluorescencia (FVFi y KNRi) después de la apertura del poro de fusión o eventos exocíticos que exhiben un retraso después de la apertura del poro de fusión antes de que comience la desintegración por fluorescencia (FVFd y KNRd)(Figura 1B). El clasificador identifica el modo de exocitosis para cada evento de fusión. Aquí este análisis se ha incorporado en una GUI que se puede instalar en MATLAB en sistemas operativos basados en Windows y Mac. Todos los archivos de análisis se pueden encontrar en https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o
https://github.com/GuptonLab.

Protocolo

1. Elija conjuntos de datos y directorio

1. Para seleccionar conjuntos de datos para su análisis, haga clic en el botón Buscar conjuntos de datos ( Figura2A, cuadro rojo 1) para navegar a la carpeta donde se depositan los datos (por ejemplo, la carpeta RawData). Los archivos de datos rellenarán automáticamente los archivos de datos como una lista. Puede haber más de un conjunto de datos en la carpeta.
2. Haga clic en el botón Elegir directorio y seleccione el directorio (por ejemplo, Prueba) donde se depositarán los archivos analizados(Figura 2A,cuadro rojo 2). Se creará un conjunto de carpetas y archivos de análisis terminados, así como imágenes temporales intermedias en este directorio cuando se presione el botón Análisis. Se producirán errores si no se elige un directorio.

2. Establece el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas

1. Rellene la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel apropiados de las imágenes en el cuadro "Velocidad de fotogramas" o "Tamaño de píxel" apropiado(Figura 2A,cuadro verde). Si no se proporcionan valores (se establecen en el "0" predeterminado), el programa buscará en los metadatos asociados con el archivo la velocidad de fotogramas y el tamaño de píxel. Si no se pueden encontrar estos valores, el programa tendrá como valor predeterminado por píxel para la medición y por fotograma para los puntos de tiempo.
   NOTA: En el ejemplo proporcionado, la velocidad de fotogramas es 100 y el tamaño de píxel es 0,08.

3. Elige o haz máscaras

1. Utilice el botón Creador de máscaras para crear automáticamente máscaras de celda para los datos de la lista de conjuntos de datos de archivos(Figura 2A,cuadro azul). Al usar el botón Creador de máscaras, se creará una nueva carpeta en el directorio elegido llamada MaskFiles. El "Indicador de ejecución" se volverá amarillo mientras se ejecuta y volverá a verde cuando se complete.
   NOTA: Se creará una máscara para cada archivo de la lista Archivos de datos a partir de los primeros 10 fotogramas del archivo de imagen (o de todos los fotogramas si hay menos de 10 en el archivo de imagen) y se depositará en la carpeta MaskFiles utilizando el esquema de nomenclatura adecuado (que se describe a continuación).
2. Asegúrese de que los archivos de máscara rellenan automáticamente la lista Archivos de máscara. El usuario podrá proceder directamente al análisis.
   NOTA: Siempre verifique visualmente los archivos de máscara y confirme que capturan toda la región de interés. El primer fotograma del archivo de datos y el archivo de máscara se muestran en la interfaz de usuario cuando se seleccionan. (Figura 2B). El fabricante de máscaras puede producir errores en el caso de baja señal a ruido, por lo que validar que los archivos de máscara son apropiados es fundamental para el control de calidad.
3. Como alternativa al uso de Mask Maker, si la señal de ruido de las imágenes es insuficiente, cree máscaras manualmente en ImageJ.
   1. Primero, abra el archivo de imagen sin procesar en ImageJ(Figura 3A).
   2. Haga clic en el botón Selección de polígono y haga clic para dibujar una máscara alrededor de la celda. Una vez terminado, haga doble clic en el último punto para completar el polígono.
   3. Una vez terminado, vaya a Editar | Selección | Crear máscara (Figura 3B). Se creará una nueva máscara invertida basada en el dibujo del polígono. Guarde las máscaras en una carpeta MaskFiles designada en el directorio elegido. El esquema de nomenclatura de archivos de máscara debe coincidir con los archivos de datos individuales correspondientes seguidos de "_mask_file". Por ejemplo, si un archivo de datos se denomina "VAMP2_488_WT_1.tif", el archivo de máscara correspondiente debe llamarse "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
   4. Utilice el botón Buscar archivos de máscara para navegar a la carpeta elegida de archivos de máscara personalizados depositados. Las máscaras rellenarán los archivos de máscara como una lista.
      NOTA: Es importante tener una máscara para cada archivo de datos antes de ejecutar el análisis.

4. Análisis y extracción de características

1. Una vez elegido el directorio y rellenados la lista Archivos de datos y la lista De archivos máscara, haga clic en el botón Análisis (Figura 4A). Si se requiere la clasificación de eventos exocióticos, vaya al paso 5.
   NOTA: El clic del botón Análisis realizará una serie de tareas automatizadas para analizar los datos. Creará carpetas individuales en el directorio elegido para depositar los datos analizados. Mientras se ejecuta, el "indicador de ejecución" cambiará de verde a amarillo(Figura 4A,cuadro rojo). Una vez finalizado el análisis, esto volverá a cambiar a verde.
2. Busque una carpeta DataFiles(Figura 4B)con el conjunto completo de archivos de análisis (así como archivos de extracción de características, que se utilizarán en la clasificación posterior) nombrados de acuerdo con cada archivo de datos(Figura 4C).
   NOTA: A continuación se incluye una descripción de estos archivos de análisis en la sección Resultados representativos.

5. Clasificación de eventos exocióticos

1. Para realizar la clasificación simultánea de eventos exocióticos con detección automatizada, marque la casilla de verificación Clasificación antes de hacer clic en el botón Análisis. Para cada evento exocítico, asigne una puntuación de probabilidad entre 0-1 para cada clase. Un evento exocítico se considera clasificado como una de las cuatro clases si la puntuación de probabilidad para esa clase es > 0,5.
   NOTA: Una vez completado el análisis, aparecerá una nueva carpeta de archivos de datos dentro del directorio elegido. La carpeta contendrá archivos de análisis correspondientes a cada archivo de imagen.

6. Análisis espaciotemporal de la exocitosis utilizando los valores K de Ripley

1. Cree un archivo de máscara "neurite" y "soma" separado. Primero, segmentar el soma de la neurita. No existe un método imparcial para segmentar el soma de las neuritas, por lo que el usuario debe cegarse al experimento de condicionamiento y usar el mejor juicio; se sugiere un elipsoide sin extensiones de neurita obvias.
2. Abra ImageJ/Fiji.
3. Arrastre y suelte el archivo de máscara o use file | Abra y luego seleccione el archivo de máscara.
4. Utilice la herramienta de selección de color y haga clic en cualquiera de los píxeles negros en el fondo de la máscara para establecer el color en negro.
5. Utilice la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada para dibujar un contorno alrededor del soma, separándolo de las neuritas. Esto requiere una toma de decisiones manual.
6. Haz clic en Editar | Selección | Hacer máscara. Se abrirá una nueva imagen con el soma en círculos segmentado del resto de la imagen. Esto creará un archivo de máscara soma.
7. Sin mover la región dibujada, haga clic en el encabezado del archivo de máscara original.
8. Haz clic en Editar | Rellene para rellenar el soma en círculos de modo que solo queden las neuritas de la máscara.
9. Una vez que se obtengan los archivos de neurita y máscara separados, guarde ambos archivos de máscara.
10. Abra "neurite_2D_network" en Matlab.
11. En MATLAB, desplácese hasta el directorio con todos los datos de análisis.
12. Cambie la ruta "nombre de máscara" por el nombre de la máscara de neurita, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. Cambie el "csv_file_name" a donde se encuentra fluorescent_traces.csv archivo, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
14. Haga clic en Ejecutar para esqueletizar el archivo de máscara de neurita. Esto crea una versión esqueletizada del archivo de máscara de neurita y lo deposita como un archivo CSV en la carpeta maskfiles.
15. A continuación, genere un archivo CSV para el soma. Abra "CSV_mask_creator.m" en Matlab.
16. Coloque la ruta para el "nombre de la máscara" al nombre de la máscara soma, es decir, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Cambie el "writematrix" al nombre de archivo csv que se creará, es decir, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. Haga clic en Ejecutar. Esto crea el nuevo archivo de VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Repita la versión 6.14 para cada archivo de máscara.

7. Configuración de RStudio

1. Abra Rstudio y abra ripleys_k_analysis. Archivo R.
2. Instale el paquete "spatstat" en RStudio yendo a Herramientas | Instale paquetes y escriba "spatstat" seguido de hacer clic en Instalar.
   NOTA: Esto solo debe realizarse una vez por instalación de Rstudio.
3. Ejecute el spatstat de biblioteca al comienzo de cada sesión.
4. Preste atención a dos variables principales en este caso: "neuron_mask" y "neuron_datapoints". Neuron Mask apunta al conjunto de archivos de máscara para ejecutar, es decir, archivos de máscara de soma".
   NOTA: Ejecute todos los archivos de máscara soma juntos, por separado de los archivos de máscara Neurite, y viceversa.
5. Lea en el .csv de los archivos de máscara para cada una de las neuronas a analizar.
6. Ejecute varios archivos a la vez copiando neuron_mask_n+1 adicionales. Esto permitirá agregar el análisis de Ripley juntos, utilizando el script descrito en la sección 8.
7. Ahora verifique la segunda variable, "neuron_datapoints".
8. Lea en el." X_fluorescent_traces.csv" generado por el programa de análisis (por características de todos los extracted_R archivo) con las posiciones x, y, t de los eventos exocíticos, así como el archivo específico de neurita de las posiciones x, y para la red 2D. Esto va en la posición de "neuron_datapoints".
9. En RStudio, seleccione el código | Ejecutar | de región Ejecute todo. Esto genera varias gráficas, incluidos los valores K de Ripley agrupados, así como las gráficas de densidad.
10. Guarde parcelas yendo a Exportar | Guardar imagen como | Seleccione el formato de imagen y el directorio adecuados, introduzca el nombre de archivo adecuado y, a continuación, haga clic en Guardar.
    NOTA: La función de trazado para los mapas de calor se llama en el script usando "plot(density(soma_data,0.4))". El número "0.4" aquí representa cuán suavizada debería ser la función de densidad. Se puede cambiar para ajustarse a los datos del usuario de una manera significativa, pero si se van a realizar comparaciones entre diferentes mapas de calor, el número debe ser el mismo entre ellos.
11. Exportar o guardar imagen desde Rstudio. Si un mapa de calor requiere una edición adicional, elija un tipo de archivo apropiado (SVG o EPS).

8. Análisis de Ripley

NOTA: El Ripleys_k_analysis. El archivo R también generó automáticamente los gráficos de valores k de Ripley. La ejecución de todo el script ejecutará automáticamente las funciones mencionadas a continuación, pero se incluye en detalle si se desea ejecutar cada parte del script individualmente o realizar cambios en el análisis.

1. Primero, ejecute la función de envolvente para cada celda. Esta función simuló la aleatoriedad espacial completa (CSR) para probar el valor K de Ripley del patrón de punto de evento exocítico en contra.
   Data_envelope_1 = sobre(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = sobre(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. A continuación, agrupo estos sobres y cree una estimación de la RSE para el grupo:
   Pool_csr = piscina(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   A continuación, ejecute la función K de Ripley para todos los puntos de datos.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)
3. Una vez completado, aglutine los valores K de Ripley y arranque sus intervalos de confianza con el siguiente comando:
   Grupo de datos = grupo(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Bootstrap con el siguiente comando:
   Final_Ripleys_K = varblock(diversión = Kest, Data_pool)
5. Trazar los datos.
6. Si se requiere una diferencia estadística dura, la prueba de permutación studentizada se incluye en el paquete spatstat para probar una diferencia entre grupos de patrones de puntos:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).

Resultados

Aquí se utilizó la GUI(Figura 2A)para analizar eventos exocíticos de tres neuronas que expresan VAMP2-pHluorin a 3 DIV utilizando microscopía TIRF (fluorescencia de reflexión interna total). Se aislaron las neuronas corticales E15.5, seguidas de la transfección con VAMP2-pHluorin y el recubrimiento utilizando los protocolos descritos en Winkle et al., 2016 y Viesselmann et al., 2011^11,12. La metodología de los parámetros de i...

Discusión

Al utilizar el software de detección y análisis exocítico, tenga en cuenta que el programa solo acepta la compresión sin pérdidas .tif archivos como entrada. Los archivos de imagen .tif pueden ser imágenes de escala de grises (un solo canal) de 8 bits, 16 bits o 32 bits. Otros formatos de imagen deben convertirse a uno de estos tipos antes de la entrada. Como referencia, los ejemplos utilizados aquí son imágenes en escala de grises de 16 bits.

Inherentes al proceso de detección automa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/