التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

Summary

هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.

Abstract

وقد استخدم التثبيت الكيميائي لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا يحافظ هذا الأسلوب بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا؛ وعادة ما يلاحظ القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع هو بديل أفضل للحفاظ على بنية الخلية. وقد استخدمت تجميد شطيرة من الخميرة الحية أو البكتيريا تليها تجميد استبدال لمراقبة ultrastructure الطبيعية الرائعة من الخلايا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تجميد ساندويتش الخلايا المستزرعة الثابتة بالجلوتارالدهيد أو الأنسجة البشرية للكشف عن البنية الفائقة للخلايا والأنسجة.

وقد أجريت هذه الدراسات حتى الآن باستخدام جهاز لتجميد السندويشات المصنوع يدويا، وكانت التطبيقات المقدمة للدراسات في مختبرات أخرى محدودة. وقد تم مؤخرا جهاز تجميد شطيرة جديدة ملفقة ومتاحة الآن تجاريا. وتبين هذه الورقة كيفية استخدام جهاز تجميد الساندويتشات للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع وإجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات بأحلام الدعم.

Introduction

المجهر الإلكتروني هو أداة قوية لدراسة البنية الفوقية للخلايا. وقد استخدم التثبيت الكيميائي مع إجراءات الجفاف التقليدية لمراقبة البنية الفوقية للخلايا والأنسجة. ومع ذلك، لا تحافظ هذه الطريقة بشكل كاف على البنية الفوقية للخلايا، وعادة ما يتم ملاحظة القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلية. التجميد السريع واستبدال تجميد الخلايا والأنسجة هي بدائل أفضل للحفاظ على بنية الخلية.

وقد استخدمت ثلاث طرق رئيسية لتجميد الخلايا بسرعة¹: 1) يتم تنفيذ يغرق تجميد العينات في cryogen تبريد, مثل البروبان, واستخدمت منذ أوائل 1950s²; 2) يتم إجراء تجميد كتلة معدنية باردة من قبل الخلايا والأنسجة انتقد بسرعة على كتلة معدنية تبريدها مع النيتروجين السائل أو الهيليوم السائل^3،4؛ و 3) ويتم تجميد الضغط العالي عن طريق تجميد الخلايا والأنسجة مع النيتروجين السائل تحت ضغط عال^5،6،7.

تجميد الساندويتش هو نوع من تجميد الغطس الذي تقوم به sandwiching المواد البيولوجية رقيقة بين اثنين من الأقراص النحاس وتجميد بسرعة لهم عن طريق الغطس في البروبان السائل^8،9،10. في هذه الطريقة ، يتم تبريد العينات الرقيقة جدا (سمكها بضعة ميكرومترات) بسرعة مع cryogen باستخدام معدن يحتوي على الموصلية الحرارية الجيدة من كلا الجانبين. وهكذا، فإن هذه الطريقة تزيل الحرارة بشكل فعال من العينات، مما يجعل من الممكن تجميد الخلايا بشكل ثابت دون تلف بلوري جليدي. تجميد الشطائر، يليه تجميد استبدال الخميرة الحية والخلايا البكتيرية، ويكشف عن البنية الفائقة الطبيعية للخلايا^{10،11،12،13،14،15،16}.

في الآونة الأخيرة، تم العثور على هذه الطريقة لتكون مفيدة للحفاظ على صور الخلايا واضحة من الكائنات الحية الدقيقة glutaraldehyde الثابتة^{17،18،19،20،21،22،23،24}، الخلايا المستزرعة^25،26،27، والخلايا والأنسجة البشرية^1،28 . على الرغم من أن هذه الدراسات قد أجريت باستخدام جهاز تجميد شطيرة مصنوعة^{يدويا 29}، وكانت التطبيقات لدراسات أخرى في مختبرات أخرى محدودة ، فقد تم تصنيع جهاز تجميد ساندويتش جديد (SFD)²⁸ وهو متاح الآن تجاريا.

وتبين هذه الورقة كيفية استخدام SFD للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية والفيروسات. كما يظهر إعداد عينات للتقطيع فائقة بعد التجميد السريع ، وكذلك إجراءات استبدال التجميد ، وتضمين الراتنج ، وتقليم الكتل ، وقطع الأجزاء فائقة التقنية ، واستعادة المقاطع ، والتلطيخ ، وتغطية الشبكات مع أفلام الدعم.

Protocol

ملاحظة: وافقت لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية التابعة لكلية الدراسات العليا للطب، جامعة شيبا (3085) على بروتوكول الدراسة الخاص بالعينات البشرية. 2- إن التيتروكسيد أوزميوم مادة كيميائية خطيرة؛ وينبغي التعامل معها ارتداء قفازات في غطاء محرك السيارة الدخان. الشكل 1 يظهر جهاز تجميد شطيرة والأدوات اللازمة²⁸. ويبين الشكل 2 المواد اللازمة لإجراء تجارب تجميد الشطائر. تمتلئ قارورة الزجاج مع الأسيتون التي تحتوي على tetroxide osmium والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (الشكل 2B). الأقراص النحاسية هي 3 ملم في القطر، مع عدم وجود ثقوب، لديها حرف على جانب واحد، وتتوفر تجاريا(الشكل 2C).

1. التجميد السريع لتعليق الخلايا من أجل استبدال التجميد

ملاحظة: يظهر الإجراء بأكمله في الشكل 3.

1. خلايا
   1. استخدام تعليق الخلية من البكتيريا والخميرة (الشكل 2A)، والخلايا المستزرعة، والخلايا المعزولة لتجميد شطيرة.
      ملاحظة: يمكن استخدام كل من الخلايا الحية والغلوتارالدهيد الثابتة²⁸.
2. إعداد البروبان السائل
   ملاحظة: استخدام cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. وبما أن البروبان متفجر، ينبغي الحرص على عدم استخدام الحرائق في نفس الغرفة، وينبغي إبقاء النوافذ مفتوحة.
   1. ملء حاوية النيتروجين السائل من SFD مع النيتروجين السائل (الشكل 4A). ملء حاوية البروبان السائل مع البروبان السائل عن طريق إدخال غاز البروبان باستخدام فوهة غرامة (الشكل 4B، C). تسريع تماسك البروبان باستخدام شريط معدني تبريد (الشكل 1 والشكل 4D، ه).
3. إعداد أقراص النحاس
   1. وضع أقراص النحاس على زجاج الشريحة مع عدم وجود حرف الجانب لأعلى (الشكل 2D) وعلاج مع توهج التفريغ في 10 السلطة الفلسطينية، 400 فولت، 1 مأ لمدة 30 ق (الشكل 4F،G) لجعل سطح القرص hydrophilic باستخدام جهاز بصق أيون³⁰.
4. شطيرة وتجميد يغرق من تعليق الخلية
   1. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل (الشكل 5A) والطرد المركزي في 2,900 × غرام لمدة 10 ق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 5B, C). إزالة supernatant، وتعليق بيليه للحصول على تعليق سميكة (انظر المناقشة).
   2. ضع كمية صغيرة من تعليق الخلية (~ 0.02 ميكرولتر) على قرص نحاسي(الشكل 5D-F)،قم بتغطيتها بقرص نحاسي آخر(الشكل 5G)،والتقط الأقراص باستخدام ملاقط(الشكل 5H).
      ملاحظة: لقياس ~ 0.02 ميكرولتر من تعليق الخلية، لاحظ 0.1 قطرات μL من التعليق تحت المنظار المجسم وتقسيمها إلى قطرات التي هي^1/5th من هذا الحجم.
   3. جعل بئر في وسط البروبان الصلبة مع شريط معدني رقيقة (الشكل 5I). تعيين ملاقط في SFD وتجميدها بسرعة عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز (الشكل 5J، ك).
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم تجفيف العينات وعدم وضع القرصين تماما فوق بعضهما البعض (وإلا، فإن فصلها سيصبح صعبا جدا في الخطوة التالية).
5. شطيرة وتجميد الأنسجة الحيوانية والبشرية
   1. استخدام الأنسجة الحيوانية والبشرية (~ 0.5 مم × 0.5 مم × 1.5 مم) ثابتة في 2.5٪ غلوتارالدهيد-0.1 متر عازل فوسفات (الرقم الحموضة 7.4) (الشكل 6A، B). شريحة لهم في 0.1- إلى 0.2- مقطع سميك مم مع شفرة حلاقة تحت مجسم(الشكل 6C,D).
      1. ضع قطرة صغيرة (~ 0.02 ميكرولتر) من محلول الجلوتارالدهيد على قرص نحاسي(الشكل 6E، F). ثم استخدم الملاقط لوضع قطعة من الأنسجة في الجلوتارالدهيد على القرص النحاسي(الشكل 6G، H) وتغطيتها بقرص نحاسي آخر(الشكل 6I-K).
      2. تجميد بسرعة الأقراص مع الأنسجة في البروبان ذوبان SFD، كما هو موضح في القسم 1.4(الشكل 5J،K).
         ملاحظة: كما glutaraldehyde مادة كيميائية خطيرة، ينبغي التعامل معها ارتداء قفازات في غطاء محرك السيارة الدخان. لا ينبغي غسل الأنسجة مع المخازن المؤقتة عند وضعها على قرص نحاسي ولكن أبقى غارقة في محلول الجلوتارالدهيد لأن الجلوتارالدهيد له تأثير مضاد^{للتجميد 1}.
6. تجميد استبدال مع أسيتون أوسميوم
   1. نقل الأقراص إلى النيتروجين السائل في حمام عمل (الشكل 7A، ب). باستخدام زوج من ملاقط تبريد في النيتروجين السائل، فصل الأقراص من بعضها البعض لفضح العينة (الشكل 7C-E).
   2. ضع الأقراص مع الخلايا في قارورة زجاجية(الشكل 7F)التي تمتلئ 1 مل من الأسيتون تحتوي على 2٪ من التيتروكسيد osmium (الشكل 2B) التي تم وضعها في النيتروجين السائل وseded (الشكل 4H).
   3. نقل الأقراص إلى الفريزر العميق والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام لتجميد استبدال الخلايا (الشكل 3). نقع ملاقط المستخدمة في الماء في درجة حرارة الغرفة لتدفئتها (الشكل 7G) لتجميد العينات التالية.
      ملاحظة: يجب أن تكون ملاقط للتعامل مع العينة دافئة (درجة حرارة الغرفة) لأن الملاقط الباردة قد تجمد العينة قبل التجميد السريع ، مما يؤدي إلى تكوين بلورات الثلج.
7. عينة الاحترار والتضمين
   1. جلب تدريجيا العينات إلى درجة حرارة الغرفة (2 ساعة في -20 درجة مئوية، 2 ساعة في 4 درجة مئوية، و 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الشكل 3 والشكل 8A)،ونقل الأقراص إلى أنابيب بلاستيكية 2 مل التي تمتلئ 1 مل من الأسيتون (الشكل 3 والشكل 8B، C).
   2. إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق خلط الكواشف في حاوية بلاستيكية يمكن التخلص منها باستخدام ستيرر(الشكل 8D-F).
   3. تبادل الأسيتون في الخطوة 1.7.1 على التوالي مع 30٪ الراتنج (في الأسيتون)، 60٪ الراتنج، و 90٪ الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لكل منهما. ثم تبادل الراتنج 90٪ مع 100٪ الراتنج في 37°C بين عشية وضحاها. وأخيرا، تضمين العينات في راتنج 100٪ (الشكل 8G-J) في قالب تضمين السيليكون، وبوليمرة لهم في 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (الشكل 3).
      ملاحظة: يجب أن تظل العينات متصلة بالأقراص النحاسية طوال الإجراء بأكمله (لتسهيل عملية القسمة). لا ينصح باستخدام جهاز دوار أو اهتزاز أثناء عملية التضمين لأنها تساهم قليلا في اختراق الراتنج في الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن الاهتزاز من الجهاز يؤدي في بعض الأحيان العينات لفصل من الأقراص النحاسية. الحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها من شأنه أن يسرع اختراق الراتنج في الخلية بسبب الطاقة الحرارية (الراتنج لن يبوليمر لأنه لا يحتوي على أي مسرع).
8. تقليم كتل العينة
   1. إخراج كتل بلمرة من قوالب تضمين السيليكون (الشكل 9A). اكتب رقم العينة على الكتلة (الشكل 9B).
   2. إزالة أقراص النحاس من كتلة مع شفرة حلاقة (الشكل 9C، D) وتقليم العينات جزءا لا يتجزأ من سطح الكتلة إلى 0.7 ملم × 0.7 ملم باستخدام شفرة التشذيب بالموجات فوق الصوتية ( الشكل9E) وشفرات الحلاقة (الشكل 9F-H) تحت مجسم³¹.
   3. تعيين كتلة في حامل عينة من ultramicrotome (الشكل 9I) وقطع وجه كتلة بسلاسة مع سكين تقليم الماس (الشكل 9J، ك).
9. قطع أقسام فائقة النحافة
   1. إزالة كتلة من ultramicrotome (الشكل 10A)³¹، تعيينها في مجسم ، وتقليم مزيد من 0.2 ملم × 0.3 ملم مع شفرة حلاقة (الشكل 10B، C).
   2. تطبيق النيوبرين على الشبكات لجعلها لاصقة (الشكل 10D). تعيين كتلة مرة أخرى على ultramicrotome، وتغطية ultramicrotome مع غطاء من البلاستيك (الشكل 10E)³¹، وقطع 50-70 نانومتر سميكة أقسام (الشكل 10F-H).
   3. استرداد المقاطع باستخدام حلقة (الشكل 10I)، جبل لهم على 300 أو 400 شبكات النحاس شبكة تعامل مع النيوبرين، وتجفيفها (الشكل 10J).
10. تلطيخ المقاطع والمراقبة تحت المجهر الإلكتروني
    1. تعيين الشبكات مع أقسام في الأخدود من أنبوب سيليكون نصف (الشكل 11A)³¹، ونقع في محلول خلات أورانيل والرصاص سيترات لمدة 3 دقائق لكل لتلطيخ (الشكل 11B-E)³².
    2. للخميرة والعينات الفطرية، ووضع الشبكات على ورقة تصفية (4 ملم × 4 ملم)، والتقاطها مع ملاقط، وتغطيتها مع البلازما البوليمرات النفثالين فيلم³³ على سطح الماء (الشكل 11F،G). إدراج الشبكات في المجهر الإلكتروني ومراقبة في 100 كيلو فولت (الشكل 11H، I).

2. التجميد السريع للفيروسات والجزيئات الكلية

1. إعداد الإيثان السائل
   ملاحظة: استخدام cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. وبما أن الإيثان متفجر، ينبغي الحرص على عدم استخدام الحرائق في نفس الغرفة، وينبغي إبقاء النوافذ مفتوحة. يستخدم الإيثان لأنه يتبخر في المجهر الإلكتروني في حين أن البروبان لا يفعل ذلك.
   1. ملء حاوية النيتروجين السائل من SFD مع النيتروجين السائل. ملء حاوية الإيثان السائل مع الإيثان السائل عن طريق إدخال غاز الإيثان من خلال فوهة غرامة.
2. إعداد وتجميد سريع للشبكات الصغيرة والعينات
   1. جعل كلا الوجهين من hydrophilic microgrids عن طريق التعامل معها مع توهج التفريغ (10 السلطة الفلسطينية، 400 V، 1 MA) باستخدام جهاز بصق أيون³⁰.
   2. تعيين الشبكة الصغرى في SFD وتطبيق 2 ميكرولتر من الفيروس أو تعليق الجزيئية الكلية (1 ملغ البروتين / مل) على الشبكات الدقيقة. إزالة السائل الزائد باستخدام ورقة تصفية وتجميد بسرعة microgrid عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز.
3. وضع الشبكة الصغرى المجمدة في حامل نقل التبريد والمراقبة تحت المجهر الإلكتروني
   1. نقل الشبكات الدقيقة المجمدة في النيتروجين السائل، وضعت في حامل نقل التبريد تبريده في درجة حرارة النيتروجين السائل مسبقا، ومراقبة تحت المجهر الإلكتروني في درجة حرارة منخفضة³⁴.

النتائج

تم جمع الخلايا الحية من الكائنات الحية الدقيقة المعلقة عن طريق الطرد المركزي ، وتقع بين قرصين نحاسيين ، مجمدة بسرعة مع SFD ، بديل التجميد ، مضمنة في راتنج الايبوكسي ، مقطعة للغاية ، ملطخة ، ولوحظت تحت المجهر الإلكتروني باتباع الإجراءات المذكورة أعلاه. الشكل 12 يظهر أقسام فائقة من الإشريكية القولونية (البكتيريا، الشكل 12A، ب)¹⁶ وSaccharomyces cerevisiae (الخميرة، الشكل 12C)¹⁵. لاحظ أن الصور واضحة جدا وتظهر مورفولوجيا الطبيعية.

تم جمع تعليق الخلايا الثابتة الغلوتارالدهيدي للخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة وتجميدها بسرعة مع SFD ، واستبدال التجميد ، ومراقبتها تحت المجهر الإلكتروني باتباع الإجراءات المذكورة أعلاه. الشكل 13 يظهر أقسام فائقة من الخلايا المستزرعة (الشكل 13A-C)^1،28 والخلايا المعزولة من تجويف البطن الماوس ( الشكل13D)²⁸. الشكل 14 يظهر أقسام فائقة من الجلد البشري (الشكل 14A-D) ومعطف برتقالي ( الشكل14E)¹. لاحظ أن الصور هي أيضا واضحة جدا وتظهر مورفولوجيا الطبيعية. ويبين الشكل 15 الجسيمات الأساسية لفيروس التهاب الكبد B المجمدة بسرعة مع SFD ولاحظها المجهر الإلكتروني المبرد³⁴. كما هو الحال مع الخلايا الأخرى ، والصور واضحة جدا وتظهر مورفولوجيا الطبيعية.

الشكل 1: ساندويتش تجميد الجهاز²⁸ والأدوات اللازمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المواد اللازمة لإجراء تجارب تجميد شطيرة. (أ) عينة: ميكروجراف خفيف من Cerevisiae Saccharomyces (الخميرة). شريط المقياس = 10 ميكرومتر (B) قنينات زجاجية (10 مل) تحتوي على 1 مل من الأسيتون مع 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم. (C) أقراص نحاسية تظهر سطحا بدون حرف (يسار) وسطح بحرف (يمين). شريط المقياس = 3 مم. المسح المجهري الإلكتروني. (D)تم وضع أقراص النحاس مع عدم وجود حرف الجانب حتى على شريحة زجاجية مع شريط لاصق على الوجهين (*). شريط مقياس = 3 مم (E) شفرة حلاقة ذات حدين وشفرة حلاقة مكسورة ذات حدين لتقطيع الأنسجة الحيوانية والبشرية ، وشفرة حلاقة ذات حدين لتقليم الكتل ، ولوحة ممزقة لتقطيع الأنسجة الحيوانية والبشرية. (F) ملاقط مع رغوة البوليسترين مقذوف لحماية الأصابع من البرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:إعداد عينة من تعليق الخلية باستخدام طريقة تجميد شطيرة. الاختصارات: r.t. = درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تم صبإعداد البروبان السائل والأقراص النحاسية والمثبتة. (أ) النيتروجين السائل (السهم) في حاوية النيتروجين السائل لجهاز تجميد الساندويتش. (ب)تم إدخال غاز البروبان في حاوية البروبان السائل من خلال فوهة غرامة. (ج) البروبان السائل (السهم). (د)تم استخدام شريط معدني (السهم) لتبريد البروبان السائل لتسريع تماسك البروبان السائل. (ه) البروبان الصلب (السهم). (F) جهاز ion sputter (السهم) لصنع أقراص النحاس hydrophilic مع توهج التفريغ. (G) توهج التفريغ. (H) زجاج قوارير وضعت في النيتروجين السائل في حمام العمل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التجميد السريع لتعليق الخلية (الخميرة) باستخدام جهاز تجميد الساندويتش. (أ) نقل ثقافة الخميرة إلى أنبوب الطرد المركزي. (ب) أجهزة الطرد المركزي الدقيق. (ج) بيليه من Saccharomyces cerevisiae في أنبوب الطرد المركزي (السهم). (د)نقل العينة مع micropipette من أنبوب الطرد المركزي. (ه) وضع العينة على القرص النحاسي. (F)قطرة صغيرة من عينة على القرص النحاسي (السهم). (G) تغطي العينة مع قرص نحاسي آخر. (H) التقاط القرصين مع ملاقط. (I)صنع بئر في البروبان الصلبة باستخدام شريط معدني رقيقة. (J) يغرق تجميد العينة عن طريق الضغط على زر الحقن. (ك)التجميد كاملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6:إعداد عينة من الأنسجة البشرية (الجلد). (أ, ب) أنسجة الجلد البشري ثابتة في الجلوتارالدهيد في طبق بيتري. شريط مقياس = 5 مم (C، D) تم تقطيع الأنسجة (السهم) باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة ذات الحدين على لوحة ممزقة. (E, F) تم وضع قطرة صغيرة من محلول الجلوتارالدهيد (السهم) على قرص نحاسي. (G, H) تم وضع قطعة من أنسجة الجلد على القرص النحاسي باستخدام ملاقط. (I)تم استخدام قرص آخر لتغطية القرص النحاسي مع أنسجة الجلد. (J)تم التقاط الأقراص تقع مع ملاقط. (ك)عقدت الأقراص تقع بلطف مع ملاقط. لاحظ الفجوة بين نصائح ملاقط (السهم) الحفاظ عليها لتجنب سحق الأنسجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: نقل العينة إلى النيتروجين السائل وفصل الأقراص. (أ) نقل الأقراص (السهم) إلى النيتروجين السائل في حمام العمل. (ب) أقراص في النيتروجين السائل (السهم). (ج) تم وضع ملاقط في النيتروجين السائل لتبريدها في حمام العمل. (D, E) فصل الأقراص النحاسية (الأسهم) باستخدام ملاقط. (F) نقل القرص (السهم) إلى قارورة زجاجية مع ملاقط. (G) الاحترار ملاقط في الماء لتجميد العينة القادمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: عينة الاحترار والتضمين. (أ) عينات في قارورة زجاجية في درجة حرارة الغرفة. (ب)نقل الأقراص (السهم) إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل مع ملاقط. (ج) أقراص النحاس (السهم) في الأسيتون في أنبوب بلاستيكي. (د) قياس الراتنجات مع أنبوب الحقن (السهم). (ه)نقل الراتنج إلى كوب المتاح (السهم). (F) خلط الراتنج باستخدام ستيرر. (G) وضعت كمية صغيرة من الراتنج في ثقوب قالب سيليكون تضمين. (H) تمت إزالة الراتنج الزائد في الشبكات مع ورقة التصفية. (أنا, ي) وضعت أقراص النحاس مع عينات في الجزء السفلي من الثقوب من العفن تضمين مع الجانب عينة حتى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: تشذيب كتلة العينة. (أ) إخراج كتل بلمرة من قوالب تضمين. (ب)تم كتابة رقم العينة على الكتلة. (C, D) تمت إزالة القرص النحاسي من الكتلة باستخدام شفرة حلاقة. شريط مقياس ل (D) = 1 مم (E-G) تم تشذيب العينة بشفرة قطع بالموجات فوق الصوتية وشفرة حلاقة. شريط مقياس ل (G) = 1 مم (H) تكبير عالي من (G). نقطة مضيئة فردية هي خلية. تم تضمين الخلايا في طبقة واحدة¹⁰. شريط مقياس = 10 ميكرومتر. (I-K) تم قطع سطح الكتلة على نحو سلس مع سكين تقليم الماس. شريط المقياس ل (K) = 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: قطع الأقسام فوق البنفسجية. (أ) تمت إزالة كتلة العينة من microtome³¹. (ب, ج) تم تشذيب العينة بشكل أكبر بشفرة حلاقة. شريط مقياس ل (C) = 0.5 مم (D) تم تطبيق النيوبرين على الشبكات لجعلها عصا. (ه)غطت ultramicrotome مع البلاستيك لتجنب تدفق الهواء أثناء تقسيم ultrathin. (واو)امتلأ قارب سكين الماس بالماء. (G, H) تم قطع أقسام Ultrathin إلى سمك 70 نانومتر. شريط مقياس ل (H) = 1 مم (I, J) تم استرداد المقاطع باستخدام حلقة ثم جفت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: تلطيخ الأقسام. (أ) وضعت الشبكات في الأخدود من أنبوب سيليكون نصف. (ب) كانت غارقة في خلات أورانيل لتلطيخ. (ج)تم جمع خلات أورانيل المستخدمة على فيلم شمعي الختم الذاتي. (د)تم غسل الشبكات بطائرة مائية و (E) ثم نقعت في سترات الرصاص. (F) البلازما بلمرة النفثالين فيلم طرحت على الماء و (G) تستخدم لتغطية شبكة وضعت على 4 مم × 4 مم ورقة تصفية. (ح)وضعت الشبكة في حامل عينة و (I) لوحظ في المجهر الإلكتروني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 12: أقسام Ultrathin من الإشريكية القولونية (البكتيريا، A، B) وSaccharomyces cerevisiae (الخميرة، C). (أ)لاحظ أن العينات مضمنة بكثافة وتجانس ولا تظهر أي تشوه. (ب, ج) تظهر هياكل الأغشية مورفولوجيا واضحة وسلسة ، والريبوسومات واضحة بما يكفي بحيث يمكن تعداد كل جسيم^16. (ج)نواة الخميرة و vacuoles تظهر شكل دائرة حقيقية، والتي قد تكون مورفولوجيا الطبيعية. مصفوفة الميتوكوندريا يظهر مظهر الإلكترون الكثيفة، والتي قد تكون سمة من سمات الخلايا الحية التي يتم إصلاحها عن طريق التجميد السريع. أشرطة المقياس = 1 ميكرومتر. الاختصارات: CW = جدار الخلية; ER = الشبكية الإنتوبلازمية; NM = الغشاء النووي. NP = المسام النووية؛ OM = الغشاء الخارجي. PM = أغشية البلازما; R = ريبوسومات; N = النواة؛ M = الميتوكوندريا. (ب)مستنسخ من يامادا وآخرون¹⁶ بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 13: أقسام Ultrathin. (A-C) K562 الخلايا المستزرعة. (D) خلية سارية معزولة من الماوس. (أ)لاحظ أن العينات مضمنة بكثافة وتجانس ولا تظهر أي تشوه. مقياس شريط = 20 ميكرومتر (ب-D) في التكبير عالية، نواة، نيوكليولوس، الغشاء النووي، المسام النووية، reticulum endoplasmic، الميتوكوندريا، الريبوسومات، والحبيبات لوحظ بوضوح. أشرطة المقياس = 2 ميكرومتر (B)، 500 نانومتر (C)، 2 ميكرومتر (D). المختصرات: N = النواة؛ N = النواة؛ N = النواة= N = النواة= Nu = النيوكليولوس; NM = الغشاء النووي، NP = المسام النووية. ER = الشبكية الإنتوبلازمية; M = الميتوكوندريا; R = ريبوسومات; G = حبيبات; D = تقسيم الخلايا. (أ)مستنسخ من ياماغوتشي وآخرون¹ بإذن. (ب-د)مستنسخة من ياماغوتشي وآخرون²⁸ بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 14: ألتراثين أقسام. (أ-د) جلد الإنسان و (ه) معطف برتقالي. (أ-ه) لاحظ أن الأنسجة وصور الخلايا واضحة وطبيعية وتظهر تباينا جيدا ، على الرغم من أن الأقسام رقيقة جدا (50 نانومتر). مصفوفة الميتوكوندريا يظهر مظهر كثيف، وهو مشابه لتلك المصفوفات الميتوكوندريا الكثيفة من الخلايا الحية المجمدة بسرعة(D). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A، E)، 200 نانومتر (B-D). المختصرات: D = desmosomes; ER = الشبكية الإنتوبلازمية; K = الكيراتينوسي; KF = ألياف الكيراتين. M = الميتوكوندريا; N = النواة؛ NM = الغشاء النووي. P = الصفائح الدموية; R = ريبوسومات; W = خلايا الدم البيضاء. مستنسخة من ياماغوتشي وآخرون²⁸ بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 15:جسيمات فيروس التهاب الكبد B الأساسية (HBV) مجمدة بسرعة مع الإيثان السائل باستخدام جهاز تجميد الساندويتشات ولاحظها المجهر الإلكتروني المبرد. الجسيمات المجوفة الكروية هي جزيئات أساسية HBV. شريط المقياس = 100 نانومتر. المختصرات: HBV = فيروس التهاب الكبد B; أنا = الجليد. مستنسخة من ياماغوتشي وآخرون²⁸ بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتستند المناقشة التالية إلى أكثر من 120 تجربة استبدال تجميد تجميد السندويشات على أكثر من 000 1 عينة وأكثر من 70 تجربة مجهرية لتجميد التجميد والإلكترونات على أكثر من 75 عينة أجريت على مدى 36 عاما.

معدل النجاح لتجميد جيدة عن طريق تجميد شطيرة
يعتمد معدل النجاح في تحقيق تجميد جيد على العينات. Saccharomyces cerevisiae (الخميرة) الخلايا المستزرعة في المتوسط YPD (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ dextrose) أعطى ما يقرب من 100٪ نجاح لتجميد جيدة دون تشكيل الكريستال الجليد^{10،11،15،35،36}. أنواع الخميرة الأخرى، بما في ذلك شيزوساككروميس^37،38،39،كريبتوكوس^{14،40،41،42،43،44،45}، إكسوفيالا^{13،41،46،47،48، 49}، فوساريوم^50،51،52، أوريوباسيديوم⁵³، كانديدا^54،55، فيلوميس⁵⁶، أسبرجر 57، وتريتشوسبورون ، كما أظهرت تجميد جيدة. البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا الفطرية^58و59 و E. القولونية^16،وأظهرت أيضا تجميد جيدة. وأظهرت الخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة تجميد جيد لكل من الخلايا الحية والغلوتارالدهيد الثابتة^{1،25،26،27،60}. Glutaraldehyde ثابتة الحيوانات والأنسجة البشرية شرائح إلى 0.1 إلى 0.2 ملم سمك أظهرت أيضا تجميد جيدة معظم الوقت^1,28.

شروط لتجميد جيد
استخدام الخلايا فقط في مرحلة النمو المناسبة وحالة. يجب أن تكون الخلايا في الثقافة في المرحلة الأسية. تطبيق كميات صغيرة جدا من تعليق الخلية من العينات المركزة (لS. cerevisiae، ~ 0.02 ميكرولتر من 3-5 × 10⁹ خلايا / مل) على القرص النحاسي. يجب أن تكون شرائح الغلوتارالدهيد الثابتة من الأنسجة الحيوانية أو البشرية صغيرة جدا (يفضل أن تكون 0.3 مم × 0.3 مم × 0.1 مم). لأن قطع شرائح الأنسجة سميكة 0.1 ملم من الصعب، شريحة العديد من الأنسجة واختيار شرائح رقيقة ونصف شفافة. العمل بسرعة ولكن بعناية، ولا تدع العينات تجف. في التقاط الأقراص النحاسية مكدسة مع ملاقط، لا تضغط على الأقراص من الصعب جدا لتجنب سحق الخلايا والأنسجة. تحميل العينات هو الخطوة الأكثر أهمية لتجميد ناجحة، والظروف المطلوبة هي نفس الشروط لتجميد جيدة لتجميد الضغط العالي. القراء يجب أن تشير إلى استعراض ممتاز من قبل ماكدونالد⁶¹.

تطبيقات أخرى
تعرض هذه الورقة ميكروجرافات إلكترونية للبكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا الحيوانية المعزولة والأنسجة البشرية وجسيمات الفيروس. لاحظنا تجميد جيد للطحالب البحرية الثابتة الغلوتارارالدهايد. ومع ذلك، تم تدمير هياكل الخلية من الطحالب الخضراء المياه العذبة الحية من قبل تشكيل الكريستال الجليد. خلط الخلايا مع 20٪ ألبوم مصل البقر (BSA) يضمن أن البنية الفوقية كانت محفوظة بشكل جيد مع عدم وجود ضرر بلوري جليدي. وكان استخدام 20٪ BSA مفيدة أيضا للحفاظ على البنية الفوقية للخلايا ساق من الفطر. التجارب على تجميد الخلايا النباتية والأنسجة عن طريق تطبيق 20٪ BSA جارية. على الرغم من أن المسح المجهري الإلكتروني لعينات التجميد التجميد البديلة لم تتم محاولة، وقد تم الإبلاغ عن مراقبة هياكل الخلايا المحفوظة جيدا سابقا⁹.

ملاحظات حول طريقة تجميد الشطائر
من الأفضل ملاحظة البنية الفوقية للخلايا القريبة من الأصل من خلال التجميد السريع واستبدال الخلايا الحية بالتجميد. يمكن تجنب تشكيل بلورة الجليد مع SFD عن طريق الحد من سمك الخلايا إلى ≤30 ميكرومتر¹. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهيد غالبا ما تسفر عن الحفاظ على أفضل من بنية الخلية لمراقبة الخلايا المستزرعة تعليق لأن تثبيت الجلوتارالدهيد يجعل بنية الخلية أكثر صلابة ويمنع التغيرات الهيكلية المفرطة المحتملة أثناء جمع والطرد المركزي من الخلايا الحية¹. كما يسمح تثبيت الغلوتاراندهيد بتمديد عمق التجميد إلى 0.2 مم¹، على غرار ما حققته طريقة التجميد عالي الضغط (HPF). لذلك ، يمكن استبدال آلة HPF ب SFD للتجميد العميق للأنسجة الحيوانية والبشرية.

لأن الأنسجة glutaraldehyde الثابتة يمكن تخزينها لأكثر من 2 سنوات²⁸، يمكن إجراء تجميد شطيرة وفقا لراحة المستخدم. إصلاح الأنسجة مع الجلوتارالدهايد يسهل أيضا تقسيم الأنسجة لأن الأنسجة تصبح أكثر صلابة مع التثبيت. على عكس جهاز HPF ، يمكن استخدام SFD للتجميد السريع للفيروسات للفحص المجهري للإلكترون المبرد وللبكتيريا والخلايا النواة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع جهاز HPF، فإن SFD صغيرة ومحمولة وأقل تكلفة، ويمكن الحصول عليها من قبل المزيد من المختبرات. نأمل أن تساعد هذه السمات من SFD المزيد من المختبرات تحقيق أهدافها البحثية²⁸.

ملامح مورفولوجيا الطبيعية للخلايا
هياكل الخلية هي في حالتها الطبيعية إذا كانت تظهر المظهر التالي: هياكل الغشاء من الغشاء الخارجي (الشكل 12A, B), غشاء البلازما ( الشكل12B,C; الشكل 13A-D; والشكل 14E), المغلف النووي (الشكل 12C, الشكل 13B-D, والشكل 14D-E), الميتوكوندريا (الشكل 12C, الشكل 13C, والشكل 14D), وvacuoles (الشكل 12C) تظهر ملامح سلسة. النواة و vacuoles دائرية تقريبا (الشكل 12C). الريبوسومات تظهر مظهر واضح الإلكترون الكثيفة مع قطر ~ 20 نانومتر (الشكل 12B, C; الشكل 13C؛ والشكل 14D). السيتوبلازم هو إلكترون لوسنت (الشكل 12B، C؛ الشكل 13C؛ والشكل 14D).

تأثير تثبيت الغلوتارارالدهايد على مورفولوجيا الخلايا
تم إجراء تثبيت الغلوتارانديهيد للأنسجة الحيوانية أو البشرية قبل تجميد السندويشات للحصول على بنية فائقة خالية من الكريستال الجليدي. تظهر الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة صورا واضحة بشكل رائع مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق التجميد السريع للأنسجة الحية (الشكل 14)¹. الدراسات على خلايا الخميرة، والكائنات الحية الدقيقة في أعماق البحار، والخلايا المستزرعة تبين أن تشوه ultrastructure يرجع أساسا إلى تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الإيثانول في درجة حرارة الغرفة^{1،17،18،28}. الصغيرة ذكرت أيضا أنه على الرغم من تثبيت الغلوتارالدهيد لا يدمر تنظيم أكتين في الخلايا الليفية المستزرعة، تثبيت التيتروكسيد أوسميوم والجفاف عن طريق الأسيتون أو الإيثانول في درجة حرارة الغرفة تدمير actin المنظمة⁶².

ومن ثم، ينبغي إجراء دراسة مفصلة عن آثار تثبيت الجلوتارالدهيد على مورفولوجيا الخلايا. Ohno وضعت في الجسم الحي طريقة cryofixation حيث يتم تجميد الأنسجة الحية بسرعة دون وقف إمدادات الدم⁶³. تم استبدال الأنسجة بالتجميد وتضمينها في راتنج الايبوكسي ، ولوحظت أقسام فائقة النحافة. وأظهرت الصور المجهرية الإلكترونية البنية الفوقية الأقرب إلى الأصلية للأنسجة الحية مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الجفاف الكيميائي التقليدي والتجمد السريع للأنسجة الطازجة غير المثبتة. لذلك، قد يكون من المثير للاهتمام مقارنة البنية الفائقة التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال تثبيت تجميد الغلوتارالدهيد (الطريقة الحالية) وتلك التي يتم استبدالها في الجسم الحي تجميد التبريد لدراسة آثار تثبيت الجلوتارارالدهيد.

مراعاة البيئة وزيادة الكفاءة التجريبية
نحن نستخدم أنابيب بلاستيكية 2 مل لاستبدال الراتنج. مل واحد من الراتنج المخفف يكفي لكل خطوة استبدال. يمكن التخلص من الأنابيب البلاستيكية المستخدمة بعد كل تجربة. وهذا يمكن أن يوفر الوقت والجهد لغسل قوارير الزجاج عندما يتم استخدامها لاستبدال الراتنج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام محلول خلات أورانيل مرارا وتكرارا لقسم^{تلطيخ 32}. بعد تلطيخ المقاطع ، يمكن حفظ محلول خلات أورانيل وإعادة استخدامه. وبما أن خلات الأورانيل مادة مشعة، فإن إعادة استخدامها تساعد على تجنب توليد النفايات وتساهم في حماية البيئة.

البلازما البوليمرات فيلم النفثالين
البلازما بلمرة فيلم النفثالين هو فيلم الكربون ثلاثي الأبعاد البوليمرات المصنوعة من غاز النفثالين عن طريق بلازما البلمرة تحت توهج^{التفريغ 33}. الفيلم مرن ضد قصف الإلكترونات والمواد الكيميائية ، نظيفة جدا وشفافة ضد الإلكترونات ، ولها سطح مستو وبنية غير متبلورة. وهكذا، فإن فيلم النفثالين البلازمي البلمرة، وهو متاح تجاريا، ممتاز ويوصى به كفيلم دعم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sandwich Freezing Device	Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan	MW-SFD-01	with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials		-	Scintillation counter vials for fixative
Acetone		-
Osmium tetroxide	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	3004	0.1 g
Deep freezer	Sanyo Co. Ltd., Osaka	MDF-C8V1
Copper disk	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Slide glass		-
Double-sided adhesive tape		-
Single-edged razor blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	-	Feather, FAS-10
Double-edged razor blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	-	Feather, FA-10
Shredded board	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	428
Tweezers	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	-	Several pairs
Tweezers with polystyrene foam		-	One pair
Glutaraldehyde	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	3052
Liquid nitrogen		-
Propane gas		-	Cryogen
Ion sputter apparatus	Hitachi high technologies, Tokyo	Hitachi E102
Micropipette		-	For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge	Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo	Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.	-	SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope	Nikon Co. Ltd., Tokyo et al.	SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container		-	50 mL and 200 mL
Ethane gas		-	Cryogen
2 mL Eppendorf tubes		-	For embedding
Disposable plastic syringes		-	1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer		-
Epoxy resin	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	340	Quetol 812 set
Silicon embedding mold	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	4217	7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater		-	For 37 °C and 60 °C
Trimming stage	Sunmag Co. Ltd., Tokyo	-	Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage	Sunmag Co. Ltd., Tokyo	-	Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	5240	EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna	Ultracut S
Grids	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2633, 2634	300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	605
Perfect Loop	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	2351	Fot retrieving sections
Half Tube for section staining	Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo	463	Refer to this pape
Super Support Film	Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo	647
Syringe filter	Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo	DISMIC-03CP	Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope	JEOL Co. Ltd., Tokyo	JEM-1400