تحقيق فحص فعال للشظايا في منشأة XChem في Diamond Light Source

Summary

تصف هذه الورقة عملية XChem الكاملة لفحص الأجزاء القائمة على الكريستال ، بدءا من التقدم بطلب للوصول وجميع الخطوات اللاحقة لنشر البيانات.

Abstract

في اكتشاف الأدوية القائمة على الشظايا ، يتم اختبار مئات أو آلاف المركبات الأصغر من ~ 300 Da مقابل البروتين محل الاهتمام لتحديد الكيانات الكيميائية التي يمكن تطويرها إلى أدوية مرشحة قوية. نظرا لأن المركبات صغيرة ، فإن التفاعلات ضعيفة ، وبالتالي يجب أن تكون طريقة الفحص حساسة للغاية ؛ علاوة على ذلك ، تميل المعلومات الهيكلية إلى أن تكون حاسمة في تطوير هذه الضربات إلى مركبات تشبه الرصاص. لذلك ، كان علم بلورات البروتين دائما تقنية قياسية ذهبية ، ولكن تاريخيا كان من الصعب للغاية العثور على استخدام واسع النطاق كشاشة أساسية.

تم عرض تجارب XChem الأولية في عام 2014 ثم تمت تجربتها مع المتعاونين الأكاديميين والصناعيين للتحقق من صحة العملية. منذ ذلك الحين ، أدى جهد بحثي كبير ووقت شعاع كبير إلى تبسيط إعداد العينات ، وتطوير مكتبة أجزاء مع إمكانيات متابعة سريعة ، وأتمتة وتحسين قدرة خط شعاع I04-1 لجمع البيانات غير المراقب ، وتنفيذ أدوات جديدة لإدارة البيانات وتحليلها وتحديد النتائج.

XChem هي الآن منشأة لفحص شظايا البلورات على نطاق واسع ، ودعم عملية البلورات بأكملها إلى الترسيب ، ويمكن الوصول إليها للمستخدمين الأكاديميين والصناعيين في جميع أنحاء العالم. تم تطوير برنامج المستخدم الأكاديمي الذي تمت مراجعته من قبل الأقران بنشاط منذ عام 2016 ، لاستيعاب المشاريع من أوسع نطاق علمي ممكن ، بما في ذلك المشاريع الاستكشافية التي تم التحقق من صحتها جيدا. يتم تخصيص الوصول الأكاديمي من خلال دعوات نصف سنوية لتقديم مقترحات تمت مراجعتها من قبل النظراء ، ويتم ترتيب عمل الملكية من قبل مجموعة الاتصال الصناعية في Diamond. تم بالفعل تطبيق سير العمل هذا بشكل روتيني على أكثر من مائة هدف من مجالات علاجية متنوعة ، ويحدد بشكل فعال المجلدات الضعيفة (معدل إصابة 1٪ -30٪) ، وكلاهما بمثابة نقاط انطلاق عالية الجودة لتصميم المركب وتوفر معلومات هيكلية شاملة عن مواقع الربط. تجلت مرونة العملية من خلال الفحص المستمر لأهداف SARS-CoV-2 خلال جائحة COVID-19 ، بما في ذلك تحول لمدة 3 أسابيع للبروتياز الرئيسي.

Introduction

اكتشاف الأدوية القائمة على الشظايا (FBDD) هي استراتيجية مستخدمة على نطاق واسع لاكتشاف الرصاص ، ومنذ ظهورها قبل 25 عاما ، قدمت أربعة أدوية للاستخدام السريري وتم تطوير أكثر من 40 جزيئا إلى التجارب السريرية¹،^2،3. الشظايا هي كيانات كيميائية صغيرة عادة ما يكون وزنها الجزيئي 300 دا أو أقل. يتم اختيارها لتعقيدها الكيميائي المنخفض ، والتي توفر نقاط انطلاق جيدة لتطوير مثبطات عالية الكفاءة مع خصائص فيزيائية كيميائية ممتازة. حجمها يعني أنها تأخذ عينات من المشهد المرتبط للبروتينات بشكل أكثر شمولا من مكتبات المركبات الأكبر الشبيهة بالأدوية أو الرصاص ، وبالتالي تكشف أيضا عن النقاط الساخنة والمواقع الألوستيرية المفترضة. إلى جانب المعلومات الهيكلية ، توفر الشظايا خريطة مفصلة للتفاعلات الجزيئية المحتملة بين البروتين والرباط. ومع ذلك ، فإن الكشف الموثوق والتحقق من صحة تلك الكيانات ، التي تميل إلى الارتباط بشكل ضعيف بالبروتين المستهدف ، يتطلب مجموعة من طرق الفحص البيوفيزيائي القوية والحساسة مثل رنين البلازمون السطحي (SPR) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) ^4,5.

يعد علم البلورات بالأشعة السينية جزءا أساسيا من مجموعة أدوات FBDD: فهو حساس بما يكفي لتحديد المجلدات الضعيفة وينتج مباشرة معلومات هيكلية حول التفاعلات على المستوى الجزيئي. إنه مكمل لشاشات الفيزياء الحيوية الأخرى وعادة ما يكون ضروريا لتقدم ضربات الشظايا إلى مركبات الرصاص ؛ يتطلب أنظمة بلورية عالية الجودة ، مما يعني أن التبلور قابل للتكرار بدرجة كبيرة ، وتحيد البلورات بشكل مثالي إلى دقة أفضل من 2.8 Å.

تاريخيا ، كان من الصعب جدا استخدام علم البلورات كشاشة شظية أولية⁶،^{7،8 ،} سواء في الأوساط الأكاديمية أو في الصناعة. في المقابل ، حققت السنكروترونات تحسينات من حيث الحجم في الروبوتات والأتمتة⁹،10،11 وتكنولوجيا الكاشف 12،13 ، وجنبا إلى جنب مع قوة الحوسبة المتسارعة وخوارزميات معالجة البيانات¹⁴،¹⁵،¹⁶ ، يمكن قياس مجموعات بيانات الحيود الكاملة في ثوان وأعداد كبيرة منها غير مراقبة تماما ^، كما هو رائد في LillyCAT⁷ ولاحقا MASSIF^17,18 (مرفق إشعاع السنكروترون الأوروبي (ESRF)). وقد أدى ذلك إلى قيام السنكروترونات بتطوير منصات مبسطة للغاية لجعل فحص الأجزاء القائم على الكريستال كشاشة أساسية في متناول مجتمع واسع من المستخدمين (XChem at Diamond; كريستال دايركت في EMBL / ESRF¹⁹ ؛ BESSY في هيلمهولتز سنتروم برلين²⁰ ؛ FragMax في MaxIV²¹).

توثق هذه الورقة البروتوكولات التي تشكل منصة XChem لفحص الشظايا بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية ، من تحضير العينة إلى النتائج الهيكلية النهائية للضربات على غرار 3D. تطلب خط الأنابيب (الشكل 1) تطوير مناهج جديدة لتحديد البلورات²² ، والنقع²³ ، والحصاد 24 ، بالإضافة إلى برنامج إدارة البيانات 25 ونهج خوارزمي لتحديد الأجزاء ²⁶ التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المجتمع. يتم بيع تقنية حصاد البلورات الآن من قبل بائع (انظر جدول المواد) ، وقد سمح التوافر المفتوح للأدوات للسنكروترونات الأخرى بتكييفها لإنشاء منصات مكافئة²¹. تتناول المشاريع الجارية تحليل البيانات وإكمال النموذج ونشر البيانات من خلال منصة Fragalysis²⁷. يقع مختبر تحضير العينات بجوار خط الشعاع I04-1 ، مما يبسط الخدمات اللوجستية لنقل مئات العينات المجمدة إلى خط الشعاع ويسمح وقت الشعاع المخصص على I04-1 بردود فعل سريعة بالأشعة السينية لتوجيه الحملة.

XChem هو جزء لا يتجزأ من برنامج مستخدم Diamond ، مع مكالمتين في السنة (أوائل أبريل وأكتوبر). تم تنقيح عملية مراجعة النظراء بالتشاور مع خبراء في اكتشاف الأدوية من الأوساط الأكاديمية والصناعة. إلى جانب حالة علمية قوية ، تتطلب عملية الاقتراح²⁸ من المتقدمين إجراء تقييم ذاتي ليس فقط لجاهزية النظام البلوري ، ولكن أيضا خبرتهم في الأساليب البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية المتعامدة والقدرة على التقدم في نتائج الفحص من خلال كيمياء المتابعة. كما تطورت طرق الوصول لاستيعاب مجتمع المستخدمين متعدد التخصصات:

المستوى 1 (مشروع واحد ) مخصص للمشاريع في المرحلة الاستكشافية ولا يلزم وضع أدوات التحقق من صحة النتائج (أدوات الفيزياء الحيوية أو الكيمياء الحيوية) واستراتيجيات المتابعة. في حالة قبوله ، يتم منح المشروع عددا أقل من تحولات وقت الحزمة ، وهو ما يكفي لإثبات المفهوم.

المستوى 2 (مشروع واحد) مخصص للمشاريع التي تم التحقق من صحتها جيدا ويتطلب وجود أدوات نهائية واستراتيجيات متابعة. في حالة قبوله ، يتم تخصيص وقت شعاع كاف للمشروع لحملة فحص شظايا كاملة. يجب الانتهاء من المشاريع الفردية (المستوى 1 أو المستوى 2) في غضون 6 أشهر من فترة التخصيص (إما من أبريل إلى سبتمبر أو من أكتوبر إلى مارس).

مجموعة تخصيص الكتلة (BAG) مخصصة لاتحادات من المجموعات والمشاريع ، حيث توجد عملية قوية لاختيار الأهداف وتحديد الأولويات داخل BAG ، إلى جانب خط أنابيب متابعة واضح. يجب أن يكون لدى BAGs خبير واحد على الأقل مدرب بالكامل من XChem (مستخدم متميز) ، والذي ينسق أنشطتهم مع موظفي Diamond ويدرب أعضاء BAG. يتم تحديد العدد المخصص لتحولات وقت الحزمة من خلال عدد المشاريع القوية علميا في BAG ويتم إعادة تقييمها لكل فترة تخصيص بناء على تقرير BAG. الوصول متاح لمدة 2 سنوات.

تنقسم تجربة XChem إلى ثلاث مراحل ، مع نقطة قرار لكل منها: اختبار تحمل المذيبات ، والشاشة المسبقة ، والشاشة الرئيسية (الشكل 2). يساعد اختبار تحمل المذيبات في تحديد معلمات النقع ، وكمية المذيب (DMSO ، أو جلايكول الإيثيلين ، أو غيرها من المواد الواقية من البرودة إذا لزم الأمر) التي يمكن للنظام البلوري تحملها وإلى متى. تتراوح تركيزات المذيبات عادة من 5٪ -30٪ خلال نقطتين زمنيتين على الأقل. يتم جمع بيانات الحيود ومقارنتها بحيود القاعدة للنظام البلوري ؛ سيحدد هذا معلمات النقع للمرحلة التالية. بالنسبة للفحص المسبق ، يتم نقع 100-150 مركبا باستخدام الشروط المحددة في اختبار المذيب ، والغرض منه هو التأكد من أن البلورات يمكنها تحمل المركبات في تلك الظروف. إذا لزم الأمر ، يتم إضافة مادة الحماية بالتبريد لاحقا إلى القطرات التي تحتوي بالفعل على الشظايا. معايير النجاح هي أن 80٪ أو أكثر من البلورات تعيش بشكل جيد بما يكفي لإنتاج بيانات حيود ذات جودة جيدة ومتسقة. إذا فشل ذلك ، فعادة ما تتم مراجعة ظروف النقع عن طريق تغيير وقت النقع أو تركيز المذيبات. بعد الفحص المسبق الناجح ، يمكن إعداد بقية المركبات المختارة للتجربة باستخدام المعلمات النهائية.

تم تصميم مكتبة DSI المتوازنة (انظر جدول المواد) عن قصد للسماح بالتقدم السريع للمتابعة باستخدام الكيمياء^{المتوازنة 29} وكانت مكتبة العمود الفقري للمنشأة. وهي متاحة للمستخدمين بتركيز 500 mM في DMSO. يمكن للمستخدمين الأكاديميين أيضا الوصول إلى المكتبات الأخرى التي يوفرها المتعاونون (أكثر من 2000 مركب في المجموع) بتركيزات 100-500 mM في DMSO (يمكن العثور على قائمة كاملة على موقع الويب²⁸). يتوفر الكثير من المجموعة الإجمالية أيضا في جلايكول الإيثيلين ، للأنظمة البلورية التي لا تتسامح مع DMSO. يمكن للمستخدمين أيضا إحضار مكتباتهم الخاصة ، بشرط أن تكون في لوحات متوافقة مع نظام معالجة السوائل الصوتية (انظر جدول المواد).

بالنسبة لجميع الخطوات الثلاث للتجربة (توصيف المذيبات ، ما قبل الشاشة أو ملء الشاشة) ، تكون إجراءات تحضير العينة التالية متطابقة (الشكل 3): اختيار موقع توزيع المركب من خلال التصوير واستهداف قطرات التبلور باستخدام TeXRank²² ؛ الاستغناء عن قطرات باستخدام نظام توزيع السائل الصوتي لكل من المذيبات والمركبات²³ ؛ الحصاد الفعال للبلورات باستخدام ناقل الحركة^{البلوري 24} ؛ وتحميل معلومات العينة في قاعدة بيانات خط الشعاع (ISPyB). الواجهة الحالية لتصميم التجربة وتنفيذها هي تطبيق قائم على Excel (SoakDB) ، والذي ينشئ ملفات الإدخال اللازمة للمعدات المختلفة للنظام الأساسي ، ويتتبع ويسجل جميع النتائج في قاعدة بيانات SQLite. تستخدم ماسحات الباركود في مراحل مختلفة طوال العملية للمساعدة في تتبع العينات ويتم إضافة هذه البيانات إلى قاعدة البيانات.

يتم جمع بيانات الحيود في الوضع غير المراقب باستخدام وقت شعاع مخصص على خط الشعاع I04-1. يتوفر وضعان للتوسيط ، وهما¹⁷ وضعا بصريا وأشعة سينية. بالنسبة للبلورات على شكل إبرة وقضيب ، ينصح بتوسيط الأشعة السينية ، في حين أن البلورات المكتنزة تدعم بشكل عام الوضع البصري ، وهو أسرع ، وبالتالي يسمح بجمع المزيد من العينات في وقت الحزمة المخصص. اعتمادا على دقة البلورات (التي تم إنشاؤها قبل دخول النظام الأساسي) ، يمكن أن يكون جمع البيانات إما 60 ثانية أو 15 ثانية من إجمالي التعرض. عادة ما يعلم جمع البيانات أثناء مرحلة اختبار المذيبات المجموعة التي ستعمل بشكل أفضل مع أداء خط الشعاع I04-1.

تتم إدارة الحجم الكبير من تحليل البيانات من خلال XChemExplorer (XCE) ²⁵ ، والذي يمكن استخدامه أيضا لبدء خطوة تحديد النتيجة باستخدام PanDDA²⁶. XCE هي أداة لإدارة البيانات وسير العمل تدعم التحليل واسع النطاق لهياكل البروتين ليجند (الشكل 4) ؛ يقرأ أيا من نتائج المعالجة التلقائية من البيانات التي تم جمعها في Diamond Light Source (DIALS¹⁶ و Xia2¹⁴ و AutoPROC³⁰ و STARANISO³¹) ويختار تلقائيا إحدى النتائج بناء على جودة البيانات والتشابه مع نموذج مرجعي. من المهم أن يكون النموذج ممثلا للنظام البلوري المستخدم لفحص XChem ، ويجب أن يشمل جميع المياه أو جزيئات المذيبات الأخرى ، بالإضافة إلى جميع العوامل المساعدة ، والروابط ، والمطابقات البديلة المرئية في البلورات المنقوعة بالمذيب فقط. ستؤثر جودة هذا النموذج المرجعي بشكل مباشر على مقدار العمل المطلوب خلال مرحلة بناء النموذج وصقله. يستخدم PanDDA لتحليل جميع البيانات وتحديد مواقع الربط. يقوم بمحاذاة الهياكل إلى بنية مرجعية ، ويحسب الخرائط الإحصائية ، ويحدد الأحداث ، ويحسب خرائط الأحداث^26,32. في نموذج PanDDA ، ليس من الضروري ولا من المستحسن بناء النموذج البلوري الكامل. ما يجب نمذجته هو فقط وجهة نظر البروتين حيث يتم ربط جزء (نموذج الحالة المقيدة) ، لذلك يجب أن يكون التركيز فقط على بناء الربيطة والمخلفات المحيطة / جزيئات المذيبات وفقا لخريطة الحدث³².

Protocol

1. تقديم مقترح المشروع

1. محتوى الاقتراح: نظرا لأن برنامج XChem مكتظ به ، فإن المعلومات الشاملة والكاملة في الاقتراح أمر بالغ الأهمية لاجتياز مراجعة الأقران.
   1. اصنع القضية! عرض أهمية الهدف ووضعه في السياق الأوسع.
      1. توضيح الاستراتيجية بعد حملة فحص الشظايا: الطرق المتعامدة المعمول بها للتحقق من صحة النتائج وكيفية تقدمها. قم بترتيب التعاون ، إذا لزم الأمر.
      2. نظرا لجزء تحليل المختبر والبيانات المكثف ، يوصى بشدة بتعيين عالم بلورات متمرس مسبقا.
      3. يعد نظام الكريستال القوي أمرا أساسيا للقضاء على الاختلاف التقني ويجب على المستخدمين معالجة هذه النقاط الأساسية.
         1. تأكد من أن ظروف التبلور تنتج قطرات قابلة للتكرار مع بلورات ذات جودة حيود مماثلة في ألواح مناسبة للاستخدام على المنصة بحجم خزان يبلغ 30 ميكرولتر (أو أقل) وحجم قطرة بين 200-500 نانولتر. من الناحية المثالية ، سيكون لأكثر من 50٪ من القطرات في اللوحة بلورات بحجم 35 ميكرومتر^{على الأقل 33}.
         2. ضمان جودة حيود متسقة للبلورات (2.6 Å أو أفضل).
         3. تحقق من مدى ملاءمة النظام البلوري لفحص الشظايا ، بما في ذلك تعبئة الكريستال وإمكانية الوصول إلى المواقع المعروفة. غالبا ما تكون الأدلة السابقة على وجود جزيء مرتبط في تلك المواقع مطمئنة.

2. التحضير للزيارة

1. نقل بروتوكولات التبلور للتبلور في الموقع.
   1. توفير 2 × 50 مل من محلول الخزان ، جاهز للاستخدام.
   2. توفير محلول البروتين بالتركيز اللازم للتبلور ، جاهز للاستخدام في حصص من 30-50 ميكرولتر.
   3. توفير 10 مل من محلول عازلة البروتين.
   4. توفير مخزون البذور (حتى لو لم تكن هناك حاجة في بروتوكول التبلور).
      ملاحظة: يفضل البذر استنساخ التبلور ويسرع وقت التنوي³³.
   5. أكمل نموذج معلومات التبلور المتاح على موقع XChem²⁸.
   6. قدم معلومات التخزين في نموذج الشحن المتاح على موقع اكس كيم²⁸.
2. قم بتثبيت NoMachine وقم بإعداد سطح مكتب بعيد إلى Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
3. إنشاء ونقل نموذج مرجعي جيد ، بالتشاور مع خبير علم البلورات أو موظفي دعم XChem.

3. تجربة فحص الشظايا

1. تحديد موقع توزيع الكمبوند.
   1. لوحات التبلور التصويرية.
      1. قم بتصوير جميع الألواح البلورية (انظر جدول المواد) المطلوبة للتجربة في أجهزة تصوير الألواح البلورية (انظر جدول المواد). باستخدام برنامج التصوير ، قم بإنشاء اسم (أسماء) اللوحة في الدليل الصحيح لنوع اللوحة بالتنسيق التالي رقم Number_Plate الاقتراح.
      2. اطبع الرموز الشريطية (انقر بزر الماوس الأيمن على اسم اللوحة واختر من القائمة) ، وضعها على الجانب الآخر من اللوحة من أحرف الصف ، ضع اللوحة (اللوحات) في منفذ التحميل مع توجيه الرمز الشريطي بعيدا عن المستخدم.
      3. استخدم برنامج التحكم في التصوير ، وامسح منفذ التحميل ضوئيا ، وانقر بزر الماوس الأيمن على اللوحات ، ثم حدد لوحات الصور.
      4. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بإزالة اللوحات من التصوير.
   2. اختيار البلورات وموقع المجمع
      ملاحظة: تتم معالجة صور قطرات التبلور داخل خط أنابيب لويجي باستخدام خوارزمية TexRank المستندة إلى النصوص Ranker لترتيب القطرات حسب الوجود المحتمل للبلورات²². يستغرق هذا حوالي 10 دقائق وستكون الصور متاحة بعد ذلك في TexRank.
      1. افتح TeXRank من جهاز كمبيوتر وحدد درج الكريستال إما من القائمة الموجودة أسفل اليمين أو عن طريق كتابة الرمز الشريطي في المربع أعلى اليسار.
      2. حدد تنسيق التصوير الصحيح وعرض البئر الفردي. تحرك من خلال صور الإسقاط وعندما يكون هناك بلورة مناسبة للاستخدام في تجربة ما ، انقر بزر الماوس الأيمن بعيدا عن البلورة ولكن داخل القطرة - الهدف هو استهداف مكان السقوط لإضافة مذيب / مركبات ، لذلك لا تريد أن تضرب البلورة مباشرة²³.
      3. استمر خلال اللوحة بأكملها وبمجرد الانتهاء ، حدد زر Echo 1 Target ؛ احفظ في دليل الأهداف البلورية تحت الزيارة ذات الصلة. لا تقم بتغيير اسم الملف.
      4. كرر لأي لوحات إضافية.
2. الاستغناء المركب
   1. إنشاء ملفات للتوزيع المركب
      1. في SoakDB ، أدخل اختيار المكتبة أو معلومات المذيبات في المكتبة / جدول المذيبات.
      2. أدخل حجم الإسقاط والتحميل في قائمة البلورات المستهدفة.
      3. توليد الدفعات المطلوبة.
      4. أدخل معلمات النقع. انقر فوق حساب ثم على زر تصدير معلق . بالنسبة للمذيب ، أضف التركيزات المختلفة إلى الجدول. يؤدي هذا إلى إنشاء الملفات لاستخدامها في الموزع الصوتي.
      5. في حالة استخدام مادة واقية من البرودة ، أدخل التركيز وقم بإنشاء الملفات بنفس الطريقة.
   2. توزيع المحاليل باستخدام الموزع الصوتي (انظر جدول المواد)
      1. خذ لوحة المصدر (المركبات أو المذيبات / الواقية من التبريد) وقم بتدوير اللوحة في جهاز الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 × جم.
      2. في حالة توزيع مذيب أو واقي من البرودة ، ماصة 30 ميكرولتر في البئر ذات الصلة على لوحة 384PP ؛ مع تغطية فيلم microseal ثم أجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
      3. افتح البرنامج ؛ حدد جديد واختر لوحة بئر المصدر الصحيحة (384PP أو 384LDV أو 1536LDV) وفئة السائل (DMSO أو CP أو BP أو GP). تأكد من تحديد نوع اللوحة الصحيح كلوحة الوجهة. ثم حدد المربع مخصص وتابع.
      4. حدد استيراد واختر الملف الدفعي ذي الصلة. أكمل خطوات الاستيراد كما هو مطلوب من قبل البرنامج.
      5. استخدم خرائط اللوحات للتحقق من الحل للتوزيع ومواقع الوجهة.
      6. قم بتشغيل البروتوكول ، باتباع المطالبات فور ظهورها. سيتم توزيع المحلول (المحلولات) من لوحة المصدر في قطرات الكريستال المختارة.
      7. تخزين لوحة في الحاضنة للوقت المطلوب.
         ملاحظة: يتم تحديد هذه المعلمات في خطوة توصيف المذيبات ، وستكون درجة الحرارة إما 4 °C أو 20 °C اعتمادا على درجة حرارة نمو البلورة والأوقات عادة ما بين 1 ساعة و 3 ساعات.
3. حصاد البلورات باستخدام جهاز حصاد البلورات شبه الأوتوماتيكي (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: إذا كانت الحماية من التبريد مطلوبة، كرر الخطوة 3.2.2 لإضافة محاليل واقية من التبريد على قطرات البلورة قبل حصاد العينات.
   1. التحضير للحصاد
      1. قم بإعداد الملفات المطلوبة للحصاد في SoakDB. عندما يطلب منك ذلك ، تأكد من اكتمال عمليات النقع واكتمال الدفعات.
      2. امسح عدد كرات الصولجان المطلوبة للتجربة تحت رقم الاقتراح الصحيح.
      3. حدد صينية من الحلقات ذات الحجم المناسب للبلورات (35 ميكرومتر أو 75 ميكرومتر أو 150 ميكرومتر). الأهم من ذلك ، اختر حجم الحلقة الذي يطابق حجم البلورة قدر الإمكان لتمكين التمركز التلقائي على خط الشعاع ليكون أكثر دقة ، وتحسين جودة البيانات عن طريق تقليل الخلفية والقضاء على الحاجة إلى الحماية من التبريد.
      4. افتح البرنامج ذي الصلة وافتح علامة تبويب سير العمل.
      5. امسح كرات الصولجان ضوئيا في البرنامج وانتقل مرة أخرى إلى أعلى القائمة ، مع تمييز القرص الأول.
      6. ضع كرات الصولجان في ديوار رغوي وقم بتبريدها بالنيتروجين السائل.
      7. أختر استيراد ملف من SoakDB وحدد الدفعة المراد حصادها ؛ تحقق لمعرفة ما إذا كانت الدفعة مخصصة للحامل الأيسر. تظهر قائمة عمل.
      8. خذ اللوحة البلورية ، وأزل الختم ، وضعها في الحامل الأيسر ؛ انقل اللوحة إلى موضع وقوف السيارات.
   2. حصاد البلورات
      1. كن مرتاحا واضغط على زر بدء سير العمل (الشاشة عبارة عن شاشة تعمل باللمس) للانتقال إلى أول موضع بئر محدد.
      2. إذا نجت البلورة ، فقم بتركيب البلورة في الحلقة واغرقها في النيتروجين السائل وضعها في الموضع 1 في القرص الأول في القائمة.
      3. حدد الوصف المناسب للبلورة من الواجهة (عادي ، ذائب ، متصدع ، جيلي ، أو ملون).
      4. إذا كان الانخفاض عبارة عن نقع مركب ، فقم بتسجيل وصف الحالة المركبة (واضح ، بلوري ، مترسب ، توزيع سيئ ، أو فصل طوري).
      5. إذا تم تركيب البلورة بنجاح ، فحدد مثبت وإلا حدد فشل.
      6. ستنتقل اللوحة إلى البئر المحدد التالي. املأ جميع مواضع القرص على التوالي (لا تترك فجوة إذا فشلت البلورة). استمر حتى نهاية سير العمل.
      7. في نهاية سير العمل ، قم بتحميل أي دفعات إضافية واستمر في ملء كرات الصولجان بالترتيب. ليست هناك حاجة لبدء عفريت جديد لمجموعة جديدة.
   3. تتبع الباركود لنتائج الحصاد
      1. بمجرد حصاد جميع البلورات ، خذ كرات الصولجان إلى ماسح الباركود ، ضع واحدة تلو الأخرى في الحامل لمسح الرموز الشريطية للقرص وتثبيتها.
      2. عند الانتهاء من ذلك ، ضع الأغطية على كرات الصولجان وقم بتخزينها في ديوار تخزين النيتروجين السائل.
      3. قم بتحميل ملف الإخراج في واجهة SoakDB.
   4. تسجيل معلومات العينة في ISPyB³⁴،^35،36
      1. تحميل عينة البيانات إلى ISPyB
         1. في SoakDB ، قم بتحديث تحديث زيارة خط الشعاع ل ISPyB وانقر فوق تصدير لإنشاء الملف لتحميله إلى ISPyB.
         2. فتح المعجون. قم بتسجيل الدخول وتصفح الدليل التالي dls / labxchem / data / year / lbXXXX-1 / processing / lab36 / ispyb.
         3. قم بتشغيل البرنامج النصي csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
            ملاحظة: يتم الآن تحميل العينات في ISPyB.
      2. سجل موقع القرص واستراتيجية جمع البيانات.
         1. سجل التفاصيل وموقع كرات الصولجان
            ملاحظة: من المهم تسجيل تفاصيل وموقع كرات الصولجان حتى يمكن تحديد موقعها وتحميلها على خط الشعاع.
            1. في SoakDB ، افتح علامة التبويب الثانية المسماة Pucks.
            2. املأ التفاصيل في المربعات الموجودة على طول الجزء العلوي. على وجه التحديد ، موقع كرات الصولجان (تخزين dewar والعصي) ، ومعلمات جمع البيانات ، بما في ذلك القرار المتوقع ورقم الاقتراح.
            3. انقر فوق الزر "حفظ " وستظهر قائمة بجميع كرات الصولجان في الجدول. انسخ كرات الصولجان المملوءة مؤخرا.
            4. افتح جدول بيانات قائمة انتظار XChem (اختصار على سطح المكتب) والصق المعلومات. املأ أي معلومات إضافية ذات صلة.

4. جمع البيانات

ملاحظة: يتم جمع البيانات في وضع غير مراقب وإدارتها بواسطة فريق XChem/beamline.

1. جمع العينات غير المركزة.
   ملاحظة: تكون هذه مطلوبة عند وجود مشكلات في جمع البيانات لعينات معينة ، على الأرجح بسبب عدم توسيط المسامير بشكل صحيح.
   1. انظر إلى طريقة عرض مغير العينة في ISPyB ، وحدد الترتيب حسب AP لتصنيف العينات حسب الدقة المعالجة تلقائيا في تدرج اللون من الأخضر إلى الأحمر.
   2. انقر على العينات للتحقق من وجود أي عينات حمراء أو صفراء.
      ملاحظة: سيؤدي هذا إلى إظهار جمع البيانات.
   3. تحقق من لقطات الكريستال لمعرفة ما إذا كانت البلورة قد توسيطت.
   4. قم بتدوين جميع أولئك الذين لم يتمركزوا وأرسلهم إلى جهة الاتصال المحلية التي ستتذكر العينات المفقودة.

5. تحليل البيانات

1. استرجاع وتحليل نتائج المعالجة التلقائية ل Diamond من خلال XChemExplorer (XCE) ²⁵.
   1. في المحطة الطرفية ، انتقل إلى المجلد الفرعي المعالجة: cd / dls / labxchem / data / year / visit / processing أو ل XChem BAGs: cd / dls / labxchem / data / year / visit / processing / project / processing /.
   2. استخدم الاسم المستعار xce لفتح XChemExplorer.
   3. حدد الزر تحديث الجداول من مصدر البيانات .
   4. ضمن علامة التبويب نظرة عامة ، يوجد ملخص للبيانات التجريبية. أضف فئات إضافية باستخدام الخيار تحديد أعمدة لإظهارها في قائمة مصدر البيانات .
   5. ضمن علامة التبويب الإعدادات ، حدد دليل جمع البيانات (/ dls / i04-1 / data / year / visit /).
   6. افتح علامة التبويب مجموعات البيانات ، واختر الهدف من القائمة المنسدلة تحديد الهدف ، وحدد Get نتائج جديدة من المعالجة التلقائية من مجموعات البيانات القائمة المنسدلة ، وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: ستقوم XCE الآن بتحليل زيارة جمع البيانات للحصول على نتائج المعالجة التلقائية. قد يستغرق هذا بعض الوقت في المرة الأولى التي يتم تشغيله فيها ، اعتمادا على عدد مجموعات البيانات / الدلائل التي يتم تحليلها.
   7. تحقق من تناسق البيانات وجودتها عن طريق التحقق من الدقة ومجموعة المسافة و Rmerge. استبعاد البيانات الأقل من دقة 2.8 Å.
      ملاحظة: بشكل افتراضي ، يعتمد اختيار مجموعة البيانات على درجة محسوبة من I / sigI ، والاكتمال وعدد الانعكاسات الفريدة ولكن يمكن تحديد نتائج المعالجة الأخرى للاستخدام²⁵.
   8. لتحديد نتيجة معالجة مختلفة لمجموعات البيانات الفردية ، إذا كنت تفضل ذلك ، انقر فوق نموذج معرف واختر البرنامج / التشغيل المطلوب. لتغيير خط أنابيب المعالجة لكل مجموعات البيانات، حدد تحرير التفضيلات من قائمة التفضيلات وقم بتغيير آلية تحديد مجموعة البيانات.
   9. إذا لزم الأمر، أعد معالجة البيانات من خلال ISPyB³⁷.
   10. إذا لم تكن هناك بيانات معالجة لعينة مقبولة، فضع علامة على أنها فشل في الاستبعاد من التحليل الإضافي.
   11. عند الانتهاء ، انقر فوق تحديث الجداول من مصدر البيانات لإضافة البيانات إلى الجداول اللاحقة.
2. حساب الخرائط الأولية باستخدام DIMPLE³⁸.
   1. افتح علامة التبويب الخرائط ، واختر النموذج المرجعي من القائمة المنسدلة وحدد مجموعات البيانات المطلوبة متبوعة بتشغيل DIMPLE على ملفات MTZ المحددة.
   2. تدير XCE العديد من وظائف DIMPLE في وقت واحد على مجموعة Diamond. ابحث عن حالة هذه المهام ضمن عمود حالة الدمل وقم بالتحديث باستخدام زر تحديث الجداول من مصدر البيانات أو باستخدام الأمر qstat في Linux.
   3. بمجرد الانتهاء ، تحقق مما إذا كانت قيم Dimple Rcryst و Dimple Rfree و Space Group مقبولة. إذا لزم الأمر (Rfree عالية / مجموعة مساحة خاطئة / فرق كبير في حجم خلية الوحدة) ، قم بتغيير نتائج المعالجة التلقائية كما هو موضح سابقا وكرر إنشاء الخريطة لمجموعات البيانات هذه.
3. توليد قيود الليجند باستخدام الدرجة³⁹ أو AceDRG⁴⁰ أو phenix.eLBOW⁴¹.
   1. حدد البرنامج المطلوب (التفضيلات ، تحرير التفضيلات ، برنامج إنشاء القيود) ثم حدد مجموعات البيانات ضمن علامة التبويب الخرائط متبوعة بتشغيل ملف إنشاء CIF / PDB / PNG للمركبات المحددة من القائمة المنسدلة Maps & Restraints .
   2. قم بتحديث حالة هذه المهام الموجودة ضمن عمود الحالة المركبة باستخدام الزر تحديث الجداول من مصدر البيانات .
4. بناء نموذج الحالة الأرضية (Pre-run)
   ملاحظة: يمثل مصطلح نموذج الحالة الأرضية بنية البروتين في شكله الخالي من الرباط ، كما لوحظ في 100 مجموعة بيانات (يتم اختيار هذا الرقم بشكل تعسفي). نظرا لاستخدام نموذج الحالة الأرضية كمرجع لبناء حالة مرتبطة بالليجند ، فمن الأهمية بمكان بناء نموذج دقيق للحالة الأرضية ، بما في ذلك جميع جزيئات المذيبات والماء ، قبل تحليل حملة فحص الشظايا بأكملها. في هذه الخطوة ، يتم استخدام أول مائة مجموعة بيانات عالية الدقة تم تمييزها بواسطة PanDDA على أنها تفتقر إلى الأحداث المثيرة للاهتمام (وبالتالي من المحتمل أن تكون خالية من الروابط) لإنشاء خريطة متوسط الحالة الأرضية بينما يتم تحديد مجموعة البيانات ذات أقل R_free للتحسين. خريطة متوسط الحالة الأرضية ليست خريطة بلورية ، ومع ذلك ، من المهم استخدام هذه الخريطة فقط لبناء نموذج الحالة الأرضية.
   1. افتح علامة التبويب PanDDAs وقم بتحديث الجداول من مصدر البيانات إذا لزم الأمر.
   2. حدد دليل المخرجات (/ dls / labxchem / data / year / visit / processing / analysis / panddas).
   3. حدد التشغيل المسبق لنموذج الحالة الأرضية وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: يجب استبعاد مجموعات البيانات ذات المجموعات الفضائية العالية وغير المتوقعة من التحليل تلقائيا.
   4. لاستبعاد مجموعات البيانات ذات مجموعات المساحات العالية Rfree وغير المتوقعة يدويا، حدد تجاهل تماما.
   5. تحقق من حالة مهمة التشغيل المسبق باستخدام qstat في نافذة المحطة الطرفية.
   6. بمجرد الانتهاء ، حدد إنشاء نموذج الحالة الأرضية وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: سيؤدي هذا إلى فتح Coot باستخدام خريطة PanDDA المتوسطة وخرائط نموذج مرجعي / 2Fo-FC / Fo-Fc من أفضل مجموعة بيانات عالية الجودة لإعادة النمذجة والتحسين باستخدام Coot. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام خريطة متوسط PanDDA فقط للنمذجة.
5. تحديد النتائج باستخدام PanDDA²⁶
   1. تحليل بانددا
      ملاحظة: قد يستغرق الأمر بعض الوقت للتشغيل على الكتلة إذا كان هناك الكثير من مجموعات البيانات ، وخلية الوحدة كبيرة ، وهناك نسخ متعددة من البروتين في الوحدة غير المتماثلة.
      1. كرر الخطوات الموضحة مسبقا لتحليل نتائج المعالجة التلقائية ل DLS وحساب الخريطة الأولي. لحساب الخريطة، استخدم نموذج الحالة الأساسية كمرجع: تحديث قائمة الملفات المرجعية > تعيين مرجع جديد وإنشاء قيود ليجند حسب الضرورة للبيانات الجديدة (الخطوات 6.1-6.3).
      2. ضمن علامة التبويب PanDDAs ، تأكد من تعيين دليل الإخراج كما كان من قبل وتشغيل pandda.analyse من القائمة المنسدلة Hit Identification .
      3. تحقق من حالة المهمة في محطة Linux باستخدام الأمر qstat.
   2. فحص PanDDA - فحص / بناء أحداث الربط
      1. ضمن علامة التبويب PanDDAs في XCE ، قم بتشغيل pandda.inspect من القائمة المنسدلة Hit Identification لفتح Coot⁴² باستخدام لوحة تحكم PanDDA.
         ملاحظة: توفر لوحة التحكم pandda.inspect ملخصا لإحصائيات PanDDA وتسمح للمستخدمين بالتنقل عبر أحداث / مواقع الربط. يتم أيضا إنشاء ملف HTML ملخص للنتائج ويمكن تحديثه أثناء الفحص عن طريق تحديد تحديث HTML.
      2. لنمذجة ليجند ، انقر فوق دمج Ligand مع Model و Save Model قبل الانتقال إلى حدث آخر لتجنب فقدان أي تغييرات على نموذج الحالة المقيدة.
         ملاحظة: سيتم تصدير الطرز التي تم تحديثها وحفظها فقط للتحسين في مرحلة لاحقة.
      3. استخدم الحقل تعليق الحدث لإضافة تعليق توضيحي إلى حدث الربط وتسجيل معلومات الموقع لإضافة تعليقات توضيحية إلى مواقع الربط.
      4. متوسط التحميل وخرائط 2mFo-DFc (من DIMPLE) للمقارنة مع خريطة الحدث والطراز.
         1. بمجرد نمذجة جميع الروابط القابلة للحياة ودمجها وحفظها بناء على خريطة الحدث ، أغلق pandda.inspect.
   3. تصدير وصقل PanDDA
      ملاحظة: يتم تصدير نماذج فحص PanDDA التالية مرة أخرى إلى دليل المشروع ويتم إطلاق جولة أولية من التحسين. يوجد حاليا مساران متاحان للقيام بذلك ضمن علامة التبويب PANDDAs في XCE.
      1. تصدير نماذج PANDDA الجديدة / الكل / المحددة يولد مجموعة من النماذج المقيدة وغير المنضمة للتحسين ويولد معلمات تقييد الإشغال ل Refmac⁴³.
         ملاحظة: سيتم استخدام نموذج المجموعة للتحسين ولكن سيتم تحديث نموذج الحالة المقيدة فقط في Coot وإيداعه في PDB. يتم استخدام خط الأنابيب هذا بشكل أفضل لمجموعات البيانات ذات الأجزاء المنخفضة من الإشغال والتغييرات الكبيرة في نموذج البروتين.
      2. تحسين نماذج الحالة المقيدة الجديدة / ALL باستخدام BUSTER يعمل على تحسين الحالة المقيدة فقط باستخدام Buster⁴⁴.
         ملاحظة: يتم استخدام هذا بشكل أفضل مع روابط / مجموعات بيانات عالية الإشغال مع الحد الأدنى من التغييرات في نموذج البروتين.
6. تحسين النتائج (ستكون جميع مجموعات البيانات المحددة للتحسين مرئية الآن في علامة التبويب تحسين). حدد فتح COOT - BUSTER Refinement أو Open COOT - REFMAC Refinement من القائمة المنسدلة Refinement لفتح Coot باستخدام لوحة تحكم XCE Refinement.
   1. حدد حالة العينات المراد تنقيحها من القائمة المنسدلة تحديد العينات (عادة 3 - قيد التحسين) وانقر فوق GO.
      ملاحظة: توفر لوحة تحكم XCE ملخصا لعدد مجموعات البيانات لتلك الفئة وتسمح بالتنقل بين مجموعات البيانات مع توفير ملخص لإحصائيات التحسين.
   2. قم بالتعليق على ثقة ligand في لوحة تحكم XCE: 0 - لا يوجد ليجند - الجزء غير مقيد ؛ 1 - ثقة منخفضة - من المحتمل أن يكون الجزء مرتبطا ولكنه غير مقنع بشكل خاص ؛ 2 - الليجند الصحيح ، الكثافة الضعيفة - المستخدم واثق من أن الجزء مرتبط ولكنه إشغال منخفض / هناك بعض المشكلات في الخرائط ؛ 3 - كثافة واضحة ، ليجند غير متوقع - تشير الخرائط بوضوح إلى ارتباط الرباط الذي لا يرتبط بالتركيب الكيميائي المقدم ؛ 4 - ثقة عالية - ليجند مرتبط بشكل لا لبس فيه.
   3. قم بإجراء أي تغييرات ضرورية على النموذج في هذه المرحلة وابدأ المزيد من التحسين باستخدام زر التحسين .
   4. استخدم زر إظهار قائمة مهام MolProbity للوصول إلى تحليل MolProbity ⁴⁵ الذي يتم تشغيله في جميع دورات التحسين.
   5. إذا لزم الأمر، أضف معلمات التحسين، على سبيل المثال، لعوامل درجة الحرارة متباينة الخواص أو البيانات المتوأمة أو تحسين الإشغال عن طريق تحديد زر معلمات التحسين .
      ملاحظة: يتم توفير إحصائيات معالجة البيانات أيضا في XCE ضمن علامة التبويب التحسين وإذا تم إجراء التحسين باستخدام خط أنابيب Buster ، يتم توفير تقارير Buster ، بما في ذلك تحليل MOGUL⁴⁶.
   6. قم بتغيير حالة مجموعة البيانات أثناء تقدمها من خلال التحسين في كل من نافذة XCE الرئيسية ضمن علامة التبويب تحسين أو في لوحة تحكم Coot XCE . عند الاقتناع بأن النموذج دقيق حول الربيطة ومناسب للمشاركة لمزيد من التحليل ، قم بتغيير الحالة إلى CompChem Ready. عند اكتمال التحسين ويكون النموذج جاهزا للتحميل إلى PDB ، قم بتغيير الحالة إلى ترسب جاهز.

6. إيداع البيانات

ملاحظة: يمكن إيداع جميع مجموعات البيانات من شاشة جزء ونموذج الحالة الأرضية المستخدم لإنشاء خرائط أحداث PanDDA في PDB باستخدام ترسبات المجموعة.

1. قم بتحويل جميع خرائط أحداث PanDDA إلى تنسيق MTZ عن طريق تشغيل Event Map ->SF من قائمة تحديد الضربات .
2. قم بتوفير بيانات تعريف إضافية مثل المؤلفين والأساليب عن طريق تحديد الترسيب > تحرير المعلومات. املأ جميع العناصر المطلوبة وانقر فوق حفظ في قاعدة البيانات ثم احفظ هذه المعلومات لترسيب نموذج الحالة الأرضية. قم بذلك بعد تغيير حالة النموذج إلى جاهز للترسب.
3. في علامة التبويب الترسيب ، حدد زر تحضير mmcif لإنشاء ملفات mmcif لعامل البنية لجميع مجموعات البيانات الجاهزة للترسيب . ستظهر الرسالة التالية في نافذة المحطة الطرفية عند اكتمال ذلك: الانتهاء من إعداد ملفات mmcif لترسيب wwPDB.
4. حدد الزر Copy mmcif لنسخ كل هذه الملفات إلى أرشيف قطران مضغوط واحد في دليل ترسيب المجموعة للزيارة.
5. اذهب إلى https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit ؛ تسجيل الدخول باستخدام اسم المستخدم: GroupTester وكلمة المرور: !2016RCSBPDB. قم بإنشاء جلسة وتحميل ملف ligand-bound.tar.bz2 من دليل ترسيب المجموعة.
6. بعد التقديم الناجح للهياكل المرتبطة بالليجند ، يتم إرسال بريد إلكتروني يحتوي على رموز PDB. حدد تحديث قاعدة البيانات برموز PDB من قائمة الترسيب ؛ انسخ المعلومات من هذا البريد الإلكتروني والصقها في النافذة المنبثقة وانقر فوق تحديث قاعدة البيانات لإضافة معرفات PDB.
7. لإيداع نموذج الحالة الأرضية المستخدم بواسطة PanDDA ، حدد دليل PanDDA ذي الصلة في XCE وقم بتشغيل apo->mmcif من قائمة تحديد الضرب .
   ملاحظة: ستقوم XCE بتحديد بنية عالية الدقة بشكل تعسفي مع Rfree منخفض كنموذج لحزمة الترسيب ثم تجميع جميع ملفات عامل البنية mmcif في ملف واحد.
8. في علامة التبويب الترسيب ، حدد الزر إضافة إلى قاعدة البيانات أسفل قسم ترسب المجموعة لنموذج الحالة الأرضية .
9. أدخل البيانات الوصفية لنموذج الحالة الأرضية (مرة أخرى عن طريق تحديد الترسيب > تحرير المعلومات) ، وقم بتحميل الملف السابق وحفظ في قاعدة البيانات.
10. قم بإعداد ملف mmcif للحالة الأرضية عن طريق تشغيل إعداد mmcif من قسم ترسب المجموعة لنموذج الحالة الأرضية وعند اكتماله ، انسخ mmcif إلى دليل ترسيب المجموعة عن طريق تحديد الزر نسخ mmcif من نفس القسم.
11. كما كان من قبل ، انتقل إلى https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit ؛ تسجيل الدخول باستخدام اسم المستخدم: GroupTester وكلمة المرور: !2016RCSBPDB. قم بإنشاء جلسة وتحميل ملف ground_state_structures.tar.bz2 من دليل ترسيب المجموعة.

النتائج

تم تبسيط خط أنابيب XChem لفحص الشظايا بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية على نطاق واسع ، مما مكن المجتمع العلمي من استيعابه (الشكل 5). تم التحقق من صحة هذه العملية في أكثر من 150 حملة فحص بمعدل نجاح يتراوح بين 1٪ و 30٪ ⁴⁷،^48،49،⁵⁰،^51،52 ومن قبل العديد من المستخدمين المتكررين. يتم التخلص من الأنظمة البلورية غير المناسبة (دقة منخفضة ، غير متسقة في التبلور أو في جودة الحيود ) أو لا يمكنها تحمل DMSO أو جلايكول الإيثيلين في وقت مبكر من العملية ، مما يوفر الوقت والجهد والموارد. توفر الحملات الناجحة خريطة ثلاثية الأبعاد لمواقع التفاعل المحتملة على البروتين المستهدف. النتيجة النموذجية هي شاشة XChem للبروتياز الرئيسي ل SARS-CoV-2 (الشكل 6). وعادة ما توجد ضربات الشظايا في: (أ) المواقع المعروفة ذات الأهمية، مثل المواقع النشطة للإنزيم والجيوب الفرعية 48؛ (ب) المواقع النشطة للإنزيم والجيوب الفرعية 48؛ (ب) المواقع المعروفة ذات الأهمية، مثل المواقع النشطة للإنزيم والجيوب الفرعية 48؛ (ب) المواقع المعروفة ذات الأهمية، مثل المواقع النشطة للإنزيم والجيوب الفرعية⁴⁸؛ (ب) المواقع المعروفة ذات الأهمية، مثل المواقع النشطة للإنزيم و (ب) المواقع الخيفية المفترضة، على سبيل المثال، في التفاعلات بين البروتين^{والبروتين 53}؛ (ج) واجهات التعبئة البلورية ، التي تعتبر عموما إيجابيات كاذبة (الشكل 6). توفر هذه البيانات الهيكلية عموما أساسا لدمج أو ربط أو زيادة ضربات الشظايا في جزيئات صغيرة تشبه الرصاص ^1,3.

الشكل 1: خط أنابيب XChem. يتم تمثيل المنصة بشكل تخطيطي من اقتراح المشروع من خلال إعداد العينات وجمع البيانات وتحديد النتائج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: استراتيجية الفحص. يشير سير العمل إلى الغرض من كل حدث رئيسي ومتطلبات التجربة ونقاط القرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: سير عمل إعداد العينة. يتم تمثيل الخطوات الحرجة لإعداد العينة بمعلومات من كل خطوة يتم تسجيلها في قاعدة بيانات SQLite. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل البيانات باستخدام XCE. يتم تمثيل الخطوات الهامة في تحليل البيانات من خلال مخطط سير العمل مع حزم البرامج ذات الصلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تطور برنامج مستخدم XChem: يوضح الرسم البياني استيعاب وتوحيد برنامج المستخدم من عام 2015 حتى عام 2019 مع إنشاء BAGs في عام 2019 ومرونة النظام الأساسي خلال جائحة COVID-19 في عام 2020. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: النتائج التمثيلية لشاشة جزء XChem. يتم تمثيل ديمر البروتياز الرئيسي ل SARS-CoV2 (M^pro) في السطح مع نتائج الموقع النشطة الموضحة باللون الأصفر ، وتظهر الضربات الخيفية المفترضة باللون الأرجواني ، والمصنوعات اليدوية السطحية / الكريستالية الموضحة باللون الأخضر. تم عمل الرقم باستخدام إدخالات Chimera و M^pro PDB من ترسب المجموعة G_1002156. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم اختبار العملية الموضحة في هذه الورقة على نطاق واسع من قبل مجتمع المستخدمين ، وتعد قابلية التكيف مع البروتوكولات الموضحة هنا أمرا أساسيا للتعامل مع مجموعة واسعة من المشاريع التي تتم مواجهتها عادة على المنصة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى بعض المتطلبات المسبقة للنظام البلوري.

بالنسبة لأي حملة لفحص الشظايا يتم إجراؤها باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية ، يعد وجود نظام بلوري قوي وقابل للتكرار أمرا بالغ الأهمية. نظرا لأن بروتوكول XChem القياسي يتضمن إضافة الجزء مباشرة إلى قطرة البلورة ، يجب أن يركز التحسين على عدد القطرات التي تحتوي على بلورات عالية الجودة بدلا من العدد الإجمالي للبلورات. إذا كانت القطرات تحتوي على بلورات متعددة ، فهي زائدة عن الحاجة بشكل فعال على الرغم من أنها قد تخفف من عملية الحصاد. علاوة على ذلك ، قد يكون نقل بروتوكول التبلور من المعهد المنزلي إلى المرافق في الموقع أمرا صعبا. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك عموما هي استخدام البذر البلوري لتعزيز النوى القابلة للتكرار⁵⁴، وبالتالي، فإن الممارسة الجيدة هي أن يوفر المستخدمون مخزونات البذور جنبا إلى جنب مع محاليل البروتين والتبلور الخاصة بهم.

لضمان قابلية جيدة للذوبان والدعم المركب ، يتم توفير تركيزات النقع العالية التي تهدف إلى دفع ربط الشظايا الضعيفة ، ومكتبات الشظايا في المذيبات العضوية ، وتحديدا DMSO وجلايكول الإيثيلين. يوفر توفير مذيبين مختلفين للمستخدمين بديلا للبلورات التي لا تتسامح مع DMSO على الإطلاق ، أو حيث تحجب ربط الشظايا في موقع مهم. يمكن للمستخدمين توفير مكتبات بديلة في المخزن المائي: سيتم الاستغناء عن المركبات جيدا بشرط إذابتها تماما وتنسيقها في ألواح متوافقة مع روبوت توزيع السوائل.

بالنسبة للمشاريع التي لا يمكن فيها العثور على مذيب عضوي مناسب من شأنه أن يذوب المكتبة ويتحمله النظام البلوري ، فإن الإجراء البديل هو استخدام المركبات المجففة على النحو المحدد في BESSY⁵⁵.

في المجتمع ، هناك سؤال طويل الأمد حول القدرة على امتصاص المركبات في بلورات تزرع في ظروف التبلور التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح. من الناحية العملية ، لوحظ المزيد من هطول الأمطار للمركبات والتكوين السريع لبلورات الملح في مرحلة الحصاد ، والتي يتم تقليلها عن طريق تطبيق بيئة رطبة حول منطقة الحصاد. بشكل عام ، تعطي حملات الفحص في الأنظمة البلورية من ظروف تبلور الملح العالي معدل إصابة مماثل لظروف الملح المنخفضة.

المراحل الأولية من عملية XChem (اختبار تحمل المذيبات والفحص المسبق) هي تجارب صغيرة الحجم وسريعة نسبيا ولكنها تسمح باتخاذ قرار واضح / عدم الذهاب للمشروع. الأمر الأكثر إيلاما هو أنه يجب العثور على أنظمة بلورية بديلة إذا لم يتم التسامح مع أي من المذيبات ، أو إذا أدت الشاشة المسبقة إلى معدل إصابة منخفض للغاية. في المقابل ، إذا نجحت ، فإن النتائج تبلغ مباشرة حالة النقع لاستخدامها في تجربة الفحص ، وأفضل استراتيجية لجمع البيانات. نظرا لأن جودة البيانات ، وخاصة الدقة ، ستؤثر على جودة كثافة الإلكترون لتحديد النتائج وتحليلها ، فإن الهدف هو الامتصاص بأعلى تركيز مركب ممكن ليس له تأثير ضار على جودة الحيود (مع حيود غالبية مجموعات البيانات (~ 80٪) إلى دقة 2.8 Å أو أفضل).

يتم تبسيط عملية تحليل البيانات داخل XChemExplorer ، والتي تعتمد على برنامج PanDDA للكشف عن المجلدات الضعيفة وتسمح للمستخدمين بتصور نتائج حملة الفحص ومراجعتها بسرعة. تستورد XChemExplorer نتائج معالجة البيانات من الحزم المتوفرة في Diamond (DIALS¹⁶ و autoPROC 30 و STARANISO³¹ و Xia2¹⁴) مع حدود الدقة التي تحددها الطريقة القياسية لكل حزمة (أي^CC1 / 2 = 0.3). بشكل افتراضي ، يعتمد اختيار مجموعة البيانات على درجة محسوبة من I / sigI ، والاكتمال ، وعدد من الانعكاسات الفريدة ، ولكن يمكن تحديد نتائج معالجة محددة للاستخدام على مستوى العالم أو للعينات الفردية²⁵. يتم استبعاد البيانات أيضا من التحليل بواسطة PanDDA بناء على معايير تشمل الدقة و R_free والفرق في حجم خلية الوحدة بين البيانات المرجعية والهدف (الإعدادات الافتراضية هي 3.5 Å و 0.4 و 12٪ على التوالي) ، بحيث لا تؤثر البلورات ذات الحيود السيئ أو سوء التمركز أو سوء الفهرسة على التحليل.

تستفيد خوارزمية PanDDA من العدد الكبير من مجموعات البيانات التي تم جمعها أثناء حملة الأجزاء للكشف عن روابط الإشغال الجزئي غير المرئية في الخرائط البلورية القياسية. في البداية ، يستخدم PanDDA البيانات التي تم جمعها أثناء اختبار تحمل المذيبات وخطوات الفحص المسبق لإعداد خريطة متوسط الكثافة والتي يتم استخدامها بعد ذلك لإنشاء نموذج الحالة الأرضية. نظرا لأنه سيتم استخدام هذا النموذج لجميع خطوات التحليل اللاحقة ، فمن الضروري أن يمثل بدقة البروتين غير المربوط في ظل الظروف المستخدمة لشاشة الشظية. ثم يستخدم PanDDA تحليلا إحصائيا لتحديد الروابط المرتبطة ، وإنشاء خريطة حدث للحالة المرتبطة بالبلورة. يتم إنشاء خريطة الحدث عن طريق طرح الجزء غير المنضم من البلورة من مجموعة بيانات الإشغال الجزئي وتعرض ما يمكن ملاحظته إذا كان الليجند مرتبطا بالإشغال الكامل. حتى الأجزاء التي تبدو واضحة في الخرائط التقليدية 2mF_{o-DF c} قد يتم تصميمها بشكل خاطئ إذا لم يتم الرجوع إلى خرائط الأحداث³². في حين أن PanDDA هي طريقة قوية لتحديد مجموعات البيانات التي تختلف عن متوسط الخرائط (والتي عادة ما تكون مؤشرا على ربط الشظايا) ويتم توفير مقاييس مثل RSCC و RSZD ونسبة العامل B و RMSD أثناء التحسين لصالح المستخدمين ، يكون المستخدم مسؤولا في النهاية عن تحديد ما إذا كانت الكثافة المرصودة تصور بدقة الليجند المتوقع والتشكل الأنسب.

بعد تحليل البيانات وتحسينها ، يمكن لجميع المستخدمين إيداع هياكل متعددة في وقت واحد في بنك بيانات البروتين (PDB) باستخدام XChemExplorer. لكل شاشة شظية ، يتم إجراء ترسبين جماعيين. يحتوي الترسيب الأول على جميع النماذج المرتبطة بالأجزاء ، مع معاملات لحساب خرائط أحداث PanDDA المضمنة في ملفات MMCIF. يوفر الترسيب الثاني نموذج الحالة الأرضية المصاحب ، على طول عوامل البنية المقاسة لجميع مجموعات البيانات الخاصة بالتجربة: يمكن استخدام هذه البيانات لإعادة إنتاج تحليل PanDDA ، ولتطوير الخوارزميات المستقبلية. أما بالنسبة لهياكل الضربات ، فعندما يكون شغل الشظايا منخفضا ، يكون التحسين أفضل إذا كانت النماذج مركبة من هياكل الحالة الأرضية المربكة^{والمربكة 32} ؛ ومع ذلك ، فإن الممارسة هي إيداع كسور الحالة الحدية فقط ، لأن النماذج المركبة الكاملة معقدة بشكل عام ويصعب تفسيرها. ونتيجة لذلك، فإن بعض مؤشرات الجودة التي أعاد مجلس التنمية الإنمائي حسابها (ولا سيما R/Rfree) تكون مرتفعة قليلا في بعض الأحيان. من الممكن أيضا توفير جميع البيانات الأولية باستخدام منصات مثل Zenodo⁵⁶ ، على الرغم من أن هذا غير مدعوم حاليا بواسطة خط أنابيب XChem.

بشكل عام ، منذ تشغيله في عام 2016 ، يمكن تحديد الروابط الشظوية في أكثر من 95٪ من الأهداف باستخدام هذا الإجراء. تم تقطير الخبرة من العديد من المشاريع التي دعمتها XChem إلى أفضل الممارسات لإعداد الكريستال³³ ، في حين تم تطوير مكتبة الأجزاء التي نفذت المفهوم المتوازن للمساعدة في تقدم الأجزاء²⁹ ، مما ساعد أيضا في تأسيس ممارسة جعل تكوين المكتبة عاما. أثبتت المنصة أهمية البنية التحتية التي يتم صيانتها جيدا والعمليات الموثقة ، المفصلة هنا ، وجعلت من الممكن تقييم مكتبات الأجزاء الأخرى^57,58 ، ومقارنة المكتبات⁴⁸ ، وإبلاغ تصميم مكتبة EUOpenscreen-DRIVE التعاونية ^59,60.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSI-poised library	Enamine	DSI-896	fragment library
Echo 550 and 650 series	Beckman-Coulter		acoustic dispensing system
Echo microplates	Beckman-Coulter	001-12380; 001-8768; 001-6025	1536-well and 384-well microplates
Shifter	Oxford Lab Technology		harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor	Sigma	model 11121	microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates	Swissci	3W96T-UVP	Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software	Formulatrix		Crystallisation plates imaging device