Un sistema di imaging ad alta definizione regolabile per studi comportamentali di adulti drosofili

Riepilogo

Questo protocollo descrive come creare una semplice camera di osservazione del comportamento della Drosophila adulta e come scattare fotografie / video ad alta definizione della morfologia o del comportamento di diversi tipi di moscerini della frutta nella camera di osservazione attraverso metodi relativamente semplici e convenienti.

Abstract

Drosophila melanogaster è un modello molto potente nella ricerca biologica, ma un cattivo modello per la fotografia o la videografia. Questo documento descrive un metodo semplice ma efficace per osservare e documentare il comportamento o la morfologia delle mosche. Le mosche sono state collocate in una camera di osservazione traslucida c.a. Ø15 x 5mm (senza cibo all'interno) o Ø15 x 12 mm (con un pezzo di cibo alto 8 mm all'interno). Dopo aver coperto con un filtro ultravioletto (UV) / trasparente ad alta trasmittanza luminosa, la camera è stata posizionata sotto uno stereomicroscopio con zoom 5-50x e sono state posizionate mini luci video a diodi emettitori di luce (LED) su entrambi i lati del microscopio per illuminare la camera per ottenere una luce uniforme, morbida, luminosa e quasi priva di ombre. Quindi, una fotocamera digitale compatta con zoom ottico 3-5x, in grado di registrare video ad alta definizione o risoluzione superiore 1080 P (a una frequenza fotogrammi di ≥30 fps), è stata collegata all'oculare del microscopio tramite una staffa e fotografie o video sono stati scattati attraverso l'oculare. Regolando la manopola dello zoom dello stereomicroscopio zoom, è stato molto facile tracciare le mosche e scattare immagini ravvicinate panoramiche o dettagliate secondo necessità, mentre la fotocamera registrava tutto al microscopio. Poiché le mosche possono rimanere in qualsiasi posizione nella camera, possono essere osservate e registrate da tutte le direzioni. Le fotografie o i video scattati sono di buona qualità dell'immagine. Questo metodo può essere utilizzato sia per la ricerca scientifica che per l'insegnamento.

Introduzione

Drosophila melanogaster è un modello eccezionale nella ricerca biologica; tuttavia, è un cattivo modello per la fotografia o la videografia, in quanto è troppo piccolo per una fotocamera o una videocamera e troppo grande per un microscopio composto¹. Nonostante l'eccellente ricerca descritta in letteratura, la maggior parte degli studi ha fornito solo immagini sfocate e poco chiare, piuttosto che fotografie chiare e nitide con dettagli chiari che illustrano il comportamento della mosca descritta. Inoltre, sebbene i comportamenti delle mosche siano stati ampiamente studiati (ad esempio, corteggiamento e combattimento), la maggior parte di questi articoli ha usato illustrazioni per spiegare la loro ricerca ai lettori.

Questo documento descrive un approccio semplice ed economico. Utilizzando questo metodo, non solo i vari comportamenti di Drosophila possono essere osservati, ma anche tutti i dettagli che possono essere osservati sotto un microscopio stereo zoom possono essere registrati in modo chiaro e nitido. Naturalmente, questo metodo può essere utilizzato anche per registrare la morfologia delle mosche, poiché quando entrano in uno stato di sonno o semi-sonno, il modello stazionario consente all'utente di scattare una fotografia o una pila di fotografie con diversi piani focali per ottenere una foto di profondità di campo estesa. Questi metodi possono essere realizzati senza tecnologia complicata e attrezzature costose o anche superbe abilità manuali.

La componente video di questo articolo mostra video di diversi comportamenti tipici delle mosche. Lo scopo di mostrare questi video è duplice: uno è quello di far sapere al pubblico cosa può essere catturato e presentare la qualità dell'immagine ottenuta utilizzando questo metodo; l'altro è quello di lasciare che i nuovi studenti che sono interessati alla Drosophila, ma finora non hanno avuto l'opportunità di osservare effettivamente il comportamento delle mosche capiscano il comportamento delle mosche (come corteggiamento, combattimento) attraverso questi video chiari piuttosto che illustrazioni o immagini sfocate.

Video supplementare: Comportamento del moscerinodellafrutta: Fare clic qui per scaricare questo file.

Protocollo

1. Costruzione del sistema di osservazione/documentazione

NOTA: I materiali necessari per costruire il sistema di osservazione/documentazione del comportamento della mosca sono mostrati nella Figura 1e il sistema completato è mostrato nella Figura 2. Il protocollo per costruire il sistema e come usarlo sono descritti di seguito.

1. Make a fly behavior observation chamber (FBOC).
   1. Procuratevi un contenitore piccolo e traslucido (non trasparente) per realizzare un FBOC di dimensioni diametro (Ø) 15 mm x 20 mm. Utilizzare un tappo di bottiglia di plastica traslucida di dimensioni ~ Ø17 mm x 22 mm per creare un FBOC o tagliare una sezione di ~ 17 mm dall'estremità spessa di una punta della pipetta da 5 ml per creare un FBOC.
   2. Versare l'1% di agar nell'FBOC per regolarne la profondità. Se il cibo deve essere collocato nel FBOC (vedi per il metodo di preparazione del cibo), versare l'agar per ottenere una profondità di 12 mm. Se il cibo non ha bisogno di essere collocato nell'FBOC, versare l'agar a una profondità di 5 mm per tracciare più facilmente la posizione dei moscerini della frutta.
   3. Se si utilizza una punta della pipetta per creare un FBOC, posizionare la sezione della punta della pipetta di taglio in una piastra di Petri Ø35 mm o Ø60 mm. Versare il gel di agar all'1% nella capsula di Petri ad uno spessore di ~ 5 mm, attendere che l'agar si solidifichi e sigillare il fondo dell'FBOC. Quindi, versare il gel di agar nell'FBOC allo spessore desiderato.
2. Crea una base FBOC perforando un foro profondo ~ 10 mm al centro di un pezzo di un foglio di schiuma di etilammina da 60 mm x 60 mm x 15 mm con lo stesso diametro dell'FBOC. Inserire l'FBOC nel foro.
   NOTA: La base FBOC mantiene stabile l'FBOC e impedisce che si ribalti e facilita il movimento dell'FBOC per tracciare le mosche durante l'osservazione e la videografia.
3. Fare cibo mosca, se necessario, con lievito medio², dieta artificiale³, o saccarosio puro / glucosio (utilizzare l'agar all'1% come agente gelificante), a seconda dello scopo dell'osservazione.
   1. Per determinare visivamente se le mosche si stanno nutrendo e aumentare il contrasto tra le mosche e il loro ambiente, aggiungere coloranti alimentari (vedere la tabella dei materiali)al cibo per una concentrazione finale di 12,5 mg / 100 ml.
      NOTA: gli addominali delle mosche cambiano colore immediatamente dopo l'alimentazione.
   2. Versare il cibo preparato in una capsula di Petri ad un'altezza di 8 mm. Dopo la solidificazione, utilizzare una lama di rasoio per ritagliare un pezzo di cibo di dimensioni 8 mm x 4 mm x 8 mm e posizionarlo su un pezzo di plastica (come un involucro di caramelle).
   3. Tagliare il cibo in una piramide quadrangolare o piramide quadrangolare di frusto, come mostrato nella Figura 3, per consentire l'osservazione e la registrazione del comportamento della mosca da diverse angolazioni mentre le mosche atterrano sul cibo in modo casuale. Utilizzare la plastica sotto il cibo è per evitare che il colorante nel cibo si diffonde nell'agar nell'FBOC. Usa una pinzetta per posizionare il cibo al centro dell'FBOC.
4. In alcune osservazioni comportamentali, assicurarsi che le mosche siano affamate in anticipo. Versare l'1% di gel di agar (1 g di agar/100 mL di acqua, 600 μL di acido propionico) in una bottiglia vuota pulita fino a uno spessore di 1-2 cm e posizionare a temperatura ambiente per 1-2 ore. Il trasferimento vola alla bottiglia e posto a 25 °C per ≥36 h.
   NOTA: le mosche possono assorbire l'acqua dal gel di agar, quindi non è necessario aggiungere acqua di volta in volta^4,5.
5. Trasferisci una o più mosche nell'FBOC usando un aspiratore. Se l'uso di un aspiratore è difficile, raffreddare e inattivare le mosche nel ghiaccio tritato, ordinarle su un impacco di ghiaccio e trasferirle all'FBOC come descritto in precedenza⁶.
   NOTA: L'uso del congelamento facilita notevolmente il trasferimento delle mosche; le mosche refrigerate possono riprendere conoscenza entro 1 minuto, molto più velocemente di quelle anestetizzate con CO_2. Sebbene il raffreddamento potrebbe avere effetti dannosi sul comportamento delle mosche, ad esempio una maggiore latenza di copulazione delle mosche da 5 min⁷ a 40 min⁸, non cambia il comportamento della mosca (come il comportamento di corteggiamento). Quindi, il metodo di raffreddamento può essere utilizzato per trasferire le mosche per l'osservazione generale (come esperimenti di insegnamento) e la videografia. Tuttavia, se le osservazioni devono essere utilizzate in un rapporto scientifico, si raccomanda vivamente di non esporre le mosche ad alcuna anestesia.
6. Dopo aver trasferito le mosche all'FBOC, coprilo con un filtro UV/clear da 30-40 mm affinché la telecamera formi un complesso FBOC (Figura 4). Posizionare il complesso FBOC sotto lo stereomicroscopio per l'osservazione.
   NOTA: Per ottenere immagini chiare e nitide, si consiglia vivamente di utilizzare un filtro UV/clear di alta qualità con elevata trasmittanza luminosa (>98%) e flare ridotto. Fare riferimento ad alcuni suggerimenti descritti in precedenza^9,10; anche se non è necessario acquistare filtri costosi, evitare di coprire l'FBOC con vetro come il coperchio di una capsula di Petri.
7. Illumina l'FBOC. Montare mini luci video a LED per far lampeggiare i supporti di montaggio hot shoe e posizionarli sui lati sinistro e destro dell'FBOC (Figura 2). Accendere le luci a LED e impostare la luminosità su 100% e la temperatura del colore su 5000-5600 K.
   NOTA: le mini luci video a LED con luce dimmerabile, temperatura di colore 5600 K possono fornire un'illuminazione uniforme, luminosa, quasi priva di ombre. L'utilizzo della sorgente luminosa superiore fornita con lo stereomicroscopio, l'illuminatore LED Ring Light o l'illuminatore in fibra ottica non ha prodotto risultati soddisfacenti. È meglio utilizzare l'alimentazione continua (trasformatori) per le luci video a LED.
8. Osservazione e videografia del comportamento della mosca
   1. Accendi le luci video a LED e regola il microscopio con zoom stereo fino a quando il bordo dell'FBOC può essere visto chiaramente ad occhio nudo. Sposta l'FBOC al centro del campo visivo.
   2. Collegare saldamente il morsetto dell'adattatore universale per fotocamera digitale del telescopio a un oculare dello stereomicroscopio, quindi collegare saldamente una fotocamera digitale compatta all'adattatore ruotando alternativamente la vite di montaggio della fotocamera e la vite di fissaggio della fotocamera (Figura 2).
   3. Accendere la fotocamera digitale e ruotare le manopole di regolazione orizzontale/verticale fino a quando il bordo FBOC appare chiaramente al centro del campo visivo circolare luminoso sullo schermo LCD della fotocamera. Ruotare la ghiera di modalità su Modalità automatica con priorità di apertura, premere lo stato attivo sul multiselettore, scegliere Primo piano macroe quindi premere il pulsante OK. Spostare l'interruttore dello zoom dall'estremità grandangolare all'estremità del teleobiettivo e ingrandire l'immagine circolare fino a quando la sua parte centrale non riempie l'intero schermo LCD. Premere il pulsante Movie-record per avviare la registrazione (premere nuovamente il pulsante per terminare la registrazione).
      NOTA: se l'immagine è troppo scura o troppo luminosa, premere il lato della ghiera di controllo vicino all'icona di compensazione dell'esposizione (Figura 1) e ruotare la ghiera per modificare il valore di esposizione (EV) suggerito dalla fotocamera per ottenere l'effetto desiderato. I veicoli elettrici positivi rendono l'immagine più luminosa e i veicoli elettrici negativi rendono l'immagine più scura. L'immagine deve essere uniforme, luminosa, senza vignettatura.
   4. Ruota la manopola di messa a fuoco del microscopio fino a quando le mosche nell'FBOC sono chiaramente visibili. Scegli il comportamento di volo di interesse per l'osservazione o la registrazione video. Ruotare la manopola dello zoom per ingrandire e rimpicciolire per ottenere l'ingrandimento desiderato per l'osservazione o la registrazione video.
      NOTA: Questo metodo di acquisizione di immagini al microscopio attraverso gli oculari è applicabile a qualsiasi microscopio con oculari. Per scattare fotografie dei risultati sperimentali, utilizzare una fotocamera in grado di scattare in formato RAW, poiché i file di immagine RAW sono preferibili ai JPEG. Utilizzare lo schermo LCD della fotocamera come display per osservare il comportamento dei moscerini della frutta e assicurarsi che il microscopio stereo zoom abbia almeno uno zoom 5-50x.

2. Protocolli per l'osservazione e la videografia del comportamento della mosca

1. Preparare le mosche
   1. Coltivate le mosche su mezzo di farina di mais a 25 °C con il 60% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore. Raccogli le mosche entro 6 giorni dalla schiusa per l'osservazione (tranne il corteggiamento e il comportamento di combattimento).
      NOTA: Qui, il mezzo era composto da 1000 ml di acqua, 105 g di farina di farina di mais, 75 g di saccarosio, 15 g di agar, 40 g di lievito in polvere, 28 ml di parabene metilico al 10% (p / v in etanolo al 95%) e 6,25 ml di acido propionico.
2. Riprendere conoscenza dall'anestesia agghiacciando
   1. Raffreddare le mosche come descritto in precedenza. ⁶ Trasferire la Drosophila dalla ghiacciaia all'FBOC usando una pinzetta. Registra il processo della mosca dall'inattività alla postura normale in video.
3. Vola sonno, alimentazione, escrezione e comportamento sociale
   1. Starve vola per 36 h. Trasferisci 4-6 moscerini della frutta all'FBOC con cibo macchiato. Osserva e registra il comportamento delle mosche in video.
      NOTA: le mosche che rimangono immobili per più di 5 minuti mostrano il comportamento del sonno¹¹. La drosophila può dormire sul cibo o su una parete verticale FBOC (il corpo è perpendicolare alla parete della camera di osservazione). Sebbene il corpo non si muova durante il sonno, l'addome può essere visto come ondulato. Il comportamento alimentare si manifesta quando la mosca allunga la sua proboscide, si muove sul cibo mentre succhia costantemente e il suo addome diventa blu. Durante l'alimentazione di gruppo o altre attività, i moscerini della frutta allungano i piedi per toccare i corpi di altri moscerini della frutta in modo amichevole. Questo è un comportamento sociale.
4. Comportamento di toelettatura delle mosche
   1. Raffreddare le mosche come descritto⁶. Getta le mosche congelate in polvere di agar e rotola per coprirle con polvere di agar. Trasferisci le mosche alla FBOC. Osserva e registra il comportamento di toelettatura.
      NOTA: Quando il moscerino della frutta riprende conoscenza dal congelamento, si scrolla rapidamente di dosso la polvere di agar dal suo corpo e pulisce ogni parte del suo corpo con le gambe^12,13. Il comportamento di toelettatura può anche essere visto durante l'alimentazione, il corteggiamento e altri comportamenti.
5. Vola corteggiamento e comportamento di combattimento
   1. Raccogli mosche femmine e maschi come descritto in precedenza⁷. Per osservare il comportamento di corteggiamento delle mosche, inserisci una mosca femmina e una mosca maschio nell'FBOC per osservare e registrare 6 comportamenti di corteggiamento (riusciti e falliti).
   2. Per osservare il comportamento di combattimento delle mosche, posiziona due maschi nella FBOC. Osserva e registra il loro comportamento di spingersi e spingersi l'un l'altro.
6. Comportamento di deposizione delle uova volanti
   1. Preparare le mosche femminili come descritto in precedenza⁵. Trasferisci 4 mosche femminili in FBOC con cibo.

Risultati

Scatta attraverso un filtro UV per immagini chiare e nitide
Esegui un semplice esperimento per osservare la differenza tra un filtro UV e il vetro ordinario in laboratorio. Prendi una fiala di coltura di mosche, rimuovi il tappo, mettilo sotto un microscopio stereo di dissezione e coprilo (alternativamente) con un filtro UV e un coperchio della capsula di Petri. Le fotografie scattate in questi due casi sono mostrate nella Figura 5. La fotografia scattata attraverso il fi...

Discussione

La luce è al centro della fotografia e della videografia ed è il fattore decisivo per ottenere immagini di alta qualità¹⁶. Qui, due luci video a LED con luminosità e temperatura del colore regolabili sono state utilizzate come illuminatori e un materiale traslucido è stato selezionato per realizzare l'FBOC. I pannelli luminosi a LED su entrambi i lati fornivano una luminosità sufficiente e il materiale traslucido ammorbidiva e spargeva la luce, producendo infine una luce uniforme, morbida e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom