Um sistema de imagem de alta definição ajustável para estudos comportamentais de adultos drosophila

Resumo

Este protocolo descreve como fazer uma simples câmara de observação de comportamento drosophila adulto, e como tirar fotografias/vídeos de alta definição da morfologia ou comportamento de diferentes tipos de moscas de frutas na câmara de observação através de métodos relativamente simples e acessíveis.

Resumo

Drosophila melanogaster é um modelo muito poderoso em pesquisa biológica, mas um modelo ruim para fotografia ou videografia. Este artigo descreve um método simples, mas eficaz, para observar e documentar o comportamento ou morfologia das moscas. Moscas foram colocadas em uma câmara de observação translúcida c.a. Ø15 x 5mm (sem comida dentro) ou Ø15 x 12 mm (com um pedaço de alimento de 8 mm de altura dentro). Depois de cobrir com um filtro de vídeo ultravioleta (UV)/claro com transmissão de luz alta, a câmara foi colocada sob um microscópio estéreo de zoom de 5-50x, e mini luzes de vídeo de diodo emissor de luz (LED) foram colocadas em ambos os lados do microscópio para iluminar a câmara para obter luz uniforme, macia, brilhante e quase livre de sombras. Em seguida, uma câmera digital compacta com zoom óptico de 3-5x, que pode gravar vídeo de alta definição ou de maior resolução de 1080 P (a uma taxa de quadros de ≥30 fps), foi conectada à ocular do microscópio através de um suporte, e fotografias ou vídeos foram tirados pela ocular. Ajustando o botão de zoom do microscópio estéreo de zoom, foi muito fácil rastrear as moscas e tirar imagens panorâmicas ou detalhadas de close-up conforme necessário, enquanto a câmera gravava tudo sob o microscópio. Como as moscas podem ficar em qualquer posição na câmara, elas podem ser observadas e registradas de todas as direções. As fotografias ou vídeos feitos são de boa qualidade de imagem. Este método pode ser usado tanto para pesquisa científica quanto para ensino.

Introdução

Drosophila melanogaster é um modelo de destaque em pesquisa biológica; no entanto, é um modelo ruim para fotografia ou videografia, pois é muito pequeno para uma câmera ou uma filmadora e muito grande para um microscópio composto¹. Apesar de excelentes pesquisas descritas na literatura, a maioria dos estudos apenas forneceu imagens borradas e não claras, em vez de fotografias claras e nítidas com detalhes claros que ilustram o comportamento da mosca sendo descrito. Além disso, embora os comportamentos de mosca tenham sido extensivamente estudados (por exemplo, namoro e luta), a maioria desses artigos tem usado ilustrações para explicar suas pesquisas aos leitores.

Este artigo descreve uma abordagem simples e econômica. Usando este método, não só os diversos comportamentos de Drosophila podem ser observados, mas também todos os detalhes que podem ser observados sob um microscópio de zoom estéreo podem ser gravados de forma clara e acentuada. Claro, este método também pode ser usado para registrar a morfologia das moscas, pois quando elas entram em um estado de sono ou semissono, o modelo estacionário permite que o usuário tire uma fotografia ou uma pilha de fotografias com diferentes planos focais para obter uma ampla profundidade de foto de campo. Esses métodos podem ser realizados sem tecnologia complicada e equipamentos caros ou até mesmo excelentes habilidades manuais.

O componente de vídeo deste artigo mostra vídeos de vários comportamentos típicos de moscas. O objetivo de mostrar esses vídeos é duplo: um deles é deixar o público saber o que pode ser capturado e apresentar a qualidade da imagem obtida usando este método; o outro é deixar que novos alunos que se interessam por Drosophila, mas até agora não tiveram a oportunidade de realmente observar o comportamento das moscas entender o comportamento das moscas (como namoro, luta) através desses vídeos claros em vez de ilustrações ou imagens borradas.

Vídeo suplementar: Fruit Fly Behavior: Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Construção do sistema de observação/documentação

NOTA: Os materiais necessários para construir o sistema de observação/documentação do comportamento da mosca são mostrados na Figura 1, e o sistema concluído é mostrado na Figura 2. O protocolo para construir o sistema e como usá-lo são descritos abaixo.

1. Faça um fly behavior observation chamber (FBOC).
   1. Obtenha um recipiente pequeno e translúcido (não transparente) para fazer um FBOC de diâmetro de tamanho (Ø) 15 mm x 20 mm. Use uma tampa de garrafa plástica translúcida de tamanho ~Ø17 mm x 22 mm para fazer um FBOC, ou corte uma seção de ~17 mm da extremidade grossa de uma ponta de pipeta de 5 mL para fazer um FBOC.
   2. Despeje 1% de ágar no FBOC para ajustar sua profundidade. Se o alimento precisar ser colocado no FBOC (veja o método de preparo do alimento), despeje o ágar para obter uma profundidade de 12 mm. Se a comida não precisar ser colocada no FBOC, despeje o ágar a uma profundidade de 5 mm para rastrear o paradeiro das moscas de frutas com mais facilidade.
   3. Se usar uma ponta de pipeta para fazer um FBOC, coloque a seção de ponta de pipeta de corte em uma placa de Ø35 mm ou uma placa de Petri de Ø60 mm. Despeje o gel de 1% de ágar na placa de Petri até uma espessura de ~5 mm, espere o ágar se solidificar e sele o fundo do FBOC. Em seguida, despeje o gel de ágar no FBOC até a espessura desejada.
2. Faça uma base FBOC furando um furo de ~10 mm de profundidade no centro de um pedaço de uma folha de espuma de etilamina de 60 mm x 60 mm x 15 mm com o mesmo diâmetro do FBOC. Insira o FBOC no orifício.
   NOTA: A base FBOC mantém o FBOC estável e impede que ele tombe e facilite o movimento do FBOC para rastrear as moscas durante a observação e a videografia.
3. Faça comida de mosca, se necessário, com levedura média^2,dieta artificial³, ou sacarose pura/glicose (use 1% de ágar como agente de gelagem), dependendo da finalidade da observação.
   1. Para determinar visualmente se as moscas estão se alimentando e aumentar o contraste entre moscas e seu ambiente, adicione corantes alimentares (ver a Tabela de Materiais) ao alimento até uma concentração final de 12,5 mg/100mL.
      NOTA: Os abdômens das moscas mudam de cor imediatamente após a alimentação.
   2. Despeje a comida preparada em uma placa de Petri a uma altura de 8 mm. Após a solidificação, use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de alimento de tamanho 8 mm x 4 mm x 8 mm, e coloque-o em um pedaço de plástico (como o invólucro de doces).
   3. Corte a comida em uma pirâmide quadrangular ou pirâmide de frustum quadrangular, como mostrado na Figura 3,para permitir a observação e o registro do comportamento da mosca de diferentes ângulos à medida que as moscas pousam na comida aleatoriamente. Use o plástico sob o alimento para evitar que o corante no alimento se difunda no ágar no FBOC. Use pinças para colocar a comida no centro do FBOC.
4. Em algumas observações comportamentais, certifique-se de que as moscas estão famintas com antecedência. Despeje 1% de gel de ágar (1 g de água de ágar/100 mL, 600 μL de ácido propínico) em uma garrafa vazia limpa até uma espessura de 1-2 cm, e coloque em temperatura ambiente por 1-2 h. Transfira moscas para a garrafa e coloque a 25 °C por ≥36 h.
   NOTA: As moscas podem absorver água do gel de ágar, portanto não há necessidade de adicionar água de tempos em tempos^4,5.
5. Transfira uma ou mais moscas para o FBOC usando um aspirador. Se usar um aspirador é difícil, esfriar e inativar as moscas em gelo esmagado, classifique-as em uma bolsa de gelo e transfira-as para o FBOC como descrito anteriormente⁶.
   NOTA: O uso do congelamento facilita muito a transferência de moscas; as moscas geladas podem recuperar a consciência dentro de 1 min, muito mais rápido do que aquelas anestesiadas com CO₂. Embora o resfriamento possa ter efeitos prejudiciais sobre o comportamento das moscas, por exemplo, aumento da latência de cópula de moscas de 5 min⁷ a 40 min⁸, isso não muda o comportamento da mosca (como o comportamento de namoro). Assim, o método de refrigeração pode ser usado para transferir moscas para observação geral (como experimentos de ensino) e videografia. No entanto, se as observações forem usadas em um relatório científico, é fortemente recomendável não expor as moscas a nenhuma anestesia.
6. Depois de transferir as moscas para o FBOC, cubra-a com um filtro UV/claro de 30-40 mm para que a câmera forme um complexo FBOC(Figura 4). Coloque o complexo FBOC sob o estereótipo para observação.
   NOTA: Para obter imagens claras e nítidas, recomenda-se fortemente o uso de filtro UV/claro de alta qualidade com alta transmissão de luz (>98%) e sinalização reduzida. Consulte algumas sugestões descritas anteriormente^9,10; embora não haja necessidade de comprar filtros caros, evite cobrir o FBOC com vidro, como a tampa de uma placa de Petri.
7. Ilumine o FBOC. Monte luzes de vídeo mini LED para piscar suportes de suporte de sapato quente e colocá-los nos lados esquerdo e direito do FBOC (Figura 2). Acenda as luzes led e coloque o brilho em 100% e a temperatura da cor para 5000-5600 K.
   NOTA: As mini luzes de vídeo LED com luz escurecida, temperatura de cor de 5600 K podem fornecer iluminação uniforme, brilhante, quase sem sombra. Usando a fonte de luz superior que vem com o microscópio estéreo, o iluminador LED Ring Light ou o iluminador de fibra óptica não produziram resultados satisfatórios. É melhor usar fonte de alimentação contínua (transformadores) para luzes de vídeo LED.
8. Observação e videografia do comportamento da mosca
   1. Acenda as luzes de vídeo LED e ajuste o microscópio de zoom estéreo até que a borda do FBOC possa ser claramente vista a olho nu. Mova o FBOC para o centro do campo de visão.
   2. Conecte o grampo do adaptador de câmera digital do telescópio universal a uma ocular do microscópio estéreo e, em seguida, conecte uma câmera digital compacta ao adaptador com segurança, girando alternadamente o parafuso de fixação da câmera e o parafuso de fixação da câmera(Figura 2).
   3. Ligue a câmera digital e gire os botões de ajuste fino horizontal/vertical até que a borda do FBOC apareça claramente no centro do campo de visão circular brilhante na tela LCD da câmera. Gire o mostrador de modo para o modo auto-prioridade de abertura, pressione o foco no seletor multi, escolha o macro close-upe pressione o botão OK. Mova o interruptor de zoom da extremidade grande angular para a extremidade telefoto, e amplie na imagem circular até que sua parte central preencha a tela LCD completa. Pressione o botão de gravação do filme para iniciar a gravação (pressione o botão novamente para terminar a gravação).
      NOTA: Se a imagem estiver muito escura ou muito brilhante, pressione a lateral do mostrador de controle perto do ícone de compensação de exposição(Figura 1),e gire o mostrador para alterar o valor de exposição (EV) sugerido pela câmera para alcançar o efeito desejado. EVs positivos tornam a imagem mais brilhante, e EVs negativos tornam a imagem mais escura. A imagem deve ser uniforme, brilhante, sem vinheta.
   4. Gire o botão de foco do microscópio até que as moscas do FBOC estejam claramente visíveis. Escolha o comportamento de tempo de voo para observação ou gravação de vídeo. Gire o botão de zoom para ampliar e sair para obter a ampliação desejada para observação ou gravação de vídeo.
      NOTA: Este método de tirar imagens sob o microscópio através das oculares é aplicável a qualquer microscópio com oculares. Para tirar fotos de resultados experimentais, use uma câmera que pode filmar em formato RAW, pois os arquivos de imagem RAW são preferíveis aos JPEGs. Use a tela LCD da câmera como um visor para observar o comportamento das moscas de frutas e garantir que o microscópio de zoom estéreo tenha pelo menos 5-50x de zoom.

2. Protocolos de observação e videografia do comportamento da mosca

1. Preparando as moscas
   1. Cultura as moscas em meio de fubá a 25 °C com 60% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Recolher moscas dentro de 6 dias após a eclosão para observação (exceto namoro e comportamento de luta).
      NOTA: Aqui, o meio foi composto por 1000 mL de água, 105 g de farinha de fubá, 75 g de sacarose, 15 g de ágar, 40 g de fermento em pó, 28 mL de parabeno de metila de 10% (w/v em 95% de etanol) e 6,25 mL de ácido propício.
2. Recuperando a consciência da anestesia ao esfriar
   1. Esfrie as moscas como descrito anteriormente. ⁶ Transfira o Drosophila da caixa de gelo para o FBOC usando pinças. Registo do processo da mosca da inatividade à postura normal em vídeo.
3. Voar sono, alimentação, excreção e comportamento social
   1. A fome voa por 36 h. Transfira 4-6 moscas de frutas para o FBOC com comida manchada. Observe e grave o comportamento da mosca em vídeo.
      NOTA: Moscas que permanecem imóveis por mais de 5 minutos exibem comportamento sono¹¹. Drosophila pode dormir em alimentos ou em uma parede FBOC vertical (o corpo é perpendicular à parede da câmara de observação). Embora o corpo não se mova enquanto dorme, o abdômen pode ser visto como ondulante. O comportamento alimentar se manifesta quando a mosca estende sua proboscis, move-se sobre a comida enquanto amamenta constantemente, e seu abdômen fica azul. Durante a alimentação em grupo ou outras atividades, moscas frutíferas esticam seus pés para tocar os corpos de outras moscas frutíferas de forma amigável. Isso é um comportamento social.
4. Comportamento de preparação de moscas
   1. Esfrie as moscas como descrito⁶. Jogue as moscas congeladas em pó de ágar, e role para cobri-las com pó de ágar. Transfira as moscas para o FBOC. Observe e grave o comportamento de preparação.
      NOTA: Quando a mosca-das-frutas recupera a consciência do congelamento, ela rapidamente se livrará do pó de ágar de seu corpo e limpará cada parte de seu corpo com suas pernas^12,13. O comportamento de aliciamento também pode ser visto durante a alimentação, namoro e outros comportamentos.
5. Voar namoro e comportamento de luta
   1. Coletar moscas femininas e masculinas como descrito anteriormente⁷. Para observar o comportamento de namoro de moscas, coloque uma mosca fêmea e um macho voam para o FBOC para observar e registrar 6 comportamentos de namoro (bem sucedidos e fracassados).
   2. Para observar o comportamento de luta das moscas, coloque dois machos no FBOC. Observe e regise seu comportamento de empurrar e empurrar uns aos outros.
6. Comportamento de criação de ovos de mosca
   1. Prepare moscas fêmeas como descrito anteriormente⁵. Transfira 4 moscas fêmeas para fboc com comida.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Fotografe através de um filtro UV para imagens claras e nítidas
Realize um experimento simples para observar a diferença entre um filtro UV e um vidro comum no laboratório. Pegue um frasco de cultura de mosca, remova a rolha, coloque-a sob um microscópio de dissecação estéreo e cubra-o (alternadamente) com um filtro UV e uma tampa de placa de Petri. As fotografias tiradas nesses dois casos são mostradas na Figura 5. A fotografia tirada através do filtro UV é cl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

A luz está no centro da fotografia e da videografia e é o fator decisivo para a obtenção de imagens de alta qualidade¹⁶. Aqui, duas luzes de vídeo LED com brilho ajustável e temperatura de cor foram usadas como iluminadores, e um material translúcido foi selecionado para fazer o FBOC. Os painéis de luz LED em ambos os lados forneceram brilho suficiente, e o material translúcido suavizou e espalhou luz, eventualmente produzindo luz uniforme, macia e brilhante para iluminar as moscas no FBO...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom