JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, basit bir yetişkin Drosophila davranış gözlem odasının nasıl yapılır ve gözlem odasındaki farklı meyve sineklerinin morfolojisinin veya davranışının yüksek çözünürlüklü fotoğraflarının / videolarının nispeten basit ve uygun fiyatlı yöntemlerle nasıl çekılacağını açıklar.

Özet

Drosophila melanogaster biyolojik araştırmalarda çok güçlü bir modeldir, ancak fotoğrafçılık veya videografi için kötü bir modeldir. Bu makalede, sineklerin davranışını veya morfolojisini gözlemlemek ve belgelemek için basit ama etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Sinekler yarı saydam bir gözlem odasına yerleştirildi. Ø15 x 5mm (içinde yiyecek yok) veya Ø15 x 12 mm (içinde 8 mm yüksekliğinde bir yiyecek parçası ile). Yüksek ışık geçirgenliğine sahip ultraviyole (UV)/şeffaf filtre ile kaplandıktan sonra, oda 5-50x yakınlaştırma stereo mikroskobu altına yerleştirildi ve mikroskobun her iki tarafına mini ışık yayan diyot (LED) video ışıkları yerleştirilerek odanın düzgün, yumuşak, parlak ve neredeyse gölgesiz ışık elde etmesi için aydınlatıldı. Daha sonra, 1080 P yüksek çözünürlüklü veya daha yüksek çözünürlüklü video (≥30 fps kare hızında) kaydedebilen 3-5x optik yakınlaştırmaya sahip kompakt bir dijital kamera, mikroskopun göz merceğine bir braket aracılığıyla bağlandı ve göz merceğinden fotoğraflar veya videolar çekildi. Zoom stereo mikroskobun yakınlaştırma düğmesini ayarlayarak, sinekleri izlemek ve gerektiğinde panoramik veya ayrıntılı yakın çekim görüntüler çekmek çok kolaydı, kamera ise her şeyi mikroskop altında kaydetti. Sinekler odadaki herhangi bir konumda kalabildiğinden, her yönden gözlemlenebilir ve kaydedilebilir. Çekilen fotoğraflar veya videolar iyi görüntü kalitesindedir. Bu yöntem hem bilimsel araştırma hem de öğretim için kullanılabilir.

Giriş

Drosophila melanogaster biyolojik araştırmalarda olağanüstü bir modeldir; ancak, bir kamera veya video kamera için çok küçük ve bileşik mikroskop için çok büyük olduğu için fotoğraf veya videografi için kötü birmodeldir 1. Literatürde açıklanan mükemmel araştırmalara rağmen, çoğu çalışma, açıklanan sinek davranışını gösteren net ve keskin fotoğraflar yerine sadece bulanık, belirsiz görüntüler sağlamıştır. Ayrıca, sinek davranışları kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da (örneğin, kur yapmak ve savaşmak), bu makalelerin çoğu araştırmalarını okuyuculara açıklamak için illüstrasyonlar kullanmıştır.

Bu makalede basit ve ekonomik bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak, sadece Drosophila'nın çeşitli davranışları gözlemlenebilir, aynı zamanda stereo zoom mikroskobu altında gözlemlenebilecek tüm detaylar net ve keskin bir şekilde kaydedilebilir. Tabii ki, bu yöntem sineklerin morfolojisini kaydetmek için de kullanılabilir, çünkü bir uyku veya yarı uyku durumuna girdiklerinde, sabit model kullanıcının daha uzun bir alan derinliği fotoğrafı elde etmek için farklı odak düzlemleriyle bir fotoğraf veya fotoğraf yığını çekmesini sağlar. Bu yöntemler karmaşık teknoloji ve pahalı ekipman ve hatta üstün manuel beceriler olmadan gerçekleştirilebilir.

Bu makalenin video bileşeni, sineklerin birkaç tipik davranışının videolarını gösterir. Bu videoları göstermenin amacı iki yönlüdür: biri, izleyicilerin nelerin yakalanabileceğini bilmesini sağlamak ve bu yöntemi kullanarak elde edilen görüntü kalitesini sunmaktır; diğeri, Drosophila ile ilgilenen, ancak şimdiye kadar sineklerin davranışlarını gözlemleme fırsatı bulamamış yeni öğrencilerin, illüstrasyonlar veya bulanık görüntüler yerine bu net videolar aracılığıyla sineklerin davranışını (kur yapmak, savaşmak gibi) anlama fırsatı bulamamıştır.

Ek Video: Meyve Sineği Davranışı: Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Gözlem/belgeleme sisteminin yapımı

NOT: Sinek davranışı gözlem/belgeleme sistemini oluşturmak için gereken malzemeler Şekil 1'de, tamamlanan sistem ise Şekil 2'degösterilmiştir. Sistemin nasıl oluşturulacağı ve nasıl kullanılacağı ile ilgili protokol aşağıda açıklanmıştır.

  1. Fly behavior observation chamber (FBOC) yapın.
    1. Boyut çapında (Ø) 15 mm x 20 mm FBOC yapmak için küçük, yarı saydam (şeffaf olmayan) bir kap elde edin. FBOC yapmak için ~Ø17 mm x 22 mm boyutlarda yarı saydam bir plastik şişe kapağı kullanın veya FBOC yapmak için 5 mL pipet ucunun kalın ucundan ~17 mm'lik bir bölüm kesin.
    2. Derinliğini ayarlamak için FBOC'ye% 1 agar dökün. Yiyeceklerin FBOC'ye yerleştirilmesi gerekiyorsa (yemeğin hazırlama yöntemi için bakın), 12 mm derinlik elde etmek için agar dökün. Yiyeceklerin FBOC'a yerleştirilmesi gerekmiyorsa, meyve sineklerinin nerede olduğunu daha kolay izlemek için agar'ı 5 mm derinliğe dökün.
    3. FBOC yapmak için pipet ucu kullanıyorsanız, kesme pipet ucu bölümünü Ø35 mm veya Ø60 mm Petri kabına yerleştirin. % 1 agar jelini Petri kabına ~ 5 mm kalınlığında dökün, agarın katılaşmasını bekleyin ve FBOC'nin altını kapatın. Daha sonra, agar jelini istenen kalınlığa FBOC'ye dökün.
  2. FBOC ile aynı çapta 60 mm x 60 mm x 15 mm etilaminin köpük tabakasının ortasında ~10 mm derinliğinde bir delik açarak FBOC tabanı yapın. FBOC'yi deliğe yerleştirin.
    NOT: FBOC tabanı FBOC'yi sabit tutar ve devrilmesini önler ve gözlem ve videografi sırasında sinekleri izlemek için FBOC'nin hareketini kolaylaştırır.
  3. Gerekirse, gözlem amacına bağlı olarak maya orta2, yapay diyet3veya saf sakkaroz / glikoz (jelleşme maddesi olarak% 1 agar kullanın) ile sinek yemi yapın.
    1. Sineklerin beslenip beslenmediğini görsel olarak belirlemek ve sinekler ile çevreleri arasındaki kontrastı artırmak için, gıdaya 12,5 mg/100mL'lik son konsantrasyona gıda boyaları ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
      NOT: Sineklerin karınları beslendikten hemen sonra renk değiştirir.
    2. Hazırlanan yiyecekleri 8 mm yüksekliğe kadar bir Petri kabına dökün. Katılaştırmadan sonra, 8 mm x 4 mm x 8 mm boyutlarında bir yiyecek parçasını kesmek için bir jilet kullanın ve bir plastik parçasına (şeker ambalajı gibi) yerleştirin.
    3. Yiyecekleri dörtgen bir piramide veya dörtgen frustum piramidine kesin Şekil 3'te gösterildiği gibi, sinekler yiyeceklere rastgele indikçe farklı açılardan sinek davranışının gözlemlenmesine ve kaydedilmesine izin vermek için. Gıdanın altındaki plastiği, gıdadaki boyanın FBOC'daki agaraya yayılmasını önlemek için kullanın. Yiyecekleri FBOC'nin ortasına yerleştirmek için cımbız kullanın.
  4. Bazı davranışsal gözlemlerde, sineklerin önceden aç kalmasını sağlayın. Temiz boş bir şişeye 1-2 cm kalınlığa kadar % 1 agar jeli (1 g agar/100 mL su, 600 μL propiyonik asit) dökün ve 1-2 saat oda sıcaklığına yerleştirin. Transfer şişeye uçar ve 25 °C'de ≥36 saat boyunca yerleştirin.
    NOT: Sinekler agar jelinden su emebilir, bu nedenle zaman zaman su eklemeye gerek yoktur4,5.
  5. Bir veya daha fazla sinek bir aspiratör kullanarak FBOC'ye aktarın. Aspiratör kullanmak zorsa, sinekleri ezilmiş buzda soğutun ve devre dışı bırakmayın, bir buz torbasında sıralayın ve daha önce açıklandığı gibi FBOC'ye aktarın6.
    NOT: Donma kullanımı sineklerin transferini büyük ölçüde kolaylaştırır; soğutulmuş sinekler 1 dakika içinde bilincini geri kazanabilir, CO2ile uyuşturulmuş olanlardan çok daha hızlı . Tüyler ürpertici sineklerin davranışı üzerinde zararlı etkilere sahip olsa da, örneğin, sineklerin 5 dk7 ila 40 dk8'dençiftleşme gecikmesi , sinek davranışını değiştirmez (kur davranışı gibi). Bu nedenle, ürpertici yöntem genel gözlem (öğretim deneyleri gibi) ve videografi için sinekleri aktarmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, gözlemler bilimsel bir raporda kullanılacaksa, sineklerin herhangi bir anesteziye maruz kalmaması şiddetle tavsiye edilir.
  6. Sinekleri FBOC'ye aktardıktan sonra, kameranın bir FBOC kompleksi oluşturması için 30-40 mm UV / net bir filtre ile örtün (Şekil 4). FBOC kompleksini gözlem için stereomikroskopun altına yerleştirin.
    NOT: Net ve keskin görüntüler elde etmek için, yüksek ışık geçirgenliği (%>98) ve azaltılmış parlama ile yüksek kaliteli UV/net filtre kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Daha önce açıklanan bazı önerilere bakın9,10; pahalı filtreler satın almaya gerek olmamasına rağmen, FBOC'yi petri kabının kapağı gibi camlarla örtmekten kaçının.
  7. FBOC'yi aydınlatın. Sıcak ayakkabı montaj standlarını yanıp sönmek ve FBOC'nin sol ve sağ taraflarına yerleştirmek için mini LED video ışıkları monte et (Şekil 2). LED ışıkları açın ve parlaklığı % 100'e ve renk sıcaklığını 5000-5600 K'ya ayarlayın.
    NOT: Kısılabilir ışığa sahip mini LED video ışıkları, 5600 K renk sıcaklığı düzgün, parlak, neredeyse gölgesiz aydınlatma sağlayabilir. Stereo mikroskopla birlikte gelen üst ışık kaynağını kullanarak, LED Halka Işık aydınlatıcı veya fiber optik aydınlatıcı tatmin edici sonuçlar vermedi. LED video ışıkları için sürekli güç kaynağı (transformatörler) kullanmak en iyisidir.
  8. Sinek davranışının gözlemi ve videografisi
    1. LED video ışıklarını açın ve FBOC'nin kenarı çıplak gözle net bir şekilde görülene kadar stereo zoom mikroskobu ayarlayın. FBOC'yi görüş alanının ortasına taşıyın.
    2. Evrensel teleskop dijital kamera adaptörünün kelepçesini stereo mikroskobun bir göz merceğine takın ve ardından kamera montaj vidasını ve kamera sabitleme vidasını dönüşümlü olarak çevirerek adaptöre kompakt bir dijital kamera takın (Şekil 2).
    3. Dijital kamerayı açın ve FBOC kenarı kameranın LCD ekranındaki parlak dairesel görüş alanının ortasında net bir şekilde görünene kadar yatay/dikey ince ayar düğmelerini çevirin. Mod kadranını Diyafram öncelikli otomatik Mod'adöndürün, çoklu seçiciye odaklanın, Makro yakın çekimi'ni seçin ve tamam düğmesine basın. Yakınlaştırma anahtarını geniş açılı uçtan telefoto ucuna taşıyın ve orta kısmı tam LCD ekranı doldurana kadar dairesel görüntüye yakınlaştırın. Kayda başlamak için Film kaydı düğmesine basın (kaydı sonlandırmak için düğmeye tekrar basın).
      NOT: Görüntü çok koyu veya çok parlaksa, pozlama telafisi simgesine (Şekil 1)yakın kontrol kadranının yanına basın ve istenen etkiyi elde etmek için kamera tarafından önerilen pozlama değerini (EV) değiştirmek için kadranı döndürün. Pozitif EV'ler görüntüyü daha parlak, negatif EV'ler ise görüntüyü daha koyu hale getirir. Görüntü tekdüze, parlak, vinyetsiz olmalıdır.
    4. FBOC'daki sinekler açıkça görünene kadar mikroskobun odak düğmesini çevirin. Gözlem veya video kaydı için ilgi çekici sinek davranışını seçin. Gözlem veya video kaydı için istenen büyütmeyi elde etmek için yakınlaştırma düğmesini yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için çevirin.
      NOT: Mikroskop altında göz merceği ile görüntü alma yöntemi, göz merceği olan her mikroskop için geçerlidir. Deneysel sonuçların fotoğraflarını çekmek için RAW görüntü dosyaları JPEG'lere tercih edilir olduğundan RAW formatında çekim yapabilen bir kamera kullanın. Meyve sineklerinin davranışını gözlemlemek ve stereo yakınlaştırma mikroskopunun en az 5-50x yakınlaştırmaya sahip olduğundan emin olmak için kameranın LCD ekranını ekran olarak kullanın.

2. Sinek davranışının gözlem ve videografisi için protokoller

  1. Sineklerin hazırlanması
    1. %60 nem ve 12 saat açık/karanlık döngü ile 25 °C'de mısır unu ortamındaki sinekleri kültüre edin. Gözlem için kuluçkadan çıktıktan sonraki 6 gün içinde sinekleri toplayın (kur ve mücadele davranışı hariç).
      NOT: Burada, ortam 1000 mL su, 105 g mısır unu, 75 g sakkaroz, 15 g agar, 40 g maya tozu, 28 mL% 10 metil paraben (% 95 etanolde w / v) ve 6.25 mL propiyonik asitten oluşuyordu.
  2. Anesteziden tüyler ürpertici bir şekilde kendine gelen bilinç
    1. Sinekleri daha önce açıklandığı gibi soğutun. 6 Drosophila'yı buz kutusundan cımbız kullanarak FBOC'ye aktarın. Sineğin hareketsizlikten normal duruşa kadar olan sürecini videoya kaydedin.
  3. Sinek uykusu, beslenme, atılım ve sosyal davranış
    1. Aç 36 saat boyunca uçar. 4-6 meyve sineklerini lekeli yiyeceklerle FBOC'a aktarın. Videoda sinek davranışını gözlemleyin ve kaydedin.
      NOT: 5 dakikadan fazla hareketsiz kalan sinekler uyku davranışını görüntüler11. Drosophila yemek üzerinde veya dikey bir FBOC duvarında uyuyabilir (vücut gözlem odası duvarına diktir). Uyurken vücut hareket etmese de karın dalgalı olduğu görülebilir. Beslenme davranışı, sinek hortumunu uzattığında, sürekli emerken yiyecekler üzerinde hareket ettiğinde ve karnı maviye döndüğünde kendini gösterir. Grup besleme veya diğer aktiviteler sırasında, meyve sinekleri, diğer meyve sineklerinin vücutlarına dostça dokunmak için ayaklarını uzatır. Bu sosyal bir davranış.
  4. Sinek tımar davranışı
    1. Açıklandığı gibi sinekleri soğutun6. Donmuş sinekleri agar tozuna atın ve agar tozu ile örtmek için yuvarlayın. Sinekleri FBOC'a aktarın. Tımar davranışını gözlemleyin ve kaydedin.
      NOT: Meyve sineği donma nedeniyle kendine geldiğinde, agar tozunu vücudundan hızla sallar ve vücudunun her yerini bacaklarıyla temizler12,13. Tımar davranışı beslenme, kur yapma ve diğer davranışlar sırasında da görülebilir.
  5. Sinek kur ve mücadele davranışı
    1. Daha önce açıklandığı gibi dişi ve erkek sinekleri toplayın7. Sineklerin kur davranışını gözlemlemek için, 6 kur (başarılı ve başarısız) davranışı gözlemlemek ve kaydetmek için FBOC'ye bir dişi sinek ve bir erkek sinek yerleştirin.
    2. Sineklerin dövüş davranışını gözlemlemek için FBOC'ye iki erkek yerleştirin. Birbirlerini itme ve itme davranışlarını gözlemleyin ve kaydedin.
  6. Sinek yumurtlama davranışı
    1. Daha önce açıklandığı gibi dişi sinekler hazırlayın5. 4 dişi sinekleri yiyecekle FBOC'a aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Net ve keskin görüntüler için UV filtresinden çekim
Laboratuvarda bir UV filtresi ile sıradan cam arasındaki farkı gözlemlemek için basit bir deney gerçekleştirin. Bir sinek kültürü şişesi alın, durdurucuyu çıkarın, stereo diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin ve (dönüşümlü olarak) bir UV filtresi ve bir Petri kabı kapağı ile örtün. Bu iki durumda çekilen fotoğraflar Şekil 5'te gösterilmiştir. UV filtresinden çekilen fotoğraf a?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Işık, fotoğraf ve videografinin tam kalbinde yer almaktadır ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için belirleyici faktördür16. Burada aydınlatıcı olarak ayarlanabilir parlaklık ve renk sıcaklığına sahip iki LED video ışığı kullanıldı ve FBOC'yi yapmak için yarı saydam bir malzeme seçildi. Her iki taraftaki LED ışık panelleri yeterli parlaklık sağladı ve yarı saydam malzeme yumuşadı ve dağınık ışık, sonunda FBOC'daki sinekleri aydınlatmak için düzg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Profesör Li Xiangdong ve fotoğrafçı Bay Cheng Jing'e yararlı tartışmalar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Tarım Üniversitesi Yaşam Bilimi Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin Keşif Projesi (20200101) tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
compact camera, Nikon P310Nikon3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformerGODOXLED-P120have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filterhigh-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope5-50x zoom

Referanslar

  1. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology: Wild-type and classical mutants. , Academic Press. (2013).
  2. Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, 15484(2018).
  3. Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11, 100-105 (2014).
  4. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of visualized experiments : JoVE. (3), e193(2007).
  5. Yang, C. -H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. -N. Drosophila egg-laying site selection as a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  6. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal Of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59613(2019).
  7. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3795(2012).
  8. Barron, A. B. Anesthetizing Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46 (4), 439-442 (2000).
  9. Cicala, R. My not quite complete protective filter article. , Available from: https://www.lensrentals.com/blog/2017/06/the-comprehensive-ranking-of-the-major-uv-filters-on-the-market (2017).
  10. Carnathan, B. UV and clear lens protection filters review. , Available from: https://www.the-digital-picture.com/Reviews/UV-and-Clear-Lens-Protection-Filters.aspx (2013).
  11. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  12. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55231(2017).
  13. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 17 (4), 641-651 (1969).
  14. Arkema Inc. Plexiglas : optical and transmission characteristics. , Available from: https://www.plexiglas.com/export/sites/plexiglas/.content/medias/downloads/sheet-docs/plexiglas-optical-and-transmission-characteristics.pdf (2000).
  15. Fluegel, A. Calculation of the light reflection and transmission. , Available from: https://www.glassproperties.com/reflection/ (2007).
  16. Hunter, F., Biver, S., Fuqua, P. Light science & magic: an introduction to photographic Lighting. , Routledge. (2015).
  17. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  18. Rieger, D., et al. The fruit fly Drosophila melangaster favors dim light and times its activity peaks to early dawn and late dusk. Journal of Biological Rhythms. 22 (5), 387-399 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DavranSay 172Davranyeti kin Drosophilag zlem ve kay t sistemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır