Diamond Light Source'taki XChem Tesisinde Verimli Parça Taramasının Gerçekleştirilmesi

Özet

Bu belge, erişim başvurusundan ve veri dağıtımına kadar sonraki tüm adımlardan başlayarak kristal tabanlı parça taraması için tüm XChem sürecini açıklamaktadır.

Özet

Parça bazlı ilaç keşfinde, ~ 300 Da'dan daha küçük yüzlerce veya genellikle binlerce bileşik, güçlü ilaç adaylarına dönüştürülebilecek kimyasal varlıkları tanımlamak için ilgilenilen proteine karşı test edilir. Bileşikler küçük olduğundan, etkileşimler zayıftır ve bu nedenle tarama yöntemi oldukça hassas olmalıdır; Ayrıca, yapısal bilgiler, bu isabetleri kurşun benzeri bileşiklere dönüştürmek için çok önemli olma eğilimindedir. Bu nedenle, protein kristalografisi her zaman altın standart bir teknik olmuştur, ancak tarihsel olarak birincil ekran olarak yaygın kullanım bulmak için çok zor olmuştur.

İlk XChem deneyleri 2014 yılında gösterildi ve daha sonra süreci doğrulamak için akademik ve endüstriyel işbirlikçilerle denendi. O zamandan beri, büyük bir araştırma çabası ve önemli ışın süresi, numune hazırlamayı kolaylaştırdı, hızlı takip olanaklarına sahip bir parça kütüphanesi geliştirdi, gözetimsiz veri toplama için I04-1 ışın hattının kapasitesini otomatikleştirdi ve geliştirdi ve veri yönetimi, analizi ve isabet tanımlaması için yeni araçlar uyguladı.

XChem artık büyük ölçekli kristalografik parça taraması için bir tesistir, tüm kristallerin biriktirilmesine kadar olan süreci destekler ve dünya çapındaki akademik ve endüstriyel kullanıcılar tarafından erişilebilir. Hakemli akademik kullanıcı programı, 2016 yılından bu yana, iyi doğrulanmış ve keşif projeleri de dahil olmak üzere mümkün olduğunca geniş bir bilimsel kapsamdan projeleri barındırmak için aktif olarak geliştirilmiştir. Akademik erişim, hakemli teklifler için yılda iki kez yapılan çağrılar yoluyla tahsis edilir ve tescilli çalışmalar Diamond'ın Endüstriyel İrtibat grubu tarafından düzenlenir. Bu iş akışı, çeşitli terapötik alanlardan yüzden fazla hedefe rutin olarak uygulanmıştır ve hem bileşik tasarım için yüksek kaliteli başlangıç noktaları olarak hizmet eden hem de bağlama bölgeleri hakkında kapsamlı yapısal bilgi sağlayan zayıf bağlayıcıları (%1-%30 isabet oranı) etkili bir şekilde tanımlar. Sürecin dayanıklılığı, ana proteaz için 2 haftalık bir geri dönüş de dahil olmak üzere, COVID-19 salgını sırasında SARS-CoV-3 hedeflerinin sürekli taranmasıyla gösterildi.

Giriş

Parça Tabanlı İlaç Keşfi (FBDD), kurşun keşfi için yaygın olarak kullanılan bir stratejidir ve 25 yıl önce ortaya çıkmasından bu yana, klinik kullanım için dört ilaç sunmuştur ve 40'tan fazla molekül klinik deneylere^{ilerlemiştir 1,2,3}. Fragmanlar, genellikle moleküler ağırlığı 300 Da veya daha az olan küçük kimyasal varlıklardır. Mükemmel fizikokimyasal özelliklere sahip yüksek ligand verimli inhibitörlerin geliştirilmesi için iyi başlangıç noktaları sağlayan düşük kimyasal karmaşıklıkları nedeniyle seçilirler. Büyüklükleri, proteinlerin bağlanma manzarasını daha büyük ilaç veya kurşun benzeri bileşiklerin kütüphanelerinden daha kapsamlı bir şekilde örnekledikleri ve böylece sıcak noktaları ve varsayılan allosterik bölgeleri ortaya çıkardıkları anlamına gelir. Yapısal bilgilerle birleştirildiğinde, fragmanlar, protein ve ligand arasındaki potansiyel moleküler etkileşimlerin ayrıntılı bir haritasını sağlar. Bununla birlikte, hedef proteine zayıf bağlanma eğiliminde olan bu varlıkların güvenilir bir şekilde tespit edilmesi ve doğrulanması, Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) gibi bir dizi sağlam ve hassas biyofiziksel tarama yöntemi ^{gerektirir4,5}.

X-ışını kristalografisi, FBDD araç setinin önemli bir parçasıdır: zayıf bağlayıcıları tanımlayacak kadar hassastır ve moleküler düzeyde etkileşimler hakkında doğrudan yapısal bilgi verir. Diğer biyofizik taramaları için tamamlayıcıdır ve genellikle kurşun bileşiklere parça isabetlerini ilerletmek için gereklidir; yüksek kaliteli kristal sistemleri gerektirir, yani kristalleşmenin yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu ve kristallerin ideal olarak 2.8 şçözünürlükten daha iyi kırıldığı anlamına gelir.

Tarihsel olarak, ister akademide ister endüstride olsun, kristalografiyi birincil fragman ekranı ^6,7,8 olarak kullanmak çok zor olmuştur. Buna karşılık, senkrotronlar robotik, otomasyon 9,10,11 ve dedektör teknolojisinde 12,13 büyüklük sırasına göre iyileştirmeler elde etti ve eşit derecede hızlandırılmış bilgi işlem gücü ve veri işleme^{algoritmaları 14,15,16} ile birleştiğinde^, tam kırınım veri kümeleri saniyeler içinde ölçülebilir ve LillyCAT^7'de öncülük edildiği gibi çok sayıda tamamen gözetimsiz olarak ölçülebilir ve daha sonra MASSIF^17,18 (Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF)). Bu, senkrotronların, kristal tabanlı parça taramasını birincil ekran olarak geniş bir kullanıcı topluluğu için erişilebilir hale getirmek için son derece akıcı platformlar geliştirmesine yol açtı (XChem at Diamond; EMBL/ESRF^19'da CrystalDirect; BESSY, Helmholtz-Zentrum, Berlin^20'de; MaxIV^21'de FragMax).

Bu makale, numune hazırlamadan 3D modellenmiş isabetlerin nihai yapısal sonuçlarına kadar X-ışını kristalografisi ile parça taraması için XChem platformunu oluşturan protokolleri belgelemektedir. Boru hattı (Şekil 1), kristal tanımlama²², ıslatma²³ ve^{hasat 24} için yeni yaklaşımların yanı sıra veri yönetimi yazılımı 25 ve şu anda toplulukta yaygın olarak kullanılan parçaları²⁶ tanımlamak için algoritmik bir yaklaşım geliştirmeyi gerektiriyordu. Kristal hasat teknolojisi artık bir satıcı tarafından satılmaktadır (Malzeme Tablosuna bakınız) ve aletlerin açık kullanılabilirliği, diğer senkrotronların bunları eşdeğer platformlar kurmak için uyarlamasına izin vermiştir²¹. Devam eden projeler, Fragalysis platformu²⁷ aracılığıyla veri analizi, model tamamlama ve veri dağıtımını ele almaktadır. Numune hazırlama laboratuvarı I04-1 ışın hattının bitişiğindedir ve yüzlerce donmuş numunenin ışın hattına aktarılması lojistiğini basitleştirir ve I04-1'de özel ışın süresi, kampanyaya rehberlik etmek için hızlı X-ışını geri bildirimine olanak tanır.

XChem, yılda iki kez (Nisan başı ve Ekim) yapılan Diamond kullanıcı programının ayrılmaz bir parçasıdır. Hakem değerlendirme süreci, Akademi ve Endüstri'den ilaç keşfi uzmanlarına danışılarak rafine edilmiştir. Güçlü bir bilimsel vakanın yanı sıra, teklif süreci²⁸ , başvuru sahiplerinin yalnızca kristal sistemin hazır olup olmadığını değil, aynı zamanda biyokimyasal ve ortogonal biyofiziksel yöntemlerdeki uzmanlıklarını ve takip kimyası yoluyla tarama isabetlerini ilerletme kapasitelerini de kendi kendilerine değerlendirmelerini gerektirir. Erişim modları da çok disiplinli kullanıcı topluluğunu barındıracak şekilde gelişmiştir:

Katman 1 (tek proje), keşif aşamasındaki projeler içindir ve isabet doğrulama araçlarının (biyofizik veya biyokimyasal araçlar) ve takip stratejilerinin mevcut olması gerekmez. Kabul edilirse, projeye, kavram kanıtı için yeterli sayıda ışın zamanı kayması verilir.

Katman 2 (tek proje), iyi doğrulanmış projeler içindir ve aşağı akış araçlarının ve takip stratejilerinin uygulanmasını gerektirir. Kabul edilirse, projeye tam bir fragman tarama kampanyası için yeterli ışın süresi tahsis edilir. Tekil projeler (Tier 1 veya Tier 2), tahsis süresinin 6 ayı içinde (Nisan-Eylül veya Ekim-Mart) tamamlanacaktır.

Blok Tahsis Grubu (BAG), BAG içinde sağlam bir hedef seçim ve önceliklendirme sürecinin yanı sıra net bir takip hattının uygulandığı bir grup ve proje konsorsiyumu içindir. BAG'ler, faaliyetlerini Diamond personeli ile koordine eden ve BAG üyelerini eğiten, tamamen XChem tarafından eğitilmiş en az bir uzmana (süper kullanıcı) sahip olmalıdır. Tahsis edilen ışın zamanı kayma sayısı, BAG'deki bilimsel olarak güçlü projelerin sayısı ile tanımlanır ve BAG'nin raporuna dayalı olarak tahsis süresi başına yeniden değerlendirilir. Erişim 2 yıl boyunca kullanılabilir.

XChem deneyi, her biri için bir karar noktası olan üç aşamaya ayrılmıştır: solvent tolerans testi, ön ekran ve ana ekran (Şekil 2). Solvent tolerans testi, ıslatma parametrelerini, kristal sisteminin tolere edebileceği solvent miktarını (DMSO, etilen glikol veya gerekirse diğer kriyoprotektanları) ve ne kadar süreyle tanımlamaya yardımcı olur. Solvent konsantrasyonları tipik olarak en az iki zaman noktasında %5-%30 arasında değişir. Kırınım verileri toplanır ve kristal sisteminin temel kırınımı ile karşılaştırılır; Bu, bir sonraki aşama için ıslatma parametrelerini belirleyecektir. Ön eleme için, çözücü testinde belirlenen koşullar kullanılarak 100-150 bileşik ıslatılır ve amacı, kristallerin bu koşullarda bileşikleri tolere edebildiğini doğrulamaktır. Gerekirse, kriyoprotektan daha sonra parçaları içeren damlalara eklenir. Başarı kriterleri, kristallerin %80'inin veya daha fazlasının iyi ve tutarlı kalitede kırınım verileri verecek kadar iyi hayatta kalmasıdır; Bu başarısız olursa, ıslatma koşulları genellikle ıslatma süresi veya çözücü konsantrasyonu değiştirilerek revize edilir. Başarılı bir ön elemenin ardından, deney için seçilen bileşiklerin geri kalanı nihai parametreler kullanılarak ayarlanabilir.

DSI'ye hazır kütüphane (Materyal Tablosuna bakınız), hazır kimya²⁹ kullanılarak hızlı takip ilerlemesine izin vermek için özel olarak tasarlanmıştır ve tesisin beygir kütüphanesi olmuştur. DMSO'da 500 mM konsantrasyonda kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Akademik kullanıcılar, DMSO'da 100-500 mM konsantrasyonlarda (toplamda 2.000'den fazla bileşik) işbirlikçiler tarafından sağlanan diğer kütüphanelere de erişebilirler (tam liste web sitesinde bulunabilir²⁸). Genel koleksiyonun çoğu, DMSO'yu tolere etmeyen kristal sistemler için etilen glikolde de mevcuttur. Kullanıcılar, akustik sıvı taşıma sistemi ile uyumlu plakalarda olmaları koşuluyla kendi kitaplıklarını da getirebilirler (bkz. Malzeme Tablosu).

Deneyin üç adımı için de (çözücü karakterizasyonu, ön eleme veya tam ekran), aşağıdaki numune hazırlama prosedürleri aynıdır (Şekil 3): görüntüleme yoluyla bileşik dağıtım yerinin seçimi ve kristalizasyon damlalarının TeXRank²² ile hedeflenmesi; hem çözücü hem de bileşikler için akustik sıvı dağıtım sistemini kullanarak damlalara dağıtma²³; Kristal değiştirici²⁴ kullanılarak kristallerin verimli bir şekilde toplanması; ve örnek bilgilerin ışın hattı veritabanına (ISPyB) yüklenmesi. Deney tasarımı ve yürütmesi için mevcut arayüz, platformun farklı ekipmanları için gerekli girdi dosyalarını oluşturan ve tüm sonuçları bir SQLite veritabanında izleyen ve kaydeden Excel tabanlı bir uygulamadır (SoakDB). Barkod tarayıcılar, numunelerin izlenmesine yardımcı olmak için süreç boyunca çeşitli aşamalarda kullanılır ve bu veriler veritabanına eklenir.

Kırınım verileri, ışın hattı I04-1 üzerinde özel ışın süresi kullanılarak katılımsız modda toplanır. Optik ve X-ışını tabanlı olmak üzere iki merkezleme modu mevcuttur¹⁷. İğne ve çubuk şeklindeki kristaller için, X-ışını merkezleme tavsiye edilirken, daha kalın kristaller genellikle daha hızlı olan ve bu nedenle ayrılan ışın süresinde daha fazla numunenin toplanmasına izin veren optik modu destekler. Kristallerin çözünürlüğüne bağlı olarak (platforma girmeden önce oluşturulan) veri toplama 60 s veya 15 s toplam maruz kalma olabilir. Solvent testi aşamasında veri toplama, genellikle ışın hattı I04-1'in performansıyla hangi kombinasyonun en iyi şekilde çalışacağını bildirir.

Büyük hacimli veri analizi, PanDDA ²⁶ kullanılarak isabet tanımlama adımını başlatmak için de kullanılabilen XChemExplorer (XCE)²⁵ aracılığıyla yönetilir. XCE, protein-ligand yapılarının büyük ölçekli analizini destekleyen bir veri yönetimi ve iş akışı aracıdır (Şekil 4); Diamond Light Source'ta (DIALS¹⁶, Xia2¹⁴, AutoPROC³⁰ ve STARANISO³¹) toplanan verilerden elde edilen otomatik işleme sonuçlarını okur ve veri kalitesine ve bir referans modele benzerliğe dayalı olarak sonuçlardan birini otomatik olarak seçer. Modelin XChem taraması için kullanılan kristal sistemini temsil etmesi önemlidir ve tüm suları veya diğer çözücü moleküllerini ve ayrıca yalnızca çözücü ile ıslatılmış kristallerde görülebilen tüm kofaktörleri, ligandları ve alternatif konformasyonları içermelidir. Bu referans modelin kalitesi, model oluşturma ve iyileştirme aşamasında gereken iş miktarını doğrudan etkileyecektir. PanDDA, tüm verileri analiz etmek ve bağlanma yerlerini belirlemek için kullanılır. Yapıları bir referans yapıya hizalar, istatistiksel haritaları hesaplar, olayları tanımlar ve olay haritalarını^{hesaplar 26,32}. PanDDA paradigmasında, tam kristalografik modeli oluşturmak ne gerekli ne de arzu edilir; Modellenmesi gereken şey, yalnızca bir parçanın bağlı olduğu proteinin görünümüdür (bağlı durum modeli), bu nedenle olay haritası^32'ye göre yalnızca ligand ve çevresindeki kalıntıları/çözücü moleküllerini oluşturmaya odaklanılmalıdır.

Protokol

1. Proje önerisinin sunulması

1. Teklif içeriği: XChem programı aşırı talep gördüğünden, teklifteki kapsamlı ve eksiksiz bilgiler, hakem değerlendirmesinden geçmek için kritik öneme sahiptir.
   1. Davayı aç! Hedefin önemini sunun ve daha geniş bir bağlama oturtun.
      1. Parça tarama kampanyasından sonra stratejiyi ifade edin: isabetleri doğrulamak için uygulanan ortogonal yöntemler ve bunların nasıl ilerletileceği. Gerekirse işbirliklerini sıralayın.
      2. Yoğun laboratuvar ve veri analizi bölümü nedeniyle, önceden deneyimli bir kristalograf atanması şiddetle tavsiye edilir.
      3. Sağlam bir kristal sistemi, teknik çeşitliliği ortadan kaldırmanın anahtarıdır ve kullanıcılar bu temel noktaları ele almalıdır.
         1. Kristalleşme koşullarının, rezervuar hacmi 30 μL (veya daha az) ve damla boyutu 200-500 nL arasında olan platformda kullanıma uygun plakalarda benzer kırınım kalitesinde kristallerle tekrarlanabilir damlalar verdiğinden emin olun. İdeal olarak, bir plakadaki damlaların% 50'sinden fazlası en az 35 μm boyutunda³³ kristallere sahip olacaktır.
         2. Kristallerin tutarlı kırınım kalitesini sağlayın (2.6 şveya daha iyi).
         3. Kristal paketleme ve bilinen yerlerin erişilebilirliği dahil olmak üzere parça taraması için kristal sisteminin uygunluğunu kontrol edin. Bu bölgelere bağlı bir molekülün önceki kanıtları genellikle güven vericidir.

2. Ziyaret için hazırlık

1. Yerinde kristalizasyon için kristalizasyon protokollerinin transferi.
   1. Kullanıma hazır 2 x 50 mL rezervuar çözeltisi sağlayın.
   2. Protein çözeltisini kristalizasyon için gerekli konsantrasyonda, 30-50 μL'lik alikotlarda kullanıma hazır olarak sağlayın.
   3. 10 mL protein tampon çözeltisi sağlayın.
   4. Tohum stoğu sağlayın (kristalizasyon protokolünde gerekli olmasa bile).
      NOT: Tohumlama, kristalleşmenin tekrarlanabilirliğini destekler ve çekirdeklenme süresini^{hızlandırır 33}.
   5. XChem web sitesinde bulunan kristalleşme bilgi formunu doldurun²⁸.
   6. XChem web sitesinde bulunan gönderi formunda depolama bilgilerini sağlayın²⁸.
2. NoMachine'i kurun ve Diamond'a (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html) bir uzak masaüstü kurun.
3. Uzman bir kristalograf veya XChem destek personeline danışarak iyi bir referans modeli oluşturun ve aktarın.

3. Parça tarama deneyi

1. Bileşik dağıtım yerinin tanımlanması.
   1. Kristalizasyon plakalarının görüntülenmesi.
      1. Kristal plaka görüntüleyicilerde deney için gerekli olan tüm kristal plakaları (Malzeme Tablosuna bakınız) görüntüleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Görüntüleyici yazılımını kullanarak, plaka türü için doğru dizinde aşağıdaki formatta plaka ad(lar)ı oluşturun Teklif Number_Plate Numarası.
      2. Barkodları yazdırın (plaka adına sağ tıklayın ve menüden seçin), satır harflerinden plakanın karşı tarafına yerleştirin, plakayı/plakaları barkod kullanıcıdan uzağa bakacak şekilde yükleme portuna yerleştirin.
      3. Görüntüleyici kontrol yazılımını kullanın, yükleme portunu tarayın, plakalara sağ tıklayın ve ardından Görüntü Plakaları'nı seçin.
      4. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, plakaları görüntüleyiciden çıkarın.
   2. Kristallerin ve bileşik yerin seçilmesi
      NOT: Kristalleşme damlacıklarının görüntüleri, damlacıkları kristallerin olası varlığına göre sıralamak için TexRank'in textons tabanlı algoritması Ranker kullanılarak Luigi boru hattı içinde işlenir²². Bu yaklaşık 10 dakika sürer ve görüntüler daha sonra TexRank'te mevcut olacaktır.
      1. Bir PC'den TeXRank'ı açın ve sağ alttaki listeden veya sol üstteki kutuya barkodu yazarak kristal tepsiyi seçin.
      2. Doğru görüntüleyici formatını ve tek kuyucuklu görünümü seçin. Damla görüntüleri arasında ilerleyin ve bir deneyde kullanıma uygun bir kristal olduğunda, kristalden sağ tıklayın, ancak damlanın içinde amaç, çözücü/bileşik eklemek için damlanın neresini hedeflemektir, bu nedenle doğrudan kristale^{vurmak istemeyin 23}.
      3. Tüm plaka boyunca devam edin ve bittiğinde Echo 1 Target düğmesini seçin; İlgili ziyaretin altındaki Crystal Targets dizinine kaydedin. Dosya adını değiştirmeyin.
      4. İlave plakalar için tekrarlayın.
2. Bileşik dağıtım
   1. Bileşik dağıtım için dosyalar oluşturma
      1. SoakDB'de, kitaplık/çözücü tablosuna kitaplık seçimini veya çözücü bilgilerini girin.
      2. Hedeflenen kristaller listesine düşme hacmini ve yükünü girin.
      3. Gerekli toplu işlemleri oluşturun.
      4. Islatma parametrelerini girin. Hesapla'ya ve ardından İhracat Beklemede düğmesine tıklayın. Çözücü için, çeşitli konsantrasyonları tabloya ekleyin. Bu, akustik dağıtıcıda kullanılmak üzere dosyaları oluşturur.
      5. Kriyoprotektan kullanıyorsanız, konsantrasyonu girin ve dosyaları aynı şekilde oluşturun.
   2. Akustik dağıtıcıyı kullanarak dağıtım çözümleri (bkz. Malzeme Tablosu)
      1. Kaynak plakasını (bileşikler veya çözücü / kriyoprotektan) alın ve plakayı santrifüjde 2 x g'da 1,000 dakika döndürün.
      2. Çözücü veya kriyoprotektan dağıtıyorsanız, 384PP'lik bir plaka üzerindeki ilgili kuyucuğa 30 μL pipetleyin; Bir mikromühür filmi ile örtün ve ardından yukarıdaki gibi santrifüjleyin.
      3. Yazılımı açın; Yeni'yi seçin ve doğru kaynak kuyu plakasını (384PP, 384LDV veya 1536LDV) ve sıvı sınıfını (DMSO, CP, BP veya GP) seçin. Hedef plaka olarak doğru plaka tipinin seçildiğinden emin olun. Ardından Özel kutusunu işaretleyin ve devam edin.
      4. İçeri Aktar'ı seçin ve ilgili toplu iş dosyasını seçin. Yazılım tarafından istendiği şekilde içe aktarma adımlarını tamamlayın.
      5. Dağıtılacak çözeltiyi ve varış yerlerini kontrol etmek için plaka haritalarını kullanın.
      6. Ortaya çıkan istemleri izleyerek protokolü çalıştırın. Kaynak plakasından gelen çözelti(ler) seçilen kristal damlalarına dağıtılacaktır.
      7. Plakayı inkübatörde gerekli süre saklayın.
         NOT: Bu parametreler çözücü karakterizasyon adımında belirlenir, kristal büyüme sıcaklığına bağlı olarak sıcaklık 4 °C veya 20 °C olacaktır ve süreler tipik olarak 1 saat ile 3 saat arasındadır.
3. Yarı otomatik kristal toplama cihazını kullanarak kristallerin toplanması (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Kriyoproteksiyon gerekiyorsa, numuneleri toplamadan önce kristal damlalara kriyoprotektan çözeltilerinin eklenmesi için adım 3.2.2'yi tekrarlayın.
   1. Hasat için hazırlık
      1. SoakDB'de hasat için gerekli dosyaları hazırlayın. İstendiğinde, ıslatmaların yapıldığını ve partilerin tamamlandığını onaylayın.
      2. Deneme için gereken disk sayısını doğru teklif numarası altında tarayın.
      3. Kristaller için uygun boyutta ilmeklerden oluşan bir tepsi seçin (35 μm, 75 μm veya 150 μm). Daha da önemlisi, ışın hattındaki otomatik merkezlemenin daha doğru olmasını sağlamak, arka planı azaltarak veri kalitesini iyileştirmek ve kriyoprotektan ihtiyacını ortadan kaldırmak için kristalin boyutuna mümkün olduğunca yakın bir döngü boyutu seçin.
      4. İlgili yazılımı açın ve iş akışı sekmesini açın.
      5. Diskleri yazılıma tarayın ve ilk diski vurgulayarak listenin en üstüne geri dönün.
      6. Diskleri bir köpük dewar içine yerleştirin ve sıvı nitrojenle soğutun.
      7. SoakDB'den Dosyayı İçe Aktar'ı seçin ve hasat edilecek partiyi seçin; Partinin sol taraftaki tutucuya atanıp atanmadığını kontrol edin. Bir iş listesi görüntülenir.
      8. Kristal plakayı alın, contayı çıkarın ve sol taraftaki tutucuya yerleştirin; Plakayı park konumuna getirin.
   2. Hasat kristalleri
      1. Rahat olun ve ilk seçilen kuyu konumuna gitmek için İş Akışını Başlat düğmesine (ekran dokunmatik ekrandır) basın.
      2. Kristal hayatta kaldıysa, kristali döngüye monte edin ve listedeki ilk diskte 1. konuma yerleştirerek sıvı nitrojenin içine daldırın.
      3. Arayüzden kristal için uygun açıklamayı seçin (normal, erimiş, çatlak, jöle veya renkli).
      4. Damla bir bileşik ıslatma ise, bileşik durumunun açıklamasını kaydedin (berrak, kristal, çökeltilmiş, kötü dağıtım veya faz ayrımı).
      5. Kristal başarıyla takıldıysa, Takıldı'yı seçin, aksi takdirde Başarısız'ı seçin.
      6. Plaka bir sonraki seçilen kuyuya hareket edecektir. Tüm disk pozisyonlarını art arda doldurun (bir kristal arızalanırsa boşluk bırakmayın). İş akışının sonuna kadar devam edin.
      7. İş akışının sonunda, ek partileri yükleyin ve diskleri sırayla doldurmaya devam edin. Yeni bir parti için yeni bir disk başlatmaya gerek yoktur.
   3. Hasat sonuçlarının barkod takibi
      1. Tüm kristaller toplandıktan sonra, diskleri barkod tarayıcıya götürün, diski taramak ve barkodları sabitlemek için tutucuya birer birer yerleştirin.
      2. Bu tamamlandığında, kapakları kalıpların üzerine yerleştirin ve sıvı nitrojen deposunda saklayın.
      3. Çıktı dosyasını SoakDB arabirimine yükleyin.
   4. Örnek bilgilerin ISPyB'ye kaydedilmesi^34,35,36
      1. Örnek verileri ISPyB'ye yükleyin
         1. SoakDB'de, ışın hattını güncelleyin, ISPyB için Güncelleme'yi ziyaret edin ve ISPyB'ye yüklenecek dosyayı oluşturmak için Dışa Aktar'a tıklayın.
         2. Açık macun. Giriş yapın ve aşağıdaki dizine göz atın: dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
         3. csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv) komut dosyasını çalıştırın
            NOT: Örnekler artık ISPyB'ye yüklenmiştir.
      2. Disk konumunu ve veri toplama stratejisini kaydedin.
         1. Disklerin ayrıntılarını ve konumunu kaydedin
            NOT: Işın hattına yerleştirilebilmeleri ve yüklenebilmeleri için disklerin ayrıntılarını ve konumlarını kaydetmek önemlidir.
            1. SoakDB'de Pucks etiketli ikinci sekmeyi açın.
            2. Üst kısımdaki kutulardaki ayrıntıları doldurun. Özellikle, disklerin konumu (depolama dewar ve bastonlar), beklenen çözünürlük ve teklif numarası dahil olmak üzere veri toplama parametreleri.
            3. Kaydet düğmesine tıklayın ve tabloda tüm disklerin bir listesi görünecektir. En son doldurulan diskleri kopyalayın.
            4. XChem kuyruğu elektronik tablosunu (masaüstünde kısayol) açın ve bilgileri yapıştırın. İlgili ek bilgileri doldurun.

4. Veri toplama

NOT: Veriler gözetimsiz modda toplanır ve XChem/beamline ekibi tarafından yönetilir.

1. Yanlış merkezlenmiş örneklerin hatırlanması.
   NOT: Bunlar, büyük olasılıkla pimler doğru şekilde ortalanmadığında ortaya çıkan belirli örnekler için veri toplamayla ilgili sorunlar olduğunda gereklidir.
   1. ISPyB'deki örnek değiştirici görünümüne bakın, örnekleri yeşilden kırmızıya bir renk derecelendirmesinde otomatik olarak işlenen çözünürlüğe göre derecelendirmek için AP'ye göre sırala'yı seçin.
   2. Kırmızı veya sarı numune olup olmadığını kontrol etmek için numunelere tıklayın.
      NOT: Bu, veri toplamayı getirecektir.
   3. Kristalin ortalanıp ortalanmadığını görmek için kristal anlık görüntülerini kontrol edin.
   4. Merkezlenmemiş olanları not edin ve eksik örnekleri toplayacak olan yerel kişiye gönderin.

5. Veri analizi

1. Diamond'ın otomatik işleme sonuçlarını XChemExplorer (XCE)²⁵ aracılığıyla alma ve analiz etme.
   1. Bir terminalde Alt Klasöre gidin İşleme: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing veya XChem BAG'ler için: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
   2. XChemExplorer'ı açmak için xce takma adını kullanın.
   3. Tabloları Veri Kaynağından Güncelleştir düğmesini seçin.
   4. Genel Bakış sekmesinin altında, deneysel verilerin bir özeti vardır. Veri Kaynağı menüsündeki Gösterilecek Sütunları Seç seçeneğiyle ek kategoriler ekleyin.
   5. Ayarlar sekmesi altında, veri toplama dizinini seçin (/dls/i04-1/data/year/visit/).
   6. Veri Kümeleri sekmesini açın, Hedef Seç açılır menüsünden hedefi seçin, Veri KümelerindenOtomatik İşlemeden Yeni Sonuçlar açılır menüsünden seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: XCE artık otomatik işleme sonuçları için veri toplama ziyaretini ayrıştıracaktır. Bu, ayrıştırılan veri kümelerinin/dizinlerin sayısına bağlı olarak ilk kez çalıştırıldığında biraz zaman alabilir.
   7. Çözünürlüğü, alan grubunu ve Rmerge'yi kontrol ederek verilerin tutarlılığını ve kalitesini kontrol edin. 2,8 şçözünürlükten düşük verileri hariç tutun.
      NOT: Varsayılan olarak, veri kümesi seçimi I/sigI'den hesaplanan bir puana, eksiksizliğe ve benzersiz yansıma sayısına dayanır, ancak diğer işleme sonuçları kullanım için seçilebilir²⁵.
   8. Tek tek veri kümeleri için farklı bir işleme sonucu seçmek için, tercih edilirse, Örnek Kimliği'ne tıklayın ve istediğiniz programı/çalıştırmayı seçin. Tüm veri kümelerinin işleme işlem hattını değiştirmek için Tercihler menüsünden Tercihleri düzenle'yi seçin ve Veri Kümesi Seçim Mekanizması'nı değiştirin.
   9. Gerekirse, verileri ISPyB³⁷ aracılığıyla yeniden işleyin.
   10. Bir örnek için işlenmiş veri kabul edilebilir değilse, daha fazla analizden hariç tutulamadı olarak etiketleyin.
   11. Tamamlandığında, sonraki tablolara veri eklemek için Veri Kaynağından Tabloları Güncelleştir'e tıklayın.
2. DIMPLE³⁸ kullanarak ilk haritaların hesaplanması.
   1. Haritalar sekmesini açın, açılır menüden referans modeli seçin ve istediğiniz veri kümelerini ve ardından seçili MTZ dosyalarında DIMPLE Çalıştır'ı seçin.
   2. XCE, Diamond'daki kümede aynı anda çok sayıda DIMPLE işi çalıştırır. Dimple Status sütunu altında bu işlerin durumunu bulun ve Veri Kaynağından Tabloları Güncelleştir düğmesini veya Linux'ta qstat komutunu kullanarak yenileyin.
   3. Tamamlandığında, Dimple Rcryst, Dimple Rfree ve Space Group değerlerinin kabul edilebilir olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse (yüksek Rfree/yanlış alan grubu/birim hücre hacminde büyük fark), otomatik işleme sonuçlarını daha önce açıklandığı gibi değiştirin ve bu veri kümeleri için harita oluşturmayı tekrarlayın.
3. Grade³⁹, AceDRG⁴⁰ veya phenix.eLBOW⁴¹ kullanarak ligand kısıtlamaları oluşturma.
   1. İstediğiniz programı seçin (Tercihler, Tercihleri düzenle, Kısıtlama oluşturma programı) ve ardından Haritalar sekmesi altında veri kümelerini seçin ve ardından Haritalar ve Kısıtlamalar açılır menüsünden SEÇİLEN bileşiklerin CIF/PDB/PNG dosyasını oluştur'u çalıştırın.
   2. Veri Kaynağından Tabloları Güncelleştir düğmesini kullanarak Bileşik Durum sütunu altında bulunan bu işlerin durumunu yenileyin.
4. Temel durum modelini oluşturma (Çalıştırma öncesi)
   NOT: Temel durum modeli terimi, 100 veri kümesinde gözlemlendiği gibi, proteinin yapısını ligand içermeyen formunda temsil eder (bu sayı keyfi olarak seçilir). Temel durum modeli, ligand-bağlı durum oluşturmak için referans olarak kullanıldığından, tüm parça tarama kampanyasının analizinden önce tüm çözücü ve su molekülleri dahil olmak üzere doğru bir temel durum modeli oluşturmak çok önemlidir. Bu adımda, PanDDA tarafından ilginç olaylardan yoksun (ve dolayısıyla muhtemelen ligand içermeyen) olarak işaretlenen en yüksek çözünürlüklü yüz veri kümesi, temel durum ortalama haritasını oluşturmak için kullanılırken, iyileştirme için en düşük R_serbest olan veri kümesi seçilir. Temel durum ortalama haritası kristalografik bir harita değildir, ancak bu haritayı yalnızca temel durum modelinin oluşturulması için kullanmak önemlidir.
   1. PanDDA sekmesini açın ve gerekirse tabloları veri kaynağından güncelleştirin.
   2. Çıktı Dizinini (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas) tanımlayın.
   3. Ground State Model için Pre-run'ı seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Yüksek Rfree ve beklenmeyen alan gruplarına sahip veri kümeleri otomatik olarak analizden çıkarılmalıdır.
   4. Yüksek Rfree ve beklenmeyen alan gruplarına sahip veri kümelerini el ile dışlamak için Tamamen Yoksay'ı seçin.
   5. Terminal penceresinde qstat kullanarak çalıştırma öncesi işin durumunu kontrol edin.
   6. Tamamlandığında, Temel durum modeli oluştur'u seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Bu, Coot kullanarak yeniden modelleme ve iyileştirme için en iyi kalite veri kümesinden PanDDA ortalama haritası ve bir referans modeli/2Fo-Fc/Fo-Fc haritaları ile Coot'u açacaktır. Modelleme için sadece PanDDA ortalama haritasının kullanılması son derece önemlidir.
5. PanDDA²⁶ kullanarak isabetleri belirleme
   1. PanDDA analizi
      NOT: Çok sayıda veri kümesi varsa, birim hücresi büyükse ve asimetrik birimde proteinin birden çok kopyası varsa, kümede çalışması biraz zaman alabilir.
      1. DLS Otomatik İşleme Sonuçlarını Analiz Etme ve İlk Harita Hesaplama için daha önce açıklanan adımları tekrarlayın. Harita hesaplaması için temel durum modelini referans olarak kullanın: Referans Dosya Listesini Yenile > Yeni Referans Ayarla ve yeni veriler için gerektiği gibi Ligand Kısıtlamaları oluşturun (adım 6.1-6.3).
      2. PanDDAs sekmesi altında, çıktı dizininin daha önce olduğu gibi ayarlandığından emin olun ve Hit Identification açılır menüsünden pandda.analyse komutunu çalıştırın.
      3. qstat komutunu kullanarak Linux terminalinde işin durumunu kontrol edin.
   2. PanDDA incelemesi - bağlama olaylarını kontrol etme/oluşturma
      1. XCE'deki PanDDAs sekmesi altında, PanDDA kontrol paneliyle Coot^42'yi açmak için Hit Identification açılır menüsünden pandda.inspect komutunu çalıştırın.
         NOT: pandda.inspect kontrol paneli, PanDDA istatistiklerinin bir özetini sağlar ve kullanıcıların bağlama olayları/siteleri arasında gezinmesine olanak tanır. Sonuçların bir özet HTML dosyası da oluşturulur ve inceleme sırasında HTML'yi Güncelle seçilerek güncellenebilir.
      2. Bir ligandı modellemek için, sınır durum modelinde herhangi bir değişikliği kaybetmemek için başka bir olaya gitmeden önce Ligand'ı Modelle Birleştir ve Modeli Kaydet'e tıklayın.
         NOT: Yalnızca güncellenen ve kaydedilen modeller daha sonraki bir aşamada iyileştirme için dışa aktarılacaktır.
      3. Bağlama olayına açıklama eklemek için Olay Yorumu alanını ve bağlama sitelerine açıklama eklemek için Site Bilgilerini Kaydet'i kullanın.
      4. Olay haritası ve modeliyle karşılaştırmak için yük ortalaması ve 2mFo-DFc haritaları (DIMPLE'dan).
         1. Tüm uygulanabilir ligandlar olay haritasına göre modellendikten, birleştirildikten ve kaydedildikten sonra pandda.inspect dosyasını kapatın.
   3. PanDDA ihracatı ve iyileştirilmesi
      NOT: Aşağıdaki PanDDA inceleme modelleri proje dizinine geri aktarılır ve ilk iyileştirme turu başlatılır. Şu anda XCE'deki PANDDA'lar sekmesi altında bunu yapmak için iki kullanılabilir işlem hattı vardır.
      1. YENİ/TÜMÜ/SEÇİLMİŞ PANDDA modellerini dışa aktarma , iyileştirme için bağlı ve ilişkisiz modellerin bir topluluğunu oluşturur ve Refmac⁴³ için doluluk kısıtlama parametreleri oluşturur.
         NOT: Topluluk modeli iyileştirme için kullanılacaktır, ancak yalnızca sınır durum modeli Coot'ta güncellenecek ve PDB'ye yatırılacaktır. Bu işlem hattı, düşük doluluk parçalarına ve protein modelinde önemli değişikliklere sahip veri kümeleri için en iyi şekilde kullanılır.
      2. YENİ/TÜM sınır durumu modellerini BUSTER ile iyileştirin, sınır durumunu yalnızca Buster ⁴⁴ ile iyileştirir.
         NOT: Bu en iyi protein modelinde minimum değişiklikle yüksek doluluklu ligandlar/veri kümeleri ile kullanılır.
6. İsabetleri hassaslaştırma (iyileştirme için seçilen tüm veri kümeleri artık İyileştirme sekmesinde görünür). Coot'u XCE İyileştirme kontrol paneliyle açmak için İyileştirme açılır menüsünden COOT - BUSTER İyileştirmeyi Aç veya COOT - REFMAC İyileştirmeyi Aç'ı seçin.
   1. Örnekleri Seç açılır menüsünden iyileştirilecek örneklerin durumunu seçin (genellikle 3 - iyileştirmede) ve GO'ya tıklayın.
      NOT: XCE kontrol paneli, bu kategori için veri kümelerinin sayısının bir özetini sağlar ve iyileştirme istatistiklerinin bir özetini sağlarken veri kümeleri arasında gezinmeye izin verir.
   2. XCE kontrol panelindeki ligand güvenine açıklama ekleyin: 0 - ligand yok - Parça bağlanmadı; 1 - Düşük Güven- Fragman muhtemelen ciltlenmiştir, ancak özellikle inandırıcı değildir; 2 - Doğru ligand, zayıf yoğunluk - Kullanıcı, parçanın bağlandığından emin, ancak doluluk oranı düşük/haritalarla ilgili bazı sorunlar var; 3 - Net yoğunluk, beklenmedik ligand- Haritalar, sağlanan kimyasal yapı ile ilişkili olmayan ligand bağlanmasını açıkça göstermektedir; 4 - Yüksek güven- Ligand açık bir şekilde bağlıdır.
   3. Bu aşamada modelde gerekli değişiklikleri yapın ve İyileştir düğmesini kullanarak daha fazla iyileştirme başlatın.
   4. Tüm arıtma döngülerinde çalıştırılan MolProbity⁴⁵ analizine erişmek için MolProbity Yapılacaklar Listesini Göster düğmesini kullanın.
   5. Gerekirse, İyileştirme Parametreleri düğmesini seçerek örneğin anizotropik sıcaklık faktörleri, ikiz veriler veya doluluk iyileştirmesi için iyileştirme parametreleri ekleyin.
      NOT: Veri işleme istatistikleri, XCE'de İyileştirme sekmesi altında da sağlanır ve Buster ardışık düzeniyle iyileştirme yapılırsa, MOGUL analizi⁴⁶ dahil olmak üzere Buster raporları sağlanır.
   6. İyileştirme işlemi sırasında ilerlerken veri kümesinin durumunu, hem İyileştirme sekmesinin altındaki ana XCE penceresinde hem de Coot XCE denetim panelinde değiştirin. Modelin ligand çevresinde doğru olduğundan ve daha fazla analiz için paylaşılmaya uygun olduğundan emin olduğunuzda, durumu CompChem Ready olarak değiştirin. İyileştirme tamamlandığında ve model PDB'ye yüklenmeye hazır olduğunda, durumu Biriktirme hazır olarak değiştirin.

6. Verilerin yatırılması

NOT: Bir parça ekranından ve PanDDA olay haritalarını oluşturmak için kullanılan temel durum modelinden alınan tüm veri kümeleri, grup biriktirmeleri kullanılarak PDB'ye yerleştirilebilir.

1. İsabet Tanımlama menüsünden Event Map ->SF komutunu çalıştırarak tüm PanDDA olay haritalarını MTZ formatına dönüştürün.
2. Bilgileri Biriktirme > Düzenle'yi seçerek yazarlar ve yöntemler gibi ek meta veriler sağlayın. Gerekli tüm öğeleri doldurun ve Veritabanına Kaydet'e tıklayın ve ardından bu bilgileri temel durum modelinin biriktirilmesi için kaydedin. Bunu, model durumu Biriktirmeye Hazır olarak değiştirildikten sonra yapın.
3. Biriktirme sekmesinde, tüm Biriktirmeye Hazır veri kümeleri için yapı faktörü mmcif dosyaları oluşturmak üzere mmcif hazırla düğmesini seçin. Bu tamamlandığında terminal penceresinde aşağıdaki mesaj görünecektir: wwPDB Biriktirme için mmcif Dosyaları Hazırlanmaya Tamamlandı.
4. Tüm bu dosyaları ziyaretin Grup Biriktirme Dizinindeki tek bir bziplenmiş tar arşivine kopyalamak için mmcif'i kopyala düğmesini seçin.
5. https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit'e gidin; Kullanıcı adı ile giriş yapın: GroupTester ve şifre: !2016RCSBPDB. Bir oturum oluşturun ve grup biriktirme dizininden ligand-bound.tar.bz2 dosyasını yükleyin.
6. Ligand'a bağlı yapıların başarılı bir şekilde gönderilmesinden sonra, PDB kodlarını içeren bir e-posta gönderilir. Biriktirme menüsünden DB'yi PDB Kodlarıyla Güncelle'yi seçin; Bu e-postadaki bilgileri kopyalayıp açılır pencereye yapıştırın ve PDB ID'leri eklemek için Veritabanını Güncelle'ye tıklayın.
7. PanDDA tarafından kullanılan temel durum modelini yatırmak için, XCE'de ilgili PanDDA dizinini seçin ve Hit Identification menüsünden apo->mmcif komutunu çalıştırın.
   NOT: XCE, biriktirme paketi için model olarak düşük Rfree'ye sahip yüksek çözünürlüklü bir yapıyı keyfi olarak seçecek ve ardından tüm yapı faktörü mmcif dosyalarını tek bir dosyada derleyecektir.
8. Biriktirme sekmesinde, Temel Durum Modelinin Grup Biriktirmesi bölümünün altındaki Veritabanına Ekle düğmesini seçin.
9. Temel durum modeli için meta verileri girin (yine Biriktirme > Bilgileri Düzenle'yi seçerek), önceki dosyayı yükleyin ve Veritabanına Kaydet'i seçin.
10. Temel Durum Modelinin Grup Biriktirme bölümünden mmcif Hazırla komutunu çalıştırarak temel durum mmcif dosyasını hazırlayın ve tamamlandığında, aynı bölümden mmcif Kopyala düğmesini seçerek mmcif dosyasını Grup Biriktirme dizinine kopyalayın.
11. Daha önce olduğu gibi, https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit'a gidin; Kullanıcı adı ile giriş yapın: GroupTester ve şifre: !2016RCSBPDB. Bir oturum oluşturun ve ground_state_structures.tar.bz2 dosyasını grup biriktirme dizininden yükleyin.

Sonuçlar

X-Işını kristalografisi ile parça taraması için XChem boru hattı, bilimsel topluluk tarafından benimsenmesini sağlayacak şekilde kapsamlı bir şekilde düzenlenmiştir (Şekil 5). Bu süreç, isabet oranı %1 ile %30 arasında değişen 150'den fazla tarama kampanyasında47,48,49,50,51,52 ve birçok tekrar eden kullanıcı tarafından doğrulanmıştır. Uygun olmayan (düşük çözünürlüklü, kristalleşme veya kırınım kalitesinde tutarsız) veya DMSO veya etilen glikolü tolere edemeyen kristal sistemler, işlemin erken aşamalarında elimine edilerek zamandan, emekten ve kaynaktan tasarruf edilir. Başarılı kampanyalar, hedef protein üzerindeki potansiyel etkileşim bölgelerinin üç boyutlu bir haritasını sağlar; tipik bir sonuç, SARS-CoV-2'nin ana proteazının XChem ekranıdır (Şekil 6). Tipik olarak, fragman isabetleri şurada bulunur: (a) enzim aktif bölgeleri ve alt cepler⁴⁸ gibi bilinen ilgi alanları; (b) varsayılan allosterik bölgeler, örneğin, protein-protein etkileşimlerinde⁵³; (c) genellikle yanlış pozitifler olarak kabul edilen kristal paketleme arayüzleri (Şekil 6). Bu yapısal veriler genellikle parça isabetlerini kurşun benzeri küçük moleküller halinde birleştirmek, bağlamak veya büyütmek için bir temel sağlar ^1,3.

Şekil 1: XChem işlem hattı. Platform, proje teklifinden numune hazırlama, veri toplama ve isabet tanımlamaya kadar şematik olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tarama stratejisi. İş akışı, her kilometre taşının amacını, denemenin gereksinimlerini ve karar noktalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Numune hazırlama iş akışı. Numune hazırlama için kritik adımlar, her adımdan elde edilen bilgilerin bir SQLite veritabanına kaydedilmesiyle temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: XCE kullanarak veri analizi. Veri analizindeki kritik adımlar, ilgili yazılım paketleriyle birlikte bir iş akışı şeması ile temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: XChem kullanıcı programının evrimi: Grafik, 2019'da BAG'lerin oluşturulmasıyla 2015'ten 2019'a kadar kullanıcı programının alımını ve konsolidasyonunu ve 2020'de COVID-19 salgını boyunca platformun dayanıklılığını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: XChem parça ekranının temsili sonuçları. SARS-CoV2 ana proteaz (M^pro) dimer, yüzeyde sarı renkle gösterilen aktif bölge isabetleri, macenta ile gösterilen varsayılan allosterik isabetler ve yeşil renkle gösterilen yüzey/kristal paketleme artefaktları ile temsil edilir. Şekil, G_1002156 grup ifadesinden Chimera ve M^pro PDB girişleri kullanılarak yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu yazıda özetlenen süreç, kullanıcı topluluğu tarafından kapsamlı bir şekilde test edilmiştir ve burada açıklanan protokollerin uyarlanabilirliği, platformda tipik olarak karşılaşılan çok çeşitli projelerin ele alınmasının anahtarıdır. Bununla birlikte, kristal sisteminin birkaç ön koşulu gereklidir.

X-ışını kristalografisi kullanılarak gerçekleştirilen herhangi bir parça tarama kampanyası için, tekrarlanabilir ve sağlam bir kristal sistemi kritik öneme sahiptir. Standart XChem protokolü, parçanın doğrudan kristal damlasına eklenmesini içerdiğinden, optimizasyon, toplam kristal sayısından ziyade yüksek kaliteli kristaller içeren damla sayısına odaklanmalıdır. Damlalar birden fazla kristal içeriyorsa, hasat sürecini hafifletebilseler de etkili bir şekilde gereksizdirler. Ayrıca, kristalizasyon protokolünün ana enstitüden sahadaki tesislere aktarılması zor olabilir. Bu genellikle en iyi şekilde tekrarlanabilir çekirdeklenmeyi teşvik etmek için kristal tohumlama kullanılarak elde edilir⁵⁴ ve bu nedenle, kullanıcıların protein ve kristalizasyon çözümleriyle birlikte tohum stokları sağlamaları iyi bir uygulamadır.

İyi bileşik çözünürlüğü ve desteği sağlamak için, zayıf parçaların bağlanmasını sağlamayı amaçlayan yüksek ıslatma konsantrasyonları, parça kitaplıkları organik çözücülerde, özellikle DMSO ve etilen glikolde sağlanır. İki farklı çözücünün sağlanması, kullanıcılara DMSO'yu hiç tolere etmeyen veya ilgilenilen bir bölgedeki parçaların bağlanmasını engellediği kristaller için bir alternatif sunar. Kullanıcılar sulu tamponda alternatif kütüphaneler sağlayabilir: bileşikler, tamamen çözünmeleri ve sıvı dağıtım robotuyla uyumlu plakalarda biçimlendirilmeleri koşuluyla iyi bir şekilde dağılacaktır.

Hem kütüphaneyi çözündürecek hem de kristal sistemi tarafından tolere edilecek uygun bir organik çözücü bulmanın mümkün olmadığı projeler için alternatif bir prosedür, BESSY^55'te belirtildiği gibi kurutulmuş bileşiklerin kullanılmasıdır.

Toplulukta, bileşikleri yüksek tuz konsantrasyonları içeren kristalleşme koşullarında yetiştirilen kristallere batırabilme konusunda uzun süredir devam eden bir soru var. Pratik olarak, hasat aşamasında bileşiklerin daha fazla çökelmesi ve hızlı tuz kristalleri oluşumu gözlenir, bu da hasat alanının etrafına nemli bir ortam uygulanarak azaltılır. Genel olarak, kristal sistemlerde yüksek tuz kristalleşme koşullarından tarama kampanyaları, düşük tuz koşullarıyla karşılaştırılabilir bir isabet oranı verir.

XChem sürecinin ilk aşamaları (solvent tolerans testi ve ön eleme) nispeten küçük ölçekli ve hızlı deneylerdir, ancak proje için net bir karara izin verir. En acı verici olanı, hiçbir çözücü tolere edilmezse veya ön ekran çok düşük bir isabet oranıyla sonuçlanırsa alternatif kristal sistemlerin bulunması gerekecektir. Buna karşılık, başarılı olurlarsa, sonuçlar tarama deneyi için kullanılacak ıslatma koşulunu ve veri toplama için en iyi stratejiyi doğrudan bilgilendirir. Verilerin kalitesi, özellikle çözünürlük, isabet tanımlama ve analizi için elektron yoğunluğunun kalitesini etkileyeceğinden, amaç, kırınım kalitesi üzerinde zararlı bir etkisi olmayan mümkün olan en yüksek bileşik konsantrasyonuna batırmaktır (veri kümelerinin çoğunluğu (~% 80) 2.8 şveya daha iyi bir çözünürlüğe kırınım).

Veri analizi süreci, zayıf bağlayıcıların tespiti için PanDDA yazılımına dayanan ve kullanıcıların tarama kampanyasının sonuçlarını hızlı bir şekilde görselleştirmesine ve gözden geçirmesine olanak tanıyan XChemExplorer içinde kolaylaştırılmıştır. XChemExplorer, Diamond'da bulunan paketlerden (DIALS¹⁶, autoPROC³⁰, STARANISO³¹ ve Xia2¹⁴) veri işleme sonuçlarını, her paket için standart yöntemle belirlenen çözünürlük sınırlarıyla (yani, CC1/2 = 0.3) içe aktarır. Varsayılan olarak, veri kümesi seçimi I/sigI, tamlık ve bir dizi benzersiz yansımadan hesaplanan bir puana dayanır, ancak hem genel olarak hem de tek tek örnekler için kullanım için belirli işleme sonuçları seçilebilir²⁵. Veriler ayrıca çözünürlük, R'siz ve referans ve hedef veriler arasındaki birim hücre hacmindeki fark (varsayılanlar sırasıyla 3,5 Å, 0,4 ve %_12'dir) gibi kriterlere dayalı olarak PanDDA tarafından analizden hariç tutulur, böylece zayıf kırılan, yanlış merkezlenmiş veya yanlış indekslenmiş kristaller analizi etkilemez.

PanDDA algoritması, standart kristalografik haritalarda görünmeyen kısmi doluluk ligandlarını tespit etmek için bir parça kampanyası sırasında toplanan önemli sayıda veri kümesinden yararlanır. Başlangıçta PanDDA, solvent tolerans testi ve ön eleme adımları sırasında toplanan verileri, daha sonra bir temel durum modeli oluşturmak için kullanılan bir ortalama yoğunluk haritası hazırlamak için kullanır. Bu model sonraki tüm analiz adımları için kullanılacağından, fragman ekranı için kullanılan koşullar altında ligandlanmamış proteini doğru bir şekilde temsil etmesi hayati önem taşır. PanDDA daha sonra bağlı ligandları tanımlamak için istatistiksel bir analiz kullanır ve kristalin bağlı durumu için bir olay haritası oluşturur. Kristalin bağlanmamış fraksiyonunun kısmi doluluk veri kümesinden çıkarılmasıyla bir olay haritası oluşturulur ve ligand tam dolulukta bağlansaydı ne gözlemleneceğini sunar. Konvansiyonel 2mF_{o-DF c} haritalarında net görünen parçalar bile, olay haritalarına başvurulmazsa yanlış modellenebilir³². PanDDA, ortalama haritalardan (genellikle parça bağlamanın göstergesidir) farklı veri kümelerini tanımlamak için güçlü bir yöntem olsa da ve iyileştirme sırasında RSCC, RSZD, B-faktör oranı ve RMSD gibi ölçümler kullanıcıların yararına sağlanırken, gözlemlenen yoğunluğun beklenen ligandı ve en uygun konformasyonu doğru bir şekilde gösterip göstermediğine karar vermekten nihai olarak kullanıcı sorumludur.

Veri analizi ve iyileştirmenin ardından, tüm kullanıcıların XChemExplorer kullanarak Protein Veri Bankası'na (PDB) aynı anda birden fazla yapı yatırması mümkündür. Her parça ekranı için iki grup biriktirme yapılır. İlk biriktirme, MMCIF dosyalarına dahil edilen PanDDA olay haritalarını hesaplamak için katsayılarla birlikte tüm parçaya bağlı modelleri içerir. İkinci biriktirme, deneyin tüm veri kümelerinin ölçülen yapı faktörleri boyunca eşlik eden temel durum modelini sağlar: bu veriler PanDDA analizini yeniden üretmek ve gelecekteki algoritmaları geliştirmek için kullanılabilir. Vuruşların yapılarına gelince, parça doluluğu düşük olduğunda, modeller ligand'a bağlı ve kafa karıştırıcı zemin durum yapılarının bir bileşimi ise, arıtma daha iyi davranır³²; Bununla birlikte, uygulama sadece sınır durum kesirlerini biriktirmektir, çünkü tam bileşik modeller genel olarak karmaşıktır ve yorumlanması zordur. Sonuç olarak, PDB tarafından yeniden hesaplanan bazı kalite göstergeleri (özellikle R/Rfree) bazen biraz yükselir. Zenodo⁵⁶ gibi platformları kullanarak tüm ham verileri sağlamak da mümkündür, ancak bu şu anda XChem boru hattı tarafından desteklenmemektedir.

Genel olarak, 2016'daki operasyonundan bu yana, bu prosedür kullanılarak hedeflerin %95'inden fazlasında fragman ligandları tanımlanabildi. XChem'in desteklediği birçok projeden elde edilen deneyim, kristal hazırlama³³ için en iyi uygulama haline getirilirken, parça ilerlemesine yardımcı olmak için hazır konsepti^{uygulayan bir parça kitaplığı geliştirildi 29} ve aynı zamanda kitaplık kompozisyonunu halka açık hale getirme uygulamasının oluşturulmasına yardımcı oldu. Platform, burada ayrıntılı olarak açıklanan bakımlı altyapının ve belgelenmiş süreçlerin önemini gösterdi ve diğer parça kitaplıklarını^{değerlendirmeyi 57,58}, kitaplıkları karşılaştırmayı⁴⁸ ve işbirlikçi EUOpenscreen-DRIVE kitaplığının^{tasarımını bilgilendirmeyi mümkün} kıldı ^59,60.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSI-poised library	Enamine	DSI-896	fragment library
Echo 550 and 650 series	Beckman-Coulter		acoustic dispensing system
Echo microplates	Beckman-Coulter	001-12380; 001-8768; 001-6025	1536-well and 384-well microplates
Shifter	Oxford Lab Technology		harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor	Sigma	model 11121	microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates	Swissci	3W96T-UVP	Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software	Formulatrix		Crystallisation plates imaging device