드로소필라 성인의 행동 연구를 위한 조정 가능한 고화질 화상 진찰 시스템

요약

이 프로토콜은 간단한 성인 Drosophila 행동 관측실을 만드는 방법, 그리고 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 통해 관찰실에서 과일 파리의 다른 유형의 형태 또는 행동의 고화질 사진 / 비디오를 찍는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Drosophila 멜라노가스터는 생물학적 연구에서 매우 강력한 모델이지만 사진이나 비디오 그래피에 대한 나쁜 모델입니다. 이 문서에서는 파리의 동작이나 형태를 관찰하고 문서화하는 간단하지만 효과적인 방법을 설명합니다. 파리는 반투명 관측실 c.a.a에 배치되었다. Ø15 x 5mm(내부 음식 없음) 또는 Ø15 x 12mm(내부에 8mm 높이의 음식). 자외선(UV)/투명 필터로 덮은 후, 챔버는 5-50x 줌 스테레오 현미경 아래에 배치되었고, 미니 발광 다이오드(LED) 비디오 라이트는 현미경의 양쪽에 배치되어 균일하고 부드럽고 밝으며 거의 그림자가 없는 빛을 얻기 위해 챔버를 조명하였다. 그런 다음, 1080 P 고화질 또는 고해상도 비디오(≥30fps의 프레임 속도로)를 녹화할 수 있는 3-5배 광학 줌을 갖춘 컴팩트한 디지털 카메라가 브래킷을 통해 현미경의 안면에 연결되었고, 사진이나 비디오는 접안을 통해 촬영되었다. 줌 스테레오 현미경의 줌 노브를 조정함으로써, 카메라가 현미경으로 모든 것을 기록하는 동안, 파리를 추적하고 필요에 따라 파노라마 또는 상세한 클로즈업 이미지를 취할 매우 쉬웠다. 파리는 챔버의 모든 위치에 머물 수 있기 때문에, 그들은 관찰하고 모든 방향에서 기록 할 수 있습니다. 찍은 사진이나 비디오는 좋은 이미지 품질입니다. 이 방법은 과학 연구와 교육에 모두 사용할 수 있습니다.

서문

드로소필라 멜라노가스터는 생물학적 연구에서 뛰어난 모델입니다. 그러나 카메라나 캠코더에 너무 작고 화합물 현미경^1에너무 크기 때문에 사진이나 비디오 그래피에 대한 나쁜 모델이다. 문학에 설명 된 우수한 연구에도 불구하고, 대부분의 연구는 설명되는 비행 행동을 설명하는 명확한 세부 사항을 가진 명확하고 날카로운 사진보다는 흐릿하고 불분명한 이미지만 제공했습니다. 또한, 비행 행동은 광범위하게 연구되었지만 (예 : 구애와 싸움), 이러한 논문의 대부분은 독자에게 자신의 연구를 설명하기 위해 그림을 사용했다.

이 논문은 간단하고 경제적인 접근 방식을 설명합니다. 이 방법을 이용하여, Drosophila의 다양한 행동뿐만 아니라 스테레오 줌 현미경하에서 관찰 될 수있는 모든 세부 사항을 명확하고 날카롭게 기록 할 수 있습니다. 물론,이 방법은 또한 그들이 수면 또는 반 수면 상태에 들어갈 때와 같이, 파리의 형태를 기록하는 데 사용할 수 있습니다, 고정 모델은 사용자가 사진이나 다른 초점 평면과 사진의 스택을 취할 수 있습니다 필드 사진의 확장 깊이를 얻을 수 있습니다. 이러한 방법은 복잡한 기술과 고가의 장비 또는 뛰어난 수동 기술없이 실현 될 수있다.

이 문서의 비디오 구성 요소는 파리의 몇 가지 일반적인 동작의 비디오를 보여줍니다. 이 동영상을 보여주는 목적은 두 가지입니다: 하나는 관객에게 캡처할 수 있는 것을 알리고 이 방법을 사용하여 얻은 이미지 품질을 제시하는 것입니다. 다른 하나는 Drosophila에 관심이있는 새로운 학생들을 허용하지만, 지금까지 실제로 파리의 행동을 관찰 할 수있는 기회를 갖지 못했습니다 (예 : 구애, 싸움)이 명확한 비디오를 통해 그림이나 흐린 이미지보다.

추가 비디오 : 과일 비행 행동: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 관찰/문서화 시스템 구축

참고: 플라이 동작 관찰/문서화 시스템을 구성하는 데 필요한 재료는 그림 1에표시되며 완성된 시스템은 그림 2에표시됩니다. 시스템을 구성하는 프로토콜과 시스템을 사용하는 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

1. fly behavior observation c햄버 (FBOC)를 확인합니다.
   1. 작은 반투명(투명하지 않은) 용기를 얻어 FBOC 크기의 직경(Ø) 15mm x 20mm를 만듭니다. 크기 ~Ø17 mm x 22mm크기의 반투명 플라스틱 병 캡을 사용하여 FBOC를 만들거나 5mL 파이펫 팁의 두꺼운 끝에서 ~ 17mm의 단면을 잘라 FBOC를 만듭니다.
   2. 깊이를 조정하기 위해 FBOC에 1 % 한고를 붓습니다. 음식을 FBOC에 두어야 하는 경우(음식의 준비 방법 참조), 12mm깊이를 얻기 위해 한천을 붓습니다. 음식이 FBOC에 배치 할 필요가없는 경우, 과일 파리의 행방을 추적하기 위해 5mm의 깊이에 한천을 부어 더 쉽게 날아.
   3. 파이펫 팁을 사용하여 FBOC를 만드는 경우, 컷오프 파이펫 팁 섹션을 Ø35 mm 또는 Ø60 mm 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시에 1% 한고 젤을 넣고 ~ 5mm두께로 붓고, 한고가 고화될 때까지 기다린 후 FBOC의 바닥을 밀봉합니다. 그런 다음, 원하는 두께로 FBOC에 한천 젤을 붓습니다.
2. FBOC와 동일한 직경의 60mm x 60mm x 15mm 에틸라민 폼 시트의 중앙에 ~ 10mm 깊이의 구멍을 지루하게 하여 FBOC 베이스를 만드십시오. 구멍에 FBOC를 삽입합니다.
   참고: FBOC 베이스는 FBOC를 안정적으로 유지하고 이를 방지하고 FBOC의 이동을 용이하게 하여 관찰 및 비디오 그래피 중에 파리를 추적합니다.
3. 필요한 경우 효모 배지^2,인공 식단³또는 순수 자당/포도당(젤링 제로 1% 한고 사용)을 관찰 목적으로 하여 플라이 푸드를 만듭니다.
   1. 파리가 먹이를 주고 있는지 여부를 시각적으로 결정하고 파리와 그 환경 사이의 대비를 높이려면 식품 염료(재료 표참조)를 12.5 mg/100mL의 최종 농도로 추가합니다.
      참고 : 파리의 복부는 먹이 직후 색상이 바뀝니다.
   2. 준비된 음식을 페트리 접시에 8mm 높이로 붓습니다. 고형화 후 면도날을 사용하여 8mm x 4mm x 8mm 크기의 식품을 잘라내고 플라스틱 조각(예: 사탕 포장지)에 놓습니다.
   3. 그림 3에도시된 바와 같이 음식을 사각 피라미드 또는 사각 난관 피라미드로 잘라내어 파리가 무작위로 음식에 착륙할 때 다른 각도에서 비행 동작을 관찰하고 기록할 수 있도록 합니다. 음식 의 밑에 플라스틱을 사용하는 것은 FBOC에 있는 한마로 확산되는 음식에서 염료를 방지하는 것입니다. 핀셋을 사용하여 음식을 FBOC의 중앙에 놓습니다.
4. 일부 행동 관찰에서는 파리가 미리 굶어 지도록 하십시오. 1% 한천 젤(1g agar/100mL 물, 프로피온산 600 μL)을 깨끗한 빈 병에 넣고 1-2cm 두께로 붓고 실온에서 1-2h로 놓습니다. 전송은 병에 파리와 ≥36 h에 대한 25 ° C에서 배치합니다.
   참고 : 파리는 한천 젤에서 물을 흡수 할 수 있으므로 때때로 물을 추가 할 필요가 없습니다^4,5.
5. 하나 이상의 파리를 흡구대를 사용하여 FBOC로 이송합니다. 흡혈구를 사용하는 것이 어렵고, 으깬 얼음에서 파리를 차갑게 하고 비활성화하고, 얼음 팩에 분류하고,^이전에설명한 대로 FBOC로 옮춥니다.
   참고 : 동결의 사용은 크게 파리의 전송을 용이하게; 차가운 파리는 CO_2로마취된 파리보다 훨씬 빠른 1분 이내에 의식을 되찾을 수 있습니다. 냉각은 파리의 행동에 해로운 영향을 미칠 수 있지만, 예를 들어, 5 분^7에서 40 분^8로파리의 증가 교화 지연 시간, 그것은 비행 행동을 변경하지 않습니다 (예 : 구애 행동). 따라서, 냉각 방법은 일반적인 관찰 (예 : 교육 실험) 및 비디오 그래피에 대한 파리를 전송하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 관측은 과학적인 보고에서 이용될 경우에, 어떤 마취에 파리를 드러내지 않는 것이 좋습니다.
6. 파리를 FBOC로 옮김한 후, 카메라가 FBOC 복합체(도4)를형성할 수 있도록 30-40mm UV/클리어 필터로 커버한다. 관찰을 위해 고정 문자 스코프 아래에 FBOC 복합체를 배치합니다.
   참고: 선명하고 선명한 이미지를 얻으려면 높은 광 투과율(>98%)과 플레어 감소가 있는 고품질 UV/클리어 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 이전에 설명된 몇 가지 제안을 참조^9,10; 비싼 필터를 구입할 필요는 없지만 페트리 접시 뚜껑과 같은 유리로 FBOC를 덮지 마십시오.
7. FBOC를 조명합니다. 마운트 미니 LED 비디오 조명은 핫슈 마운트 스탠드를 플래시하고 FBOC(그림 2)의왼쪽과 오른쪽에 배치합니다. LED 조명을 켜고 밝기를 100%로 설정하고 색상 온도를 5000-5600 K로 설정합니다.
   참고: 조광이 켜진 미니 LED 비디오 조명, 5600 K 색상 온도는 균일하고 밝으며 거의 그림자가 없는 조명을 제공할 수 있습니다. 스테레오 현미경과 함께 제공되는 상단 광원을 사용하여 LED 링 라이트 조명기 또는 광섬유 조명기는 만족스러운 결과를 얻지 못했습니다. LED 비디오 조명에 연속 전원 공급 장치(변압기)를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
8. 비행 행동의 관찰 및 비디오 그래피
   1. LED 비디오 라이트를 켜고 FBOC의 가장자리가 육안으로 명확하게 볼 수 있을 때까지 스테레오 줌 현미경을 조정합니다. FBOC를 시야의 중심으로 이동합니다.
   2. 범용 망원경 디지털 카메라 어댑터의 클램프를 스테레오 현미경의 접면에 부착한 다음 카메라 장착 나사 및 카메라 고정 나사(그림2)를번갈아 돌리면 컴팩트한 디지털 카메라를 어댑터에 단단히 부착합니다.
   3. 디지털 카메라를 켜고 FBOC 가장자리가 카메라의 LCD 화면에서 밝은 원형 시야의 중앙에 명확하게 나타날 때까지 수평/수직 미세 조정 노브를 켭니다. 모드 다이얼을 조리개 우선 자동 모드로회전시키고, 멀티 셀렉터에 초점을 누르고, 매크로 클로즈업을선택한 다음 OK 버튼을 누릅니다. 확대각 끝에서 망원 끝으로 줌 스위치를 이동하고 중앙 부분이 전체 LCD 화면을 채울 때까지 원형 이미지를 확대합니다.  녹화를 시작하려면 동영상 녹화 버튼을 누릅니다(버튼을 다시 눌러 녹음을 종료합니다).
      참고: 이미지가 너무 어둡거나 너무 밝은 경우, 제어 다이얼의 측면을 노출 보정아이콘(그림 1)에가깝게 누르고 다이얼을 회전시켜 카메라에서 제안한 노출 값(EV)을 변경하여 원하는 효과를 달성합니다. 포지티브 EV는 이미지를 더 밝게 만들고 음수 EV는 이미지를 어둡게 만듭니다. 이미지는 비네팅없이 균일하고 밝아야합니다.
   4. FBOC의 파리가 명확하게 볼 때까지 현미경의 초점 노브를 돌립니다. 관찰 또는 비디오 녹화에 관심 있는 비행 동작을 선택합니다. 확대/축소 노브를 돌려 확대/축소하여 관찰 또는 비디오 녹화에 원하는 배율을 달성합니다.
      참고: 이 방법은 안구를 통해 현미경으로 이미지를 촬영하는 것이 안구가 있는 모든 현미경에 적용됩니다. 실험 결과 사진을 찍려면 RAW 이미지 파일이 JPEG에 바람직하기 때문에 RAW 형식으로 촬영할 수 있는 카메라를 사용합니다. 카메라의 LCD 화면을 디스플레이로 사용하여 과일 파리의 동작을 관찰하고 스테레오 줌 현미경이 최소 5-50배 줌을 가지고 있는지 확인합니다.

2. 비행 행동의 관찰 및 비디오 그래피에 대한 프로토콜

1. 파리 준비
   1. 60%의 습도와 12h 의 빛/어두운 주기로 25°C의 옥수수밀 배지에서 날아갑니다. 관측을 위해 부화 후 6 일 이내에 파리를 수집합니다 (구애 및 전투 행동 제외).
      참고: 여기서, 매체는 물 1000mL, 옥수수가루 105g, 자당 15g, 한천 15g, 효모 분말 40g, 10% 메틸 파라벤 28mL(95% 에탄올에서 1/v), 6.25mL의 프로피온산으로 구성되었다.
2. 차가운 것으로 마취에서 의식을 되찾는다
   1. 이전에 설명한 대로 파리를 식히세요. ⁶ 핀셋을 사용하여 드로소필라를 얼음 상자에서 FBOC로 옮는다. 비활동에서 정상적인 자세로 비디오의 비행 과정을 기록합니다.
3. 수면, 수유, 배설 및 사회적 행동
   1. 굶주림은 36 시간 동안 날아갑니다. 4-6 과일 은 스테인드 식품으로 FBOC에 날아갑니다. 비디오에서 플라이 동작을 관찰하고 기록합니다.
      참고: 5분 이상 움직이지 않는 파리디스플레이 수면^행동(11). Drosophila는 음식 또는 수직 FBOC 벽에 잠을 잘 수 있습니다 (몸은 관찰 실 벽에 수직입니다). 잠에서 바디는 움직이지 않더라도, 복부는 기복이 있는 것을 볼 수 있습니다. 먹이 행동은 비행이 proboscis 뻗어 지속적으로 빠는 동안 음식에 이동, 그리고 복부가 파란색으로 변할 때 나타납니다. 그룹 먹이 또는 기타 활동 하는 동안, 과일 파리 친절 한 방식으로 다른 과일 파리의 시체를 만지 기 위해 그들의 발을 스트레칭. 이것은 사회적 행동입니다.
4. 플라이 그루밍 동작
   1. 설명 된 대로 파리를^식히6. 냉동 파리를 한천 가루에 넣고 롤을 굴려 한천 가루로 덮습니다. 파리를 FBOC로 전송합니다. 그루밍 동작을 관찰하고 기록합니다.
      참고 : 과일 비행이 동결에서 의식을 회복하면, 그것은 신속하게 몸에서 한천 분말을 흔들고 다리^12,13몸의모든 부분을 청소합니다. 그루밍 행동은 먹이주기, 구애 및 기타 행동 중에도 볼 수 있습니다.
5. 구애와 싸우는 행동을 비행
   1. 이전에 설명 한 바와 같이 여성과 남성 파리를 수집⁷. 파리의 구애 행동을 관찰하려면 여성 비행과 남성이 FBOC로 날아가 6 개의 구애 (성공 및 실패) 행동을 관찰하고 기록하십시오.
   2. 파리의 전투 행동을 관찰하려면 FBOC에 두 명의 남성을 배치하십시오. 서로를 밀고 밀어내는 그들의 행동을 관찰하고 기록한다.
6. 계란 누워 행동을 비행
   1. 이전에 설명 한 바와 같이 여성 파리를 준비⁵. 4 명의 암컷 파리를 음식과 함께 FBOC로 옮기.

결과

UV 필터를 통해 선명하고 선명한 이미지를 촬영
실험실에서 UV 필터와 일반 유리의 차이를 관찰하기 위해 간단한 실험을 수행합니다. 플라이 배양 유리병을 가지고 스토퍼를 제거하고 스테레오 해부 현미경 아래에 놓고 UV 필터와 페트리 접시 뚜껑으로 (교대로) 덮습니다. 이 두 경우에서 찍은 사진은 그림 5에표시됩니다. UV 필터를 통해 찍은 사진은 문화 유리?...

토론

빛은 사진과 비디오 그래피의 중심에 있으며 고품질 이미지^16을획득하는 데 결정적인 요소입니다. 여기서, 조절 가능한 밝기와 색 온도를 가진 두 개의 LED 비디오 조명이 조명기로 사용되었고, 반투명 소재가 선택되어 FBOC를 만들었다. 양쪽의 LED 라이트 패널은 충분한 밝기를 제공했고, 반투명 재료는 부드러워지고 흩어져 있었고, 결국 불쾌한 과노출 또는 노출부족 영역을 생성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom