Un sistema de imágenes ajustable de alta definición para estudios conductuales de adultos con Drosophila

Resumen

Este protocolo describe cómo hacer una cámara de observación del comportamiento de Drosophila adulta simple, y cómo tomar fotografías / videos de alta definición de la morfología o el comportamiento de diferentes tipos de moscas de la fruta en la cámara de observación a través de métodos relativamente simples y asequibles.

Resumen

Drosophila melanogaster es un modelo muy poderoso en la investigación biológica, pero un mal modelo para la fotografía o la videografía. Este artículo describe un método simple pero efectivo para observar y documentar el comportamiento o la morfología de las moscas. Las moscas fueron colocadas en una cámara de observación translúcida c.a. Ø15 x 5 mm (sin comida en el interior) o Ø15 x 12 mm (con una pieza de comida de 8 mm de altura en el interior). Después de cubrirse con un filtro ultravioleta (UV) / transparente con alta transmitancia de luz, la cámara se colocó bajo un microscopio estéreo con zoom de 5-50x, y se colocaron mini luces de video de diodo emisor de luz (LED) a ambos lados del microscopio para iluminar la cámara y obtener una luz uniforme, suave, brillante y casi sin sombras. Luego, una cámara digital compacta con zoom óptico de 3-5x, que puede grabar video de alta definición o mayor resolución de 1080 P (a una velocidad de fotogramas de ≥30 fps), se conectó al ocular del microscopio a través de un soporte, y se tomaron fotografías o videos a través del ocular. Al ajustar la perilla del zoom del microscopio estéreo de zoom, fue muy fácil rastrear las moscas y tomar imágenes panorámicas o detalladas de primer plano según sea necesario, mientras que la cámara grabó todo bajo el microscopio. Debido a que las moscas pueden permanecer en cualquier posición en la cámara, se pueden observar y registrar desde todas las direcciones. Las fotografías o vídeos realizados son de buena calidad de imagen. Este método se puede utilizar tanto para la investigación científica como para la enseñanza.

Introducción

Drosophila melanogaster es un modelo sobresaliente en la investigación biológica; sin embargo, es un mal modelo para fotografía o videografía, ya que es demasiado pequeño para una cámara o una videocámara y demasiado grande para un microscopio compuesto¹. A pesar de la excelente investigación descrita en la literatura, la mayoría de los estudios solo han proporcionado imágenes borrosas y poco claras, en lugar de fotografías claras y nítidas con detalles claros que ilustran el comportamiento de la mosca que se describe. Además, aunque los comportamientos de las moscas han sido ampliamente estudiados (por ejemplo, cortejo y peleas), la mayoría de estos artículos han utilizado ilustraciones para explicar su investigación a los lectores.

Este documento describe un enfoque simple y económico. Usando este método, no solo se pueden observar los diversos comportamientos de Drosophila, sino que también se pueden registrar todos los detalles que se pueden observar bajo un microscopio de zoom estéreo de manera clara y nítida. Por supuesto, este método también se puede utilizar para registrar la morfología de las moscas, ya que cuando entran en un estado de sueño o semi-sueño, el modelo estacionario permite al usuario tomar una fotografía o una pila de fotografías con diferentes planos focales para obtener una foto de profundidad de campo extendida. Estos métodos se pueden realizar sin tecnología complicada y equipos costosos o incluso excelentes habilidades manuales.

El componente de video de este artículo muestra videos de varios comportamientos típicos de las moscas. El propósito de mostrar estos videos es doble: uno es que el público sepa lo que se puede capturar y presentar la calidad de imagen obtenida mediante el uso de este método; la otra es permitir que los nuevos estudiantes que están interesados en Drosophila, pero que hasta ahora no han tenido la oportunidad de observar realmente el comportamiento de las moscas, comprendan el comportamiento de las moscas (como el cortejo, las peleas) a través de estos videos claros en lugar de ilustraciones o imágenes borrosas.

Video suplementario: Comportamiento de la mosca de la fruta: Haga clic aquí para descargar este archivo.

Protocolo

1. Construcción del sistema de observación/documentación

NOTA: Los materiales necesarios para construir el sistema de observación/documentación del comportamiento de la mosca se muestran en la Figura 1, y el sistema completado se muestra en la Figura 2. El protocolo para construir el sistema y cómo usarlo se describen a continuación.

1. Hacer un fly behavior observation chamber (FBOC).
   1. Obtenga un recipiente pequeño, translúcido (no transparente) para hacer un FBOC de diámetro de tamaño (Ø) 15 mm x 20 mm. Use una tapa de botella de plástico translúcido de tamaño ~ Ø17 mm x 22 mm para hacer un FBOC, o corte una sección de ~ 17 mm del extremo grueso de una punta de pipeta de 5 ml para hacer un FBOC.
   2. Vierta un 1% de agar en el FBOC para ajustar su profundidad. Si es necesario colocar los alimentos en el FBOC (consulte el método de preparación del alimento), vierta el agar para obtener una profundidad de 12 mm. Si no es necesario colocar la comida en el FBOC, vierta el agar a una profundidad de 5 mm para rastrear el paradero de las moscas de la fruta más fácilmente.
   3. Si usa una punta de pipeta para hacer un FBOC, coloque la sección de la punta de la pipeta de corte en una placa de Petri de Ø35 mm o Ø60 mm. Vierta el gel de agar al 1% en la placa de Petri a un grosor de ~ 5 mm, espere a que el agar se solidifique y selle el fondo del FBOC. Luego, vierta el gel de agar en el FBOC al grosor deseado.
2. Haga una base FBOC perforando un agujero de ~ 10 mm de profundidad en el centro de una pieza de una lámina de espuma de etilamina de 60 mm x 60 mm x 15 mm con el mismo diámetro que la FBOC. Inserte el FBOC en el agujero.
   NOTA: La base FBOC mantiene estable al FBOC y evita que se vuelque y facilita el movimiento del FBOC para rastrear las moscas durante la observación y la videografía.
3. Haga alimentos para moscas, si es necesario, con levadura mediana^2,dieta artificial³o sacarosa / glucosa pura (use 1% de agar como agente gelificante), dependiendo del propósito de la observación.
   1. Para determinar visualmente si las moscas se están alimentando y aumentar el contraste entre las moscas y su entorno, agregue colorantes alimentarios (consulte la Tabla de materiales)al alimento hasta una concentración final de 12.5 mg / 100 ml.
      NOTA: El abdomen de las moscas cambia de color inmediatamente después de la alimentación.
   2. Vierta la comida preparada en una placa de Petri a una altura de 8 mm. Después de la solidificación, use una cuchilla de afeitar para cortar un trozo de alimento de tamaño 8 mm x 4 mm x 8 mm, y colóquelo sobre un trozo de plástico (como un envoltorio de caramelos).
   3. Cortar la comida en una pirámide cuadrangular o pirámide frustum cuadrangular, como se muestra en la Figura 3,para permitir la observación y el registro del comportamiento de la mosca desde diferentes ángulos a medida que las moscas aterrizan en la comida al azar. Usar el plástico debajo de la comida es para evitar que el colorante en la comida se difunda en el agar en el FBOC. Use pinzas para colocar la comida en el centro del FBOC.
4. En algunas observaciones de comportamiento, asegúrese de que las moscas se mueren de hambre de antemano. Vierta el gel de agar al 1% (1 g de agar/100 ml de agua, 600 μL de ácido propiónico) en una botella vacía limpia a un grosor de 1-2 cm, y colóquela a temperatura ambiente durante 1-2 h. Transfiera las moscas a la botella y colóquelos a 25 °C durante ≥36 h.
   NOTA: Las moscas pueden absorber agua del gel de agar, por lo que no hay necesidad de agregar agua de vez^{en cuando 4,5}.
5. Transfiera una o más moscas al FBOC usando un aspirador. Si el uso de un aspirador es difícil, enfríe e inactive las moscas en hielo picado, clasifícelas en una bolsa de hielo y transfiéralas al FBOC como se describió anteriormente⁶.
   NOTA: El uso de la congelación facilita en gran medida la transferencia de moscas; las moscas refrigeradas pueden recuperar la conciencia en 1 minuto, mucho más rápido que las anestesiadas con CO_2. Aunque el enfriamiento podría tener efectos perjudiciales en el comportamiento de las moscas, por ejemplo, el aumento de la latencia de cópula de las moscas de 5 min⁷ a 40 min^8,no cambia el comportamiento de las moscas (como el comportamiento de cortejo). Por lo tanto, el método de enfriamiento se puede utilizar para transferir moscas para observación general (como experimentos de enseñanza) y videografía. Sin embargo, si las observaciones se van a utilizar en un informe científico, se recomienda encarecidamente no exponer a las moscas a ninguna anestesia.
6. Después de transferir las moscas al FBOC, cúbralo con un filtro UV/clear de 30-40 mm para que la cámara forme un complejo FBOC(Figura 4). Coloque el complejo FBOC debajo del estereomitroscopio para su observación.
   NOTA: Para obtener imágenes claras y nítidas, se recomienda encarecidamente utilizar un filtro UV/clear de alta calidad con alta transmitancia de luz (>98%) y destellos reducidos. Consulte algunas sugerencias descritas anteriormente^9,10; aunque no hay necesidad de comprar filtros caros, evite cubrir el FBOC con vidrio como la tapa de una placa de Petri.
7. Ilumina el FBOC. Monte mini luces de video LED para parpadear los soportes de montaje de zapatas y colóquelas en los lados izquierdo y derecho del FBOC (Figura 2). Encienda las luces LED y ajuste el brillo al 100% y la temperatura de color a 5000-5600 K.
   NOTA: Las mini luces de video LED con luz regulable, temperatura de color de 5600 K pueden proporcionar una iluminación uniforme, brillante y casi sin sombras. El uso de la fuente de luz superior que viene con el microscopio estereoscópico, el iluminador de luz de anillo LED o el iluminador de fibra óptica no produjeron resultados satisfactorios. Es mejor utilizar una fuente de alimentación continua (transformadores) para las luces de video LED.
8. Observación y videografía del comportamiento de las moscas
   1. Encienda las luces de video LED y ajuste el microscopio de zoom estéreo hasta que el borde del FBOC se pueda ver claramente a simple vista. Mueva el FBOC al centro del campo de visión.
   2. Conecte la abrazadera del adaptador de cámara digital del telescopio universal a un ocular del microscopio estéreo y, a continuación, conecte una cámara digital compacta al adaptador de forma segura girando alternativamente el tornillo de montaje de la cámara y el tornillo de fijación de la cámara (Figura 2).
   3. Encienda la cámara digital y gire las perillas de ajuste fino horizontal / vertical hasta que el borde FBOC aparezca claramente en el centro del campo de visión circular brillante en la pantalla LCD de la cámara. Gire el dial de modo al modo automático de prioridad de apertura,presione enfocar en el selector múltiple, elija Primer plano macro y, acontinuación, presione el botón OK. Mueva el interruptor de zoom del extremo gran angular al extremo del teleobjetivo y amplíe la imagen circular hasta que su parte central llene la pantalla LCD completa. Presione el botón Grabación de película para comenzar a grabar (presione el botón nuevamente para finalizar la grabación).
      NOTA: Si la imagen es demasiado oscura o demasiado brillante, presione el lado del dial de control cerca del icono de compensación de exposición (Figura 1) y gire el dial para alterar el valor de exposición (EV) sugerido por la cámara para lograr el efecto deseado. Los vehículos eléctricos positivos hacen que la imagen sea más brillante, y los vehículos eléctricos negativos hacen que la imagen sea más oscura. La imagen debe ser uniforme, brillante, sin viñetas.
   4. Gire la perilla de enfoque del microscopio hasta que las moscas en el FBOC sean claramente visibles. Elija el comportamiento de la mosca de interés para la observación o la grabación de video. Gire la perilla del zoom para acercar y alejar para lograr la ampliación deseada para la observación o la grabación de video.
      NOTA: Este método de tomar imágenes bajo el microscopio a través de los oculares es aplicable a cualquier microscopio con oculares. Para tomar fotografías de resultados experimentales, use una cámara que pueda disparar en formato RAW, ya que los archivos de imagen RAW son preferibles a los JPEG. Use la pantalla LCD de la cámara como pantalla para observar el comportamiento de las moscas de la fruta y asegúrese de que el microscopio de zoom estéreo tenga al menos un zoom de 5-50x.

2. Protocolos de observación y videografía del comportamiento de las moscas

1. Preparando las moscas
   1. Culta las moscas en medio de harina de maíz a 25 °C con 60% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Recolecte moscas dentro de los 6 días posteriores a la eclosión para observación (excepto el cortejo y el comportamiento de lucha).
      NOTA: Aquí, el medio estaba compuesto por 1000 ml de agua, 105 g de harina de harina de maíz, 75 g de sacarosa, 15 g de agar, 40 g de levadura en polvo, 28 ml de metilparabeno al 10% (p/v en etanol al 95%) y 6,25 ml de ácido propiónico.
2. Recuperar la conciencia de la anestesia enfriando
   1. Enfríe las moscas como se describió anteriormente. ⁶ Transfiera la Drosophila de la caja de hielo a la FBOC usando pinzas. Grabe el proceso de la mosca desde la inactividad hasta la postura normal en video.
3. Sueño, alimentación, excreción y comportamiento social de las moscas
   1. Matar de hambre vuela durante 36 h. Transfiera 4-6 moscas de la fruta al FBOC con alimentos manchados. Observe y grabe el comportamiento de las moscas en video.
      NOTA: Las moscas que permanecen inmóviles durante más de 5 minutos muestran el comportamiento del sueño¹¹. Drosophila puede dormir en la comida o en una pared vertical FBOC (el cuerpo es perpendicular a la pared de la cámara de observación). Aunque el cuerpo no se mueve cuando duerme, se puede ver que el abdomen está ondulado. El comportamiento de alimentación se manifiesta cuando la mosca estira su probóscide, se mueve sobre la comida mientras succiona constantemente y su abdomen se vuelve azul. Durante la alimentación grupal u otras actividades, las moscas de la fruta estiran sus pies para tocar los cuerpos de otras moscas de la fruta de una manera amistosa. Este es un comportamiento social.
4. Comportamiento de aseo de la mosca
   1. Enfriar las moscas como se describe⁶. Arroje las moscas congeladas en polvo de agar y enrolle para cubrirlas con polvo de agar. Transfiera las moscas al FBOC. Observe y registre el comportamiento de aseo.
      NOTA: Cuando la mosca de la fruta recupera la conciencia de la congelación, se sacudirá rápidamente el polvo de agar de su cuerpo y limpiará cada parte de su cuerpo con sus patas^12,13. El comportamiento de aseo también se puede ver durante la alimentación, el cortejo y otros comportamientos.
5. Cortejo de moscas y comportamiento de lucha
   1. Recolectar moscas hembras y machos como se describió anteriormente⁷. Para observar el comportamiento de cortejo de las moscas, coloque una mosca hembra y una mosca macho en el FBOC para observar y registrar 6 comportamientos de cortejo (exitosos y fallidos).
   2. Para observar el comportamiento de lucha de las moscas, coloque dos machos en el FBOC. Observe y registre su comportamiento de empujarse y empujarse unos a otros.
6. Comportamiento de puesta de huevos de mosca
   1. Preparar moscas hembra como se describió anteriormente⁵. Transfiera 4 moscas hembra a FBOC con comida.

Resultados

Dispara a través de un filtro UV para obtener imágenes claras y nítidas
Realice un experimento simple para observar la diferencia entre un filtro UV y el vidrio ordinario en el laboratorio. Tome un vial de cultivo de moscas, retire el tapón, colóquelo debajo de un microscopio de disección estéreo y cúbralo (alternativamente) con un filtro UV y una tapa de placa de Petri. Las fotografías tomadas en estos dos casos se muestran en la Figura 5. La fotografía tomada ...

Discusión

La luz está en el corazón mismo de la fotografía y la videografía y es el factor decisivo para obtener imágenes de alta calidad¹⁶. Aquí, se utilizaron dos luces de video LED con brillo y temperatura de color ajustables como iluminadores, y se seleccionó un material translúcido para hacer el FBOC. Los paneles de luz LED en ambos lados proporcionaron suficiente brillo, y el material translúcido ablandó y dispersó la luz, produciendo finalmente luz uniforme, suave y brillante para iluminar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom