Регулируемая система визуализации высокой четкости для поведенческих исследований взрослых дрозофил

Резюме

Этот протокол описывает, как сделать простую камеру наблюдения за поведением взрослых дрозофил и как делать фотографии / видео высокой четкости морфологии или поведения различных видов плодовых мушек в камере наблюдения с помощью относительно простых и доступных методов.

Аннотация

Drosophila melanogaster является очень мощной моделью в биологических исследованиях, но плохой моделью для фотографии или видеографии. В этой статье описывается простой, но эффективный метод наблюдения и документирования поведения или морфологии мух. Мух помещали в полупрозрачную наблюдательную камеру c.a. Ø15 x 5 мм (без пищи внутри) или Ø15 x 12 мм (с куском пищи высотой 8 мм внутри). После покрытия ультрафиолетовым (УФ) / прозрачным фильтром с высоким коэффициентом пропускания света камера была помещена под стереомикроскоп с 5-50-кратным зумом, а мини-светодиодные (LED) видеофоны были размещены на обеих сторонах микроскопа для освещения камеры для получения однородного, мягкого, яркого и почти безтеневого света. Затем компактная цифровая камера с 3-5-кратным оптическим зумом, которая может записывать видео высокой четкости 1080 P или более высокого разрешения (с частотой кадров ≥30 кадров в секунду), была подключена к окуляру микроскопа через кронштейн, а фотографии или видео были сделаны через окуляр. Регулируя ручку масштабирования стереомикроскопа, было очень легко отслеживать мух и делать панорамные или подробные снимки крупным планом по мере необходимости, в то время как камера записывала все под микроскопом. Поскольку мухи могут оставаться в любом положении в камере, их можно наблюдать и записывать со всех сторон. Сделанные фотографии или видео имеют хорошее качество изображения. Этот метод может быть использован как для научных исследований, так и для обучения.

Введение

Drosophila melanogaster является выдающейся моделью в биологических исследованиях; однако это плохая модель для фотографии или видеографии, так как она слишком мала для фотоаппарата или видеокамеры и слишком велика для составного микроскопа^1. Несмотря на отличные исследования, описанные в литературе, большинство исследований предоставили только размытые, неясные изображения, а не четкие и четкие фотографии с четкими деталями, которые иллюстрируют описываемое поведение мухи. Более того, хотя поведение мух было широко изучено (например, ухаживания и драки), большинство из этих статей использовали иллюстрации, чтобы объяснить свои исследования читателям.

В данной работе описывается простой и экономичный подход. С помощью этого метода можно наблюдать не только различное поведение дрозофилы, но и все детали, которые можно наблюдать под микроскопом со стереозумом, могут быть записаны четко и резко. Конечно, этот метод также может быть использован для записи морфологии мух, так как когда они входят в состояние сна или полусня, стационарная модель позволяет пользователю сделать фотографию или стопку фотографий с различными фокальными плоскостями, чтобы получить фотографию с расширенной глубиной резкости. Эти методы могут быть реализованы без сложных технологий и дорогостоящего оборудования или даже превосходных ручных навыков.

Видеокомпонент этой статьи показывает видео нескольких типичных видов поведения мух. Цель показа этих видео двояка: во-в том, чтобы дать аудитории знать, что можно захватить, и представить качество изображения, полученного с помощью этого метода; другой — позволить новым студентам, которые интересуются дрозофилой, но до сих пор не имели возможности реально наблюдать за поведением мух, понять поведение мух (например, ухаживания, драки) с помощью этих четких видео, а не иллюстраций или размытых изображений.

Дополнительное видео: Поведение плодовой мухи: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

протокол

1. Построение системы наблюдения/документирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для построения системы наблюдения/документирования поведения мух, показаны на рисунке 1,а завершенная система показана на рисунке 2. Протокол построения системы и способы его использования описаны ниже.

1. Make a fly behavior observation chamber (FBOC).
   1. Получите небольшой, полупрозрачный (не прозрачный) контейнер, чтобы сделать FBOC диаметром (Ø) 15 мм х 20 мм. Используйте полупрозрачную пластиковую крышку бутылки размером ~ Ø17 мм x 22 мм, чтобы сделать FBOC, или вырежьте сечение ~ 17 мм от толстого конца наконечника пипетки 5 мл, чтобы сделать FBOC.
   2. Налейте 1% агара в FBOC, чтобы отрегулировать его глубину. Если пищу необходимо поместить в FBOC (см. способ приготовления пищи), налейте агар до глубины 12 мм. Если пищу не нужно помещать в FBOC, налейте агар на глубину 5 мм, чтобы легче отслеживать местонахождение плодовых мушек.
   3. Если для изготовления FBOC используется наконечник пипетки, поместите отрезной наконечник пипетки в чашку Петри Ø35 мм или Ø60 мм. Вылейте 1% агаровый гель в чашку Петри толщиной ~5 мм, подождите, пока агар затвердеет, и запечатайте дно FBOC. Затем влейте агаровой гель в FBOC до нужной толщины.
2. Сделайте основание FBOC, расверлив отверстие глубиной ~10 мм в центре куска листа этиламиновой пены размером 60 мм x 60 мм x 15 мм с тем же диаметром, что и FBOC. Вставьте FBOC в отверстие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: База FBOC поддерживает стабильность FBOC и предотвращает его опрокидывание, а также облегчает движение FBOC для отслеживания мух во время наблюдения и видеосъемки.
3. При необходимости приготовьте пищу для мух с дрожжевой средой^2,искусственной диетой³или чистой сахарозой/глюкозой (используйте 1% агар в качестве желирования), в зависимости от цели наблюдения.
   1. Чтобы визуально определить, кормятся ли мухи, и увеличить контраст между мухами и окружающей их средой, добавьте пищевые красители (см. Таблицу материалов)в пищу до конечной концентрации 12,5 мг/100 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Брюшко мух меняет цвет сразу после кормления.
   2. Налейте приготовленную пищу в чашку Петри на высоту 8 мм. После затвердевания используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать кусок пищи размером 8 мм х 4 мм х 8 мм и поместить его на кусок пластика (например, обертку для конфет).
   3. Разрежьте пищу на четырехугольную пирамиду или четырехугольную пирамиду фрустума, как показано на рисунке 3,чтобы обеспечить наблюдение и регистрацию поведения мух под разными углами, когда мухи приземляются на пищу случайным образом. Использование пластика под пищей заключается в том, чтобы предотвратить диффузию красителя в пище в агар в FBOC. Используйте пинцет, чтобы поместить пищу в центр FBOC.
4. В некоторых поведенческих наблюдениях следите за тем, чтобы мухи голодали заранее. Вылейте 1% агар-гель (1 г агара/100 мл воды, 600 мкл пропионовой кислоты) в чистую пустую бутылку толщиной 1-2 см и поместите при комнатной температуре на 1-2 ч. Переложите мухи в бутылку и поместите при 25 °C в течение ≥36 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут поглощать воду из агарового геля, поэтому нет необходимости время от времени добавлять воду^4,5.
5. Перенесите одну или несколько мух в FBOC с помощью аспиратора. Если использование аспиратора затруднено, охладите и инактивируйте мух в измельченном льду, отсортируйте их на пакете со льдом и перенесите их в FBOC, как описано^{ранее 6.}
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование замораживания значительно облегчает перенос мух; охлажденные мухи могут прийти в сознание в течение 1 мин, намного быстрее, чем те, кто обезболен_СО2. Хотя охлаждение может иметь пагубные последствия для поведения мух, например, увеличение задержки совокупления мух с 5 мин⁷ до 40 мин^8,оно не изменяет поведение мух (например, поведение ухаживания). Следовательно, метод охлаждения может быть использован для передачи мух для общего наблюдения (например, обучающих экспериментов) и видеографии. Однако, если наблюдения должны быть использованы в научном отчете, настоятельно рекомендуется не подвергать мух какой-либо анестезии.
6. После передачи мух в FBOC накройте его 30-40 мм УФ/прозрачным фильтром для камеры, чтобы сформировать комплекс FBOC(рисунок 4). Поместите комплекс FBOC под стереомикроскоп для наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения четких и четких изображений настоятельно рекомендуется использовать высококачественный УФ/прозрачный фильтр с высоким коэффициентом пропускания света (>98%) и уменьшенной вспышкой. Обратитесь к некоторым предложениям, описанным^{ранее 9,10}; хотя нет необходимости покупать дорогие фильтры, избегайте покрытия FBOC стеклом, таким как крышка чашки Петри.
7. Осветить FBOC. Установите мини светодиодные видеофоны для вспышки горячих подставок для крепления обуви и разместите их на левой и правой сторонах FBOC(рисунок 2). Включите светодиодные индикаторы и установите яркость на 100%, а цветовую температуру на 5000-5600 K.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мини-светодиодные видео-фонари с затемняемым светом, цветовой температурой 5600 K могут обеспечить равномерное, яркое, почти без тени освещение. Использование верхнего источника света, который поставляется со стереомикроскопом, светодиодным кольцевым осветителем или волоконно-оптическим осветителем не дало удовлетворительных результатов. Лучше всего использовать источник непрерывного питания (трансформаторы) для светодиодных видеолайтов.
8. Наблюдение и видеография поведения мух
   1. Включите светодиодные видеофоны и отрегулируйте стереозум-микроскоп до тех пор, пока край FBOC не станет четко виден невооруженным глазом. Переместите FBOC в центр поля зрения.
   2. Прикрепите зажим адаптера цифровой камеры универсального телескопа к окуляру стереомикроскопа, а затем надежно прикрепите к адаптеру компактную цифровую камеру, поочередно поворачивая крепежный винт камеры и винт крепления камеры(рисунок 2).
   3. Включите цифровую камеру и поворачивайте горизонтальные/вертикальные ручки тонкой настройки до тех пор, пока край FBOC четко не появится в центре яркого круглого поля зрения на ЖК-экране камеры. Поверните диск режима в автоматический режим с приоритетом диафрагмы,нажмите кнопку фокусировки на мульти селекторе, выберите Макро крупный план,а затем нажмите кнопку ОК. Переместите переключатель масштабирования с широкоугольного конца на телеобъектив и увеличьте масштаб кругового изображения до тех пор, пока его центральная часть не заполнит весь ЖК-экран. Нажмите кнопку Видеозапись, чтобы начать запись (нажмите кнопку еще раз, чтобы завершить запись).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение слишком темное или слишком яркое, нажмите боковую часть контрольного диска рядом со значком компенсации экспозиции(рисунок 1)и поверните циферблат, чтобы изменить значение экспозиции (EV), предложенное камерой, для достижения желаемого эффекта. Положительные электромобили делают изображение ярче, а отрицательные электромобили делают изображение темнее. Изображение должно быть равномерным, ярким, без виньетирования.
   4. Поверните ручку фокусировки микроскопа до тех пор, пока мухи в FBOC не будут хорошо видны. Выберите интересующее поведение мухи для наблюдения или видеозаписи. Поверните ручку масштабирования, чтобы увеличить и уменьшить масштаб, чтобы достичь желаемого увеличения для наблюдения или видеозаписи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод получения изображений под микроскопом через окуляры применим к любому микроскопу с окулярами. Чтобы сделать фотографии экспериментальных результатов, используйте камеру, которая может снимать в формате RAW, так как файлы изображений RAW предпочтительнее JPEG. Используйте ЖК-экран камеры в качестве дисплея для наблюдения за поведением плодовых мушек и убедитесь, что стереозум-микроскоп имеет по крайней мере 5-50-кратный зум.

2. Протоколы наблюдения и видеосъемки поведения мух

1. Подготовка мух
   1. Культивьйте мух на кукурузной мяколе при 25 °C с влажностью 60% и циклом 12 ч света/темноты. Собирайте мух в течение 6 дней после вылупления для наблюдения (кроме ухаживания и боевого поведения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь среда состояла из 1000 мл воды, 105 г кукурузной муки, 75 г сахарозы, 15 г агара, 40 г дрожжевого порошка, 28 мл 10% метилпарабена (мас./об.в 95% этанола) и 6,25 мл пропионовой кислоты.
2. Восстановление сознания после анестезии путем охлаждения
   1. Охладите мух, как описано ранее. ⁶ Перенесите дрозофилу из ледяного ящика в FBOC с помощью пинцеста. Запишите процесс мухи от бездействия до нормальной позы на видео.
3. Сон мух, кормление, экскреция и социальное поведение
   1. Голодная муха в течение 36 ч. Перенесите 4-6 плодовых мушек в FBOC с окрашенной пищей. Наблюдайте и записывайте поведение мух на видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи, которые остаются неподвижными более 5 минут, отображают поведение сна¹¹. Дрозофила может спать на пище или на вертикальной стенке FBOC (тело перпендикулярно стенке камеры наблюдения). Хотя тело не двигается во время сна, живот может быть волнообразным. Пищевое поведение проявляется, когда муха вытягивает свой виток, перемещается по пище, постоянно сосая, а ее брюшко синеет. Во время группового кормления или других видов деятельности плодовые мушки вытягивают свои ноги, чтобы дружелюбно прикасаться к телам других плодовых мушек. Это социальное поведение.
4. Поведение мухи при уходе за мухой
   1. Охладите мух, как описано⁶. Бросьте замороженных мух в порошок агара и свертите, чтобы покрыть их порошком агара. Передавайте мух в FBOC. Наблюдайте и записывайте поведение груминга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда плодовая муха придет в сознание от замерзания, она быстро стряхнет порошок агара со своего тела и очистит каждую часть своего тела ногами^12,13. Поведение груминга также можно увидеть во время кормления, ухаживания и другого поведения.
5. Ухаживание мухи и боевое поведение
   1. Собирайте самок и самцов мух, как описано^{ранее 7.} Чтобы наблюдать за поведением мух, поместите самку мухи и самца мухи в FBOC, чтобы наблюдать и записывать 6 ухаживаний (успешных и неудачных) поведения.
   2. Чтобы наблюдать за боевым поведением мух, поместите двух самцов в FBOC. Наблюдайте и записывайте их поведение, толкая и толкая друг друга.
6. Поведение мухи при яйцекладке
   1. Готовят самок мух, как описано^{ранее 5}. Перенесите 4 самки мух в FBOC с едой.

Результаты

Съемка через УФ-фильтр для получения четких и четких изображений
Провести простой эксперимент, чтобы наблюдать разницу между УФ-фильтром и обычным стеклом в лаборатории. Возьмите флакон с культурой мух, снимите пробку, поместите ее под стереопарифицирующий микроскоп и накр?...

Обсуждение

Свет лежит в основе фотографии и видеографии и является решающим фактором для получения высококачественных изображений¹⁶. Здесь в качестве осветителей использовались два светодиодных видеосвета с регулируемой яркостью и цветовой температурой, а для изготовления FBOC был в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom