نظام تصوير عالي الوضوح قابل للتعديل للدراسات السلوكية للبالغين Drosophila

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية جعل غرفة مراقبة سلوك Drosophila بالغة بسيطة ، وكيفية التقاط صور / مقاطع فيديو عالية الوضوح للمورفولوجيا أو سلوك أنواع مختلفة من ذباب الفاكهة في غرفة المراقبة من خلال طرق بسيطة نسبيا وبأسعار معقولة.

Abstract

Drosophila melanogaster هو نموذج قوي جدا في البحوث البيولوجية ، ولكن نموذجا سيئا للتصوير الفوتوغرافي أو التصوير بالفيديو. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة ولكنها فعالة لمراقبة وتوثيق سلوك الذباب أو مورفولوجيا. تم وضع الذباب في غرفة مراقبة شفافة c.a. Ø15 × 5 مم (لا يوجد طعام بالداخل) أو Ø15 × 12 مم (مع قطعة طعام عالية 8 مم في الداخل). بعد تغطية مع الأشعة فوق البنفسجية (UV)/ مرشح واضح مع انتقال الضوء العالي، وضعت الغرفة تحت المجهر ستيريو التكبير 5-50x، وتم وضع الصمام الثنائي الصغير الباعث للضوء (LED) أضواء الفيديو على جانبي المجهر لإلقاء الضوء على الغرفة للحصول على ضوء موحد، لينة، مشرق، وخالية من الظل تقريبا. ثم تم توصيل كاميرا رقمية مدمجة مع التكبير البصري 3-5x ، والتي يمكن أن تسجل 1080 P عالية الوضوح أو أعلى دقة الفيديو (بمعدل إطار ≥30 إطارا في الثانية) ، إلى العدسة من المجهر من خلال قوس ، والتقطت الصور الفوتوغرافية أو أشرطة الفيديو من خلال العدسة. من خلال ضبط مقبض التكبير /التصغير لمجهر ستيريو التكبير ، كان من السهل جدا تتبع الذباب وأخذ صور بانورامية أو مفصلة عن قرب حسب الحاجة ، في حين سجلت الكاميرا كل شيء تحت المجهر. لأن الذباب يمكن أن يبقى في أي موقع في الغرفة، يمكن ملاحظتها وتسجيلها من جميع الاتجاهات. الصور أو مقاطع الفيديو التي تم التقاطها هي من نوعية جيدة للصور. ويمكن استخدام هذه الطريقة للبحث العلمي والتدريس.

Introduction

Drosophila الميلانوغاستر هو نموذج بارز في البحوث البيولوجية; ومع ذلك ، فهو نموذج سيء للتصوير الفوتوغرافي أو تصوير الفيديو ، لأنه صغير جدا بالنسبة للكاميرا أو كاميرا الفيديو وكبير جدا بالنسبة للمجهر المركب¹. على الرغم من البحوث الممتازة الموصوفة في الأدبيات ، إلا أن معظم الدراسات لم تقدم سوى صور غير واضحة وغير واضحة ، بدلا من صور واضحة وحادة بتفاصيل واضحة توضح سلوك الذبابة الموصوف. وعلاوة على ذلك ، على الرغم من أن السلوكيات ذبابة درست على نطاق واسع (على سبيل المثال ، المغازلة والقتال) ، ومعظم هذه الأوراق قد استخدمت الرسوم التوضيحية لشرح أبحاثهم للقراء.

تصف هذه الورقة نهجا بسيطا واقتصاديا. باستخدام هذه الطريقة ، لا يمكن ملاحظة السلوكيات المختلفة ل Drosophila فحسب ، ولكن أيضا يمكن تسجيل جميع التفاصيل التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر التكبير ستيريو بوضوح ووضوح. وبطبيعة الحال، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتسجيل مورفولوجيا الذباب، كما هو الحال عندما تدخل حالة النوم أو شبه النوم، ونموذج ثابت يسمح للمستخدم لالتقاط صورة أو كومة من الصور مع طائرات محورية مختلفة للحصول على عمق موسع للصورة الميدانية. ويمكن تحقيق هذه الأساليب دون التكنولوجيا المعقدة والمعدات باهظة الثمن أو حتى مهارات يدوية رائعة.

يعرض مكون الفيديو في هذه المقالة مقاطع فيديو للعديد من السلوكيات النموذجية للذباب. والغرض من عرض هذه الفيديوهات ذو شقين: الأول هو إعلام الجمهور بما يمكن التقاطه وتقديم جودة الصورة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة؛ ويتمثل أحدها في إعلام الجمهور بما يمكن التقاطه وعرض جودة الصورة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة؛ ويتمثل الهدف من ذلك في الحصول على معلومات عن كيفية عرض هذه الفيديوهات. والآخر هو السماح للطلاب الجدد المهتمين في Drosophila ، ولكن حتى الآن لم تسنح لهم الفرصة لمراقبة سلوك الذباب فهم سلوك الذباب (مثل المغازلة ، والقتال) من خلال أشرطة الفيديو هذه واضحة بدلا من الرسوم التوضيحية أو الصور غير واضحة.

فيديو تكميلي: Fruit Fly Behavior: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Protocol

1. بناء نظام الرصد/التوثيق

ملاحظة: المواد اللازمة لبناء نظام مراقبة / توثيق سلوك الطيران تظهر في الشكل 1، ويظهر النظام المكتمل في الشكل 2. ويرد أدناه وصف للبروتوكول الخاص ببناء النظام وكيفية استخدامه.

1. جعل ولي بehavior سbservation جالهامبر (FBOC).
   1. الحصول على حاوية صغيرة شفافة (غير شفافة) لجعل FBOC قطرها (Ø) 15 ملم × 20 ملم. استخدام غطاء زجاجة بلاستيكية شفافة من حجم ~ Ø17 مم × 22 ملم لجعل FBOC، أو قطع قسم من ~ 17 ملم من نهاية سميكة من طرف ماصة 5 مل لجعل FBOC.
   2. صب 1٪ أجار في بنك الشعب الصيني لضبط عمقه. إذا كان الطعام يحتاج إلى وضعها في بنك الشعب الصيني (انظر لطريقة إعداد الطعام)، صب أغار للحصول على عمق 12 ملم. إذا كان الطعام لا يحتاج إلى وضعه في بنك الفقار، صب أجار إلى عمق 5 ملم لتتبع مكان وجود ذباب الفاكهة بسهولة أكبر.
   3. إذا كنت تستخدم طرف ماصة لصنع FBOC، ضع مقطع طرف ماصة قطع في Ø35 مم أو طبق بيتري Ø60 ملم. صب هلام أجار 1٪ في طبق بيتري إلى سمك ~ 5 ملم، وانتظر أجار لترسيخ، وختم الجزء السفلي من FBOC. ثم، صب هلام أجار في FBOC إلى سمك المطلوب.
2. جعل قاعدة بنك الشعب الصيني عن طريق مملة ثقب ~ 10 ملم عميق في وسط قطعة من 60 ملم × 60 ملم × 15 ملم ورقة رغوة الإيثيلامين مع نفس القطر كما FBOC. أدخل بنك FBOC في الحفرة.
   ملاحظة: تحافظ قاعدة بنك الشعب الصيني على استقرار بنك الشعب الصيني وتمنعه من البقشيش وتيسر حركة بنك الشعب الصيني لتتبع الذباب أثناء المراقبة والتصوير بالفيديو.
3. جعل يطير الغذاء، إذا لزم الأمر، مع الخميرة^{المتوسطة 2،}النظام الغذائي الاصطناعي^3،أو السكروز النقي / الجلوكوز (استخدام 1٪ أجار كعامل هلام)، اعتمادا على الغرض من المراقبة.
   1. لتحديد بصريا ما إذا كان الذباب يتغذى وزيادة التباين بين الذباب وبيئتهم، إضافة الأصباغ الغذائية (انظر جدول المواد)إلى الغذاء إلى تركيز النهائي من 12.5 ملغم/100 مل.
      ملاحظة: البطن الذباب تغيير اللون مباشرة بعد التغذية.
   2. صب الطعام المعد في طبق بيتري إلى ارتفاع 8 ملم. بعد التجسيد، استخدم شفرة حلاقة لقطع قطعة من الطعام بحجم 8 مم × 4 مم × 8 مم، ووضعها على قطعة من البلاستيك (مثل غلاف الحلوى).
   3. قطع الطعام إلى هرم رباعي الزوايا أو هرم الفروستوم رباعي الزوايا ، كما هو موضح في الشكل 3، للسماح بمراقبة وتسجيل سلوك الذباب من زوايا مختلفة حيث يهبط الذباب على الطعام بشكل عشوائي. استخدام البلاستيك تحت الطعام هو لمنع الصبغة في الغذاء من الانتشار في أجار في بنك الشعب الصيني. استخدام ملاقط لوضع الطعام في وسط FBOC.
4. في بعض الملاحظات السلوكية، تأكد من أن الذباب يتضور جوعا مقدما. صب 1٪ هلام أجار (1 غرام أجار / 100 مل من الماء، 600 ميكرولتر من حمض البروبيونيك) في زجاجة فارغة نظيفة إلى سمك 1-2 سم، ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. نقل الذباب إلى الزجاجة ومكان في 25 درجة مئوية لمدة ≥36 ساعة.
   ملاحظة: الذباب يمكن أن تمتص المياه من هلام أجار، لذلك ليست هناك حاجة لإضافة الماء من وقت لآخر^4،5.
5. نقل واحد أو أكثر من الذباب إلى FBOC باستخدام الطامح. إذا كان استخدام الطامح أمرا صعبا ، فهدأ وعطل الذباب في الثلج المسحوق ، وفرزه على كيس ثلج ، ونقله إلى FBOC كما هو موضح سابقا^6.
   ملاحظة: استخدام التجميد يسهل إلى حد كبير نقل الذباب؛ الذباب المبرد يمكن استعادة وعيه في غضون 1 دقيقة، أسرع بكثير من تلك تخدير مع CO₂. على الرغم من أن تقشعر لها الأبدان يمكن أن يكون لها آثار ضارة على سلوك الذباب، على سبيل المثال، زيادة الكمون الجماع من الذباب من 5 دقائق⁷ إلى 40 دقيقة^8،فإنه لا يغير سلوك الطيران (مثل سلوك المغازلة). وبالتالي، يمكن استخدام طريقة تقشعر لها الأبدان لنقل الذباب للمراقبة العامة (مثل التجارب التعليمية) وتصوير الفيديو. ومع ذلك ، إذا كانت الملاحظات لاستخدامها في تقرير علمي ، فمن المستحسن بشدة عدم تعريض الذباب لأي تخدير.
6. بعد نقل الذباب إلى FBOC ، قم بتغطيته بتصفية الأشعة فوق البنفسجية / مسح 30-40 مم للكاميرا لتشكيل مجمع FBOC(الشكل 4). ضع مجمع FBOC تحت المنظار المجسم للمراقبة.
   ملاحظة: للحصول على صور واضحة وحادة، يوصى بشدة باستخدام فلتر عالي الجودة للأشعة فوق البنفسجية/مسح مع نقل الضوء العالي (>98٪) الرجوع إلى بعض الاقتراحات المذكورة سابقا^9،10؛ على الرغم من أنه ليست هناك حاجة لشراء مرشحات باهظة الثمن، وتجنب تغطية FBOC مع الزجاج مثل غطاء طبق بيتري.
7. إلقاء الضوء على بنك الشعب الصيني. جبل أضواء الفيديو LED مصغرة لوميض حامل الحذاء الساخن تقف ووضعها على الجانبين الأيسر والأيمن من FBOC (الشكل 2). قم بتشغيل أضواء LED، وحدد السطوع إلى 100٪ ودرجة حرارة اللون إلى 5000-5600 K.
   ملاحظة: يمكن أن توفر أضواء الفيديو LED المصغرة ذات الضوء الخافت ودرجة حرارة اللون 5600 K إضاءة موحدة ومشرقة وخالية من الظل تقريبا. باستخدام مصدر الضوء العلوي الذي يأتي مع المجهر ستيريو، لم مضيئة LED حلقة الضوء، أو مضيئة الألياف البصرية لم تسفر عن نتائج مرضية. فمن الأفضل لاستخدام إمدادات الطاقة المستمرة (المحولات) لأضواء الفيديو LED.
8. المراقبة وتصوير الفيديو لسلوك الطيران
   1. قم بتشغيل أضواء الفيديو LED، وضبط مجهر التكبير ستيريو حتى حافة FBOC يمكن أن ينظر إليها بوضوح بالعين المجردة. نقل بنك الشعب الصيني إلى وسط مجال الرؤية.
   2. إرفاق المشبك من محول الكاميرا الرقمية التلسكوب العالمي إلى العدسة من المجهر ستيريو، ومن ثم إرفاق كاميرا رقمية مدمجة إلى محول بشكل آمن عن طريق تحويل بالتناوب المسمار تركيب الكاميرا والكاميرا إصلاح المسمار(الشكل 2).
   3. قم بتشغيل الكاميرا الرقمية، ثم قم بتشغيل مقابض الضبط الأفقي/الرأسي حتى تظهر حافة FBOC بوضوح في وسط حقل الرؤية الدائري الساطع على شاشة LCD الخاصة بالكاميرا. قم بتدوير قرص الوضع إلى وضع Auto Mode ذي الأولوية Aperture، واضغط على التركيز على محدد متعدد ، واختر Macro عن قرب، ثم اضغط على الزر موافق. حرك مفتاح التكبير/التصغير من نهاية الزاوية العريضة إلى النهاية المقربة، وازوم الصورة الدائرية حتى يملأ الجزء المركزي منها شاشة LCD الكاملة. اضغط على زر تسجيل الفيلم لبدء التسجيل (اضغط على الزر مرة أخرى لإنهاء التسجيل).
      ملاحظة: إذا كانت الصورة داكنة جدا أو ساطعة جدا، فاضغط على جانب قرص التحكم بالقرب من رمز تعويض التعريض الضوئي(الشكل 1)،ثم قم بتدوير الطلب لتغيير قيمة التعريض الضوئي (EV) التي اقترحتها الكاميرا لتحقيق التأثير المطلوب. تجعل المركبات الكهربائية الإيجابية الصورة أكثر إشراقا، وتجعل المركبات الكهربائية السلبية الصورة أكثر قتامة. يجب أن تكون الصورة موحدة، مشرقة، دون التظليل.
   4. بدوره مقبض التركيز من المجهر حتى الذباب في FBOC مرئية بوضوح. اختر سلوك الطيران الذي يهم الملاحظة أو تسجيل الفيديو. بدوره مقبض التكبير والتصغير للتكبير والتصغير لتحقيق التكبير المطلوب للمراقبة أو تسجيل الفيديو.
      ملاحظة: هذه الطريقة في التقاط الصور تحت المجهر من خلال العدسة قابلة للتطبيق على أي مجهر مع العدسة. لالتقاط صور للنتائج التجريبية، استخدم كاميرا يمكنها التصوير بتنسيق RAW، حيث أن ملفات الصور RAW أفضل من ملفات JPEG. استخدم شاشة LCD للكاميرا كشاشة عرض لمراقبة سلوك ذباب الفاكهة، وتأكد من أن مجهر التكبير الاستريو يحتوي على تكبير 5-50x على الأقل.

2. بروتوكولات المراقبة وتصوير الفيديو لسلوك الطيران

1. إعداد الذباب
   1. زراعة الذباب على الذرة المتوسطة في 25 درجة مئوية مع 60٪ الرطوبة و12 ساعة ضوء / دورة الظلام. جمع الذباب في غضون 6 أيام من الفقس للمراقبة (باستثناء المغازلة والسلوك القتال).
      ملاحظة: هنا، كانت المتوسطة تتألف من 1000 مل من الماء، 105 غرام من دقيق دقيق الذرة، 75 غرام من السكروز، 15 غرام من أجار، 40 غرام من مسحوق الخميرة، 28 مل من 10٪ بارابين الميثيل (ث / الخامس في الإيثانول 95٪)، و 6.25 مل من حمض البروبيونيك.
2. استعادة الوعي من التخدير عن طريق تقشعر لها الأبدان
   1. البرد الذباب كما هو موضح سابقا. ⁶ نقل Drosophila من مربع الجليد إلى FBOC باستخدام ملاقط. سجل عملية الذبابة من الخمول إلى الوضع العادي على الفيديو.
3. يطير النوم والتغذية والإفراز ، والسلوك الاجتماعي
   1. تجويع الذباب لمدة 36 ساعة. نقل 4-6 ذباب الفاكهة إلى FBOC مع الطعام الملون. مراقبة وتسجيل سلوك الطيران على الفيديو.
      ملاحظة: الذباب التي تبقى بلا حراك لأكثر من 5 دقائق عرض سلوك النوم¹¹. Drosophila يمكن النوم على الطعام أو على جدار FBOC العمودي (الجسم عمودي على جدار غرفة المراقبة). على الرغم من أن الجسم لا يتحرك عند النوم، يمكن أن ينظر إلى البطن أن متموجة. ويتجلى سلوك التغذية عندما تمتد الذبابة من خرطومها ، وتتحرك على الطعام أثناء امتصاصه باستمرار ، ويتحول بطنه إلى اللون الأزرق. أثناء التغذية الجماعية أو الأنشطة الأخرى ، يمد ذباب الفاكهة قدميه للمس أجسام ذباب الفاكهة الآخر بطريقة ودية. هذا سلوك اجتماعي
4. يطير سلوك الاستمالة
   1. البرد الذباب كما هو موضح⁶. رمي الذباب المجمدة في مسحوق أجار، ولفة لتغطيتها بمسحوق أجار. نقل الذباب إلى FBOC. مراقبة وتسجيل سلوك الاستمالة.
      ملاحظة: عندما ذبابة الفاكهة يستعيد وعيه من التجمد، فإنه سيتم التخلص بسرعة من مسحوق أجار من جسدها وتنظيف كل جزء من جسمه مع ساقيه^12،13. ويمكن أيضا أن ينظر إلى سلوك الاستمالة أثناء التغذية، والتودد، وغيرها من السلوكيات.
5. يطير المغازلة والسلوك القتال
   1. جمع الذباب الإناث والذكور كما هو موضح سابقا⁷. لمراقبة سلوك التودد من الذباب، ضع ذبابة أنثى وذبابة الذكور في FBOC لمراقبة وتسجيل 6 سلوكيات المغازلة (الناجحة وال فاشلة).
   2. لمراقبة السلوك القتالي للذباب، ضع ذكرين في FBOC. مراقبة وتسجيل سلوكهم من دفع ودفع بعضهم البعض.
6. يطير البيض زرع السلوك
   1. إعداد الذباب الإناث كما هو موضح سابقا⁵. نقل 4 ذبابات الإناث إلى FBOC مع الطعام.

النتائج

التقط الصور من خلال فلتر الأشعة فوق البنفسجية للحصول على صور واضحة وحادة
قم بإجراء تجربة بسيطة لمراقبة الفرق بين فلتر الأشعة فوق البنفسجية والزجاج العادي في المختبر. خذ قارورة ثقافة الذباب، وأزل السدادة، ووضعها تحت مجهر تشريح ستيريو، وتغطيتها (بالتناوب) بتصفية الأشعة فوق البن?...

Discussion

الضوء هو في صميم التصوير الفوتوغرافي والفيديو وهو العامل الحاسم للحصول على صور عالية الجودة¹⁶. هنا، تم استخدام مصباحي فيديو LED مع سطوع قابل للتعديل ودرجة حرارة اللون كمضاءين، وتم اختيار مادة شفافة لصنع FBOC. وفرت لوحات LED الخفيفة على كلا الجانبين ما يكفي من السطوع ، وخففت المواد ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom