التجارب المختبرية للأقفاص الصغيرة للبعوض أنوفيلين المهندسة وراثيا

Summary

توضح البروتوكولات المبلغ عنها هنا ثلاث طرق بديلة لتقييم أداء البعوض المعدل وراثيا والموجه لمكافحة ناقلات الأمراض في تجارب الأقفاص الصغيرة الموجودة في المختبر. تم تصميم كل بروتوكول للتعديل المحدد لدببة سلالة البعوض (محرك الجينات أو محرك الأقراص غير الجيني) وأنواع المعلمات التي تم قياسها.

Abstract

واقترحت مكافحة مسببات الأمراض المنقولة بالبعوض باستخدام ناقلات معدلة وراثيا كأداة واعدة لاستكمال استراتيجيات المكافحة التقليدية. وقد جعلت نظم محركات الأقراص الجينية القائمة على كريسبر التكنولوجيات المعدلة وراثيا أكثر سهولة داخل المجتمع العلمي. ويوفر تقييم أداء البعوض المعدل وراثيا والمقارنات مع نظرائه من النوع البري في تجارب الأقفاص المختبرية الصغيرة بيانات قيمة لتصميم تجارب الأقفاص الميدانية اللاحقة والتقييمات التجريبية لتحسين استراتيجيات الوقاية من الأمراض. هنا، نقدم ثلاثة بروتوكولات مختلفة تستخدم في البيئات المختبرية لتقييم انتشار المتحولين جنسيا في ناقلات البعوض الأنوفيلينية للملاريا. وتشمل هذه الإصدارات الغمرية (لا يوجد نظام محرك الجينات)، والتجارب الجيلية المتداخلة وغير المتداخلة في محركات الجينات. تختلف التجارب الثلاث في عدد من المعلمات ويمكن تكييفها مع الإعدادات التجريبية المرغوبة. وعلاوة على ذلك ، فإن الدراسات الحشرية في الأقفاص الصغيرة هي جزء من الانتقال التدريجي للحشرات المهندسة من المختبر إلى إطلاقات ميدانية مفتوحة. ولذلك، تمثل البروتوكولات الموصوفة هنا أدوات قيمة لتوفير قيم تجريبية من شأنها أن تساعد في نهاية المطاف على التنفيذ الميداني للتكنولوجيات الجديدة للقضاء على الملاريا.

Introduction

ويجري اتباع استراتيجيات قائمة على البعوض المعدل وراثيا لمكافحة انتقال مسببات الأمراض المنقولة بالنواقل مثل تلك التي تسبب الملاريا^(1). وتشمل هذه التكنولوجيات 1) التي تهدف إلى خفض أعداد وكثافات البعوض الأنوفيليس (قمع السكان)، أو 2) التي تهدف إلى إضعاف قدرة ناقلات لنقل الطفيليات المسؤولة عن الأمراض البشرية (تعديل السكان، واستبدال، أو تغيير) حيث يتم تصميم سلالات من ناقلات للتعبير عن الجينات التأثير التي تمنع انتقال مسببات الأمراض. وقد تعززت هذه النهج الجينية بظهور محركات الجينات القائمة على CRISPR/Cas9، مع وجود براهين للمفهوم في البعوض الذي ينقل الطفيليات للانتشار الفعال لسمات الحمولة وكذلك جزيئات التأثير المضادة للطفيليات في مجموعات سكانية محبوسة.

وتمثل التجارب الصغيرة في الأقفاص المختبرية خطوة أولى لتقييم خصائص السلالات المعدلة وراثيا كجزء من نهج مرحلي لمواصلة تطويرها نحو التطبيقات ^{الميدانية2}. وتشمل اعتبارات النتائج المحددة اتسام الحمض النووي المقدم بالتربيت في بيئة تنافسية، والتكفير عن النمط الظاهري والتعبير عنه، والاستقرار. وتشمل ميزات التصميم التجريبي ذات الصلة حجم الأقفاص، وكثافات البعوض، وعدد التكاثرات، والأجيال المتداخلة أو غير المتداخلة، والسكان المستهدفين ذوي الهيكل العمري، وإطلاقات فردية أو متعددة من السلالات المهندسة، وإطلاقات الذكور فقط، والإناث فقط أو المختلط الجنس، ونسب الإطلاق، ومصادر وجبات الدم (الحيوانات الاصطناعية أو الحية)، وإجراءات الفحص.

نحن نصف هنا البروتوكولات المستخدمة لتقييم سلالات البعوض الأنوفيلين للإطلاقات الغمرية (لا يوجد نظام محرك الجينات) وتلك التي تحمل أنظمة القيادة الجينية المستقلة بوساطة Cas9 endonucleases وتوجيه الحمض النووي الريبي (gRNA). تظهر تطبيقات هذه البروتوكولات في فام وآخرون. (2019) ²، كاربالار - ليخارازو وآخرون. (2020) ³، وأدولفي وآخرون. (2020) ^{4- الأرباح التي يمكن أن تتراوح بين}

تقيم تجارب الإطلاق الغمري معدل انتشار متحول مصمم تحت ميراث مندليان بعد إطلاقات متعددة لعدد كبير من البعوض المعدل وراثيا في مجموعة برية. بدون ربط المتحول بنظام محرك أقراص ، توفر البيانات من تجارب الإطلاق الغمرية معلومات حول لياقة وديناميكية التحول في الاهتمام بمجموعة سكانية مستقرة.

عندما تحتوي مجموعات البعوض على نظام مستقل لدفع الجينات ، يتم تصميم تجارب الأقفاص الصغيرة لتقييم ديناميكيات انتشار المتحولين جنسيا المطلوبين من خلال تحديد معدل زيادة العلامة المهيمنة بعد إدخال واحد للذكور المعدلة وراثيا. تحمل عناصر القيادة الجينية المستقلة الجينات التي تترميز نواة Cas9 وgRNA والعلامة المهيمنة المرتبطة بطريقة تكون نشطة في الأجيال اللاحقة.

تشير الأجيال "المتداخلة" إلى الوجود المتزامن لأجيال متعددة في نفس القفص لخلق مجموعة سكانية مستمرة منظمة حسب العمر ، في حين تشير "غير المتداخلة" إلى أجيال منفصلة واحدة في كل سكان محبوسين ^{متتاليين2}. يمكن إنهاء تجارب قفص محرك الجينات بمجرد تحديد الديناميكيات الأولية لمعدل الدفع (التحويل) (8-10 أجيال اعتمادا على البناء) ، وبينما توفر معلومات عن الاستقرار قصير الأجل للمتحول داخل مجموعة البعوض ، فإنها قد لا تكشف عما يحدث عندما وإذا وصلت ترددات العلامة المهيمنة أو كانت قريبة من التقديم الكامل (كل بعوضة تحمل نسخة واحدة على الأقل من نظام محرك الجينات).

Protocol

بيان أخلاقيات الحيوان
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا (أرقام ضمان رعاية الحيوان A3416.01).

1. تجارب إطلاق الغمر على البعوض غير الجيني (الشكل 1)

1. إعداد القفص وصيانته
   1. إعداد ثلاث مجموعات من ثلاثة أقفاص ثلاثية 0.216 ^M3 عن طريق إضافة 60 يرقات من النوع البري الثاني (WT) في كل قفص على مدى ثلاثة أسابيع متتالية.
      ملاحظة: لا يمكن تحديد جنس يرقات النجم الثاني عن طريق المجهر الخفيف ، لذلك ستتألف العينات المضافة إلى كل قفص من الذكور والإناث على حد سواء.
   2. في كل أسبوع، قم بتزويد الإناث البالغات في كل قفص بالفئران المخدرة كمصدر دقيق الدم (الشكل 2A) وحاوية oviposition بعد 3 أيام من دقيق الدم.
      ملاحظة: في حين يمكن استخدام جهاز تغذية اصطناعي بديل، فإن توفير فئران مخدرة حية لدقيق الدم يؤدي إلى أداء أفضل لتغذية البعوض في هذه الأشكال الكبيرة (0.216 ^m3) للأقفاص. وهذا يتطلب بروتوكول استخدام الحيوانات المعتمدة ذات الصلة (على سبيل المثال، اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه، IACUC) الموافقة على استخدام الفئران.
      ملاحظة: يتم تخدير الفئران الفردية مع خليط من 4 ملغ / الماوس الكيتامين HCl و 0.4 ملغ / الماوس xylazine. يتم حقن الحيوانات مع ما بين 0.1 - 0.5 مل من هذا الخليط.
   3. يفقس البيض من كل قفص أسبوعيا ويختار 60 يرقة ثانية (L2) عشوائيا ليتم إعادتها إلى أقفاصكل منها لتعويض الوفيات (الأسابيع 4-8).
      ملاحظة: الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3 ضرورية لإنشاء مجموعة سكانية مستقرة وموزعة من حيث العمر في الأقفاص - يشار إليها باسم "المرحلة الأولية".
   4. في الأسبوع 9، تعيين أقفاص تجميعها في الخطوة 1.1.1 عشوائيا في ثلاث نسخ لإطلاق سراح نسبة الإفراج عن الذكور المطلوب.
      1. تعيين مجموعة واحدة من الأقفاص ثلاثية الليكات كضوابط لتقييم الاتساق طوال التجربة.
      2. تعيين مجموعة واحدة من ثلاثية لكل نسبة إطلاق مرغوبة (على سبيل المثال، 1:1 أو 1:0.1 من الذكور المعدلة وراثيا:WT).
         ملاحظة: يشار إلى هذه النقطة على "المرحلة التجريبية".
2. نسخ متماثلة ونسب الإصدار
   1. إضافة 60 WT pupae (30 الذكور و 30 الإناث) إلى أقفاص التحكم أسبوعيا.
   2. للحفاظ على نسبة 1:1، إضافة الأسبوعية 30 الخوادر الذكور المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع 60 (30 ذكرا و 30 أنثى) جروة WT في كل قفص كل منهما.
   3. للحفاظ على نسبة 1:0.1، إضافة أسبوعية 300 الخوخ الذكور المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع 60 (30 من الذكور و 30 أنثى) WT الخوخ في كل قفص كل منهما.
      ملاحظة: إن استمرار إضافة البعوض البري إلى الأقفاص يحافظ على كثافة الأقفاص، والتي من المتوقع أن تقل أسبوعيا بسبب وفيات البالغين المرتبطة بالعمر.
3. فحص الأنماط الظاهرية
   1. اختر ما مجموعه 300 يرقة من كل قفص عشوائيا. مع استخدام مجهر ستيريو مجهزة مرشحات مضان، شاشة للتعبير عن علامة الفلورسنت المهيمنة في مراحل اليرقات والجراء ويسجل جنس البالغين الناتجة (الشكل 3).
      ملاحظة: سيعتمد الفحص الظاهري على العلامة المهيمنة المضمنة في بناء المتحولين جنسيا المدمجين في البعوض (على سبيل المثال ، Discosoma sp. بروتين الفلورسنت الأحمر [DsRed] ، بروتين الفلورسنت السماوي [CFP] ، البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) ، وعلى المروج الذي يقود تعبيره (الأكثر استخداما في تكوين البعوض هو تعبير قيادة المروج 3xP3 في العينين والحبل العصبي).
   2. اتبع هذا البروتوكول لأجيال عديدة كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.
      ملاحظة: عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما يكون لدى جميع البعوض نسخة واحدة على الأقل من المتحول (التي يحددها وجود علامة الفلورسنت المهيمنة) أو تستقر نسبة البعوض المعدل وراثيا إلى WT في القفص ولا تتقلب بشكل كبير بعد بضعة أجيال (3-5).

2. تداخل تجارب توليد البعوض الدافع للجينات (الشكل 4)

ملاحظة: يتطلب البعوض الذي يحمل أنظمة محركات الجينات بروتوكولات مكتوبة ومراجعتها وينبغي أن توافق عليه لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) أو ما يعادلها، وغيرها عند الحاجة. يجب أن يتبع احتواء البعوض (مستوى ACL 2⁺ ) الإجراءات الموصى ^بها5,6,7. وعلى وجه التحديد، ينبغي أن تستخدم تجارب محركات الجينات استراتيجيتين صارمتين للحبس. الأول هو عادة الحواجز المادية (استراتيجية الحاجز) بين الكائنات الحية والبيئة. وهذا يتطلب وجود إجراءات تشغيلية حشرية ومعيارية آمنة (بما في ذلك الرصد) لضمان عدم هروب البعوض. ويمكن أن تكون استراتيجية الحبس الثانية جزيئية أو إيكولوجية أو ^{إنجابية5}.

1. إعداد القفص
   1. إعداد مجموعتين من ثلاثة أقفاص 0.216 ^M3 ثلاثية لكل المعدلة وراثيا المطلوبة: WT نسبة إطلاق سراح الذكور.
      1. لتحقيق نسبة إطلاق الذكور من 1:1، إضافة 120 الذكور المعدلة وراثيا، 120 WT الذكور و 120 WT الإناث في مرحلة الخوادر إلى كل قفص تكرار.
      2. لتحقيق نسبة إطلاق 1:10 ، أضف 12 ذكرا معدلا وراثيا و120 ذكرا من WT و120 أنثى WT في مرحلة الخوادر إلى كل قفص متماثل.
         ملاحظة: يمكن اختبار نسب إطلاق مختلفة (1:1، 1:3، 1:10، إلخ) ويختلف عدد البعوض المستخدم لبدء التجارب وفقا لذلك. ومع ذلك، من المهم النظر في آثار انخفاض الأعداد على التقييم الإحصائي للبيانات.
2. صيانة السكان وفحصهم
   1. توفير 4-7 أيام الإناث القديمة في كل قفص مع وجبة الدم باستخدام الفئران تخدير (الشكل 2A).
   2. بعد ثلاثة أيام من وجبة الدم، أدخل حاوية oviposition في كل قفص.
   3. يفقس البيض في صينية يرقة ، حدد ~ 240 يرقات النجم الأول (L1) عشوائيا من كل قفص ، وربيها إلى مرحلة البلوغ ، وإعادتها إلى أقفاصها الخاصة.
   4. توفير وجبات دم إضافية (2-3) كل 3-4 أيام للبالغين الناشئين حديثا كما هو موضح في الخطوة 2.2.1.
      ملاحظة: لا تضاف أي ذكور معدلة وراثيا إضافية خلال أي من الأجيال اللاحقة.
   5. اختر ما مجموعه 300 يرقة من كل قفص عشوائيا وفحصها للكشف عن وجود النمط الظاهري المهيمن للعلامات في مراحل اليرقات والجراء باستخدام مجهر ستيريو مضان وسجل البالغين الناشئين لممارسة الجنس (الشكل 3).
      ملاحظة: كما كان الحال من قبل، سيعتمد الفحص الظاهري على العلامة المهيمنة والمروج المدرجة في نظام محرك الجينات ودمجها في البعوض المعدل وراثيا (على سبيل المثال، DsRed أو CFP أو GFP). إذا أدت الاضطرابات المثلية أو الاضطرابات غير العضوية للجينات المستهدفة إلى نمط الظاهري المرئي (على سبيل المثال ، الجينات المتعلقة تصبغ العين) ، فإن فحص هذه السمة يعتمد على المرحلة التي يكون من الأسهل تصور النمط الظاهري المتغير.
   6. اتبع هذا البروتوكول لأجيال عديدة كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.
      ملاحظة: كل جيل (محدد بوجبة الدم) يستغرق ~ ثلاثة أسابيع. عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما تعتبر جميع البعوض متجانسة لبناء محرك الجينات أو تستقر المجموعات عند نسبة مئوية قصوى من البعوض الذي يحمل نسخة واحدة على الأقل من بناء محرك الجينات.

3- تجارب الجيل غير المتداخلة للبعوض الذي يدفع الجينات (الشكل 5).

1. إعداد القفص
   1. إعداد مجموعات قفص ثلاثية 0.005 ^م3 لكل نسبة إطلاق محددة من المعدلات وراثيا إلى الذكور WT للتحقيق فيها (على سبيل المثال، ثلاث مجموعات من أقفاص ثلاثية الليكات كل إعداد مع 1:1، 1:3، 1:10 نسب الإصدار). إعداد جميع الأقفاص مع العدد الإجمالي المتساوي للذكور والإناث.
      ملاحظة: الملف التكميلي هو شريط فيديو يوضح بناء قفص مستعمرة 0.005 ^M3 .
      1. إضافة 50 من الذكور المعدلة وراثيا، 50 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة 1:1 إطلاق الذكور.
      2. إضافة 25 الذكور المعدلة وراثيا، 75 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة الإفراج 1:3 الذكور.
      3. إضافة 9 ذكور المعدلة وراثيا، 90 WT الذكور، و 100 WT الإناث إلى كل من ثلاثة أقفاص تكرار لتحقيق نسبة 1:10 إطلاق الذكور.
         ملاحظة: يمكن اختبار نسب إطلاق مختلفة ويمكن أن يختلف عدد البعوض المستخدم لبدء التجارب وفقا لذلك. ومع ذلك، من المهم النظر في تأثير انخفاض أعداد البعوض على التحليلات الإحصائية. هذه هي الإصدارات المفردة; لا تضاف أي ذكور معدلة وراثيا إضافية في أي جيل لاحق.
2. صيانة السكان وفحصهم
   1. تزويد الإناث بعمر 4-7 أيام في كل قفص بوجبات الدم باستخدام جهاز تغذية اصطناعي (الشكل 2B) في يومين متتاليين.
      ملاحظة: تتكون وجبات الدم الروتينية للإناث من مصدر للدم متاح تجاريا (مثل دم العجل) مقدم من جهاز التغذية. تستخدم الفئران المخدرة الحية فقط لتوفير دقيق الدم في أشكال قفص أكبر (0.216 ^m3) لتحسين أداء التغذية.
   2. إضافة حاوية oviposition 3 أيام بعد دقيق الدم الثاني. بعد ثلاثة أيام، قم بإزالة حاويات oviposition.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن اختيار 5-10 إناث عشوائيا من كل قفص ووضعها بشكل فردي في قوارير لتقييم معلمات اللياقة البدنية الإضافية، مثل الخصوبة والبراز، إذا لزم الأمر.
   3. يسجل حسب الجنس جميع البالغين (حيا ونافقا) المتبقية في القفص وتخزينها في -80 درجة مئوية للتحليل الجزيئي.
   4. يفقس البيض واختيار عشوائيا 200 L1 اليرقات من 1:1 و 1:3 نسبة أقفاص لملء أقفاص جديدة للجيل القادم.
      ملاحظة: نظرا لانخفاض وتيرة بدء الفرد المعدلة وراثيا في أقفاص نسبة 1:10، قد يؤدي أخذ العينات العشوائية إلى فقدان المفرط للذرية المعدلة وراثيا في الجيل القادم على الاستمرار في السكان.
   5. لضمان أخذ عينات دقيقة لأقفاص 1:10 وأعداد كافية من البعوض المعدل وراثيا ، قم بفحص جميع اليرقات للكشف عن العلامة المهيمنة واختر 200 يرقة تعكس تردد المتحولين الملحوظين لملء الأقفاص الجديدة.
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على أقفاص 1:10 بشكل مطابق لأقفاص 1:1 و 1:3 عندما تصل إلى تردد متحول بنسبة ≥80٪.
   6. اختر 500 يرقة من كل قفص عشوائيا لإجراء تحليل متعمق. شاشة تحت مجهر ستيريو مضان للأنماط الظاهرية علامة المتوقع في مراحل اليرقات والجراء ويسجل الجنس من البالغين (الشكل 3).
      ملاحظة: يمكن اختيار الأنماط الظاهرية "الاستثنائية" ليتم عبورها وتحليلها بشكل جزيئي لرصد تكوين الأليل المقاوم.
   7. ويمكن اتباع هذا البروتوكول لعدة أجيال كما هو مطلوب من قبل المعلمات الناتجة المحددة في التصميم التجريبي.
      ملاحظة: يتم تعيين كل جيل بواسطة دقيق الدم ويستغرق ~ ثلاثة أسابيع. عادة ما يتم إنهاء التجربة عندما تعتبر جميع البعوض متجانسة لبناء محرك الجينات أو يستقر السكان عند أقصى انتشار للبعوض المعدل وراثيا. وكما كان الحال من قبل ، فإن فحص الأنماط الظاهرية يعتمد على العلامات المهيمنة والمروج المتكامل في البعوض المعدل وراثيا (على سبيل المثال ، DsRed ، CFP ، GFP) أو في الجينات المستهدفة إذا كانت تقدم نمطا ظاهرا مرئيا (على سبيل المثال ، الجينات المتعلقة بتصبغ العين).

النتائج

يتم إعداد البعوض الأنوفليني المعدل وراثيا المتولد لتحمل محرك غير جيني أو تعديلات مستقلة في محرك الجينات للتجارب القفصية كما هو موضح في قسم البروتوكولات. تصور النتائج التمثيلية المعروضة هنا الديناميكيات الظاهرية لأفضل النسخ المتماثلة أداء لكل تجربة من تجارب القفص التي أجراها فام وآخرون. (2019) ² للبعوض أنوفيليس ستيفنزي . وتباينت التجارب الثلاث (1-3، على التوالي: محرك الأقراص غير الجينية المغمور، وتداخل محرك الجينات، وعدم تداخل محرك الجينات) في معايير مختلفة، مثل حجم القفص (0.216 ^م3 مقابل 0.005 ^م3)، وما إذا كان السكان المستهدفون منظمة حسب العمر، ومصدر وجبة الدم (الفئران أو التغذية الاصطناعية) ونسب الإطلاق. 11- وكوسيلة للتمثيل، يعرض الشكل 6 البيانات الملاحظة المختارة من نفس نسبة الإصدار (1:1) لجميع البروتوكولات الثلاثة المستخدمة، على مدى سبعة أجيال.

الإصدار 1:1 غير محرك تصل إلى >80٪ مقدمة transgene في غضون 6-7 أجيال. بالنسبة لتجارب الأقفاص المعدلة وراثيا ذات محرك الجينات، تصل الإطلاقات 1:1 في كل من البروتوكولات غير المتداخلة والمتداخلة إلى هذا المستوى في غضون 3-4 أجيال، وبالتالي، التحقق من صحة توقع أن إطلاق واحد لنظام محرك الجينات يمكن أن يكون أكثر كفاءة من الإطلاقات الغمرية غير الدافعة لإدخال المتحولين جنسيا. ويمكن أيضا تأكيد المسار الأسرع من خلال منحدر خطوط الاتجاه. كلا بروتوكولات محرك الجينات، على الرغم من الهجمات المختلفة، تقدم زوايا متشابهة واتجاهات المنحدر. في نهاية الملاحظة ، تحقق الأقفاص غير الدافعة ~ 80٪ من الأفراد الذين يحملون المتحولين جنسيا ، في حين تصل الأقفاص التي تضم أفرادا محرك الجينات إلى مقدمة كاملة (أو شبه كاملة). يمكن العثور على البيانات الكاملة وتفاصيل المعالجة عن نتائج التجارب الفردية باستخدام البروتوكولات الموضحة هنا في الشكلين 1-3 من فام وآخرون. (2019) ²، الأرقام 2-3 من كاربالار - ليخارازو وآخرون. (2020) ⁽³) والشكل 3 لأدولفي وآخرون. (2020) ^{4- الأرباح التي يمكن أن تتراوح بين}

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 غير محرك الأقراص الإفراج عن الغمر التجريبي التخطيطي.  تم إعداد تسعة أقفاص 0.216 ^M3 مع إضافة 60 يرقة من النوع البري الثاني (مختلط الجنسين) إلى كل منها. ابتداء من الأسبوع الثالث، يتم توفير دقيق الدم أسبوعيا للإناث ويتم جمع البيض وتفريخه. حتى الأسبوع الثامن ، يتم اختيار 60 يرقة بشكل عشوائي وإعادتها إلى أقفاصها أسبوعيا لخلق مجموعة عمرية في الأقفاص (المرحلة الأولية). ابتداء من الأسبوع 9، يتم تعيين الأقفاص التسعة عشوائيا في ثلاثة حطاب وفقا لنسبة إطلاق الذكور المعدلة وراثيا: البرية من نوع (المرحلة التجريبية). أقفاص A (التحكم) ليس لديها الخوادر المعدلة وراثيا المضافة. يتم توفير الإناث دقيق الدم أسبوعيا ويتم جمع البيض، فقس، وتربيتها إلى الخوادر. يتم إضافة 30 من الذكور و 30 أنثى من نوع الخوخ البري إلى أقفاصهم. أقفاص 1:1 لديها إضافية 30 الجراء الذكور المعدلة وراثيا وأضاف. أقفاص 1:0.1 لديها إضافية 300 أضافت الخوادر الذكور المعدلة وراثيا. يتم اختيار 300 يرقة من كل من الأقفاص ال 9 بشكل عشوائي وفحصها لعلامة الفلورسنت. تكرر هذا الإجراء أسبوعيا حتى تثبيت الأنواع المتحولة وراثيا (استقرت نسبة البعوض المعدل وراثيا إلى البرية بعد بضعة أجيال). مقتبس من فام وآخرون. (2019) ². الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تغذية الدم من مجموعات القفص.  (أ) يتم تقديم الفئران المخدرة أو (ب) مغذيات الدم Hemotek لتغذية الدم البعوض الإناث على أقفاص 0.216 ^M3 أو أقفاص صغيرة 0.005 ^M3 ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن فحص الأنماط الظاهرية للتجارب غير الدافعة والمتداخلة لمحرك الجينات وغير المتداخلة في قفص محرك الجينات.  صور فلورية لليرقة والجرو والبالغ من الأنماط الظاهرية المعدلة وراثيا أو البرية. في هذا المثال، تم فحص الأفراد ستيفنسي An. لعلامة DsRed مدفوعة من قبل المروج 3xP3 في العينين (DsRed + أو DsRed-)، مرئية في جميع المراحل الثلاث، وكان يتم فحص البالغين لممارسة الجنس ( ♀ أو ♂ ). لاحظ الفلورسينس الخلفية في اليرقات البرية المرتبطة بولوس الغذاء في midgut. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تداخل الجينات محرك قفص المحاكمة التخطيطية.  يتم إعداد ستة أقفاص 0.216 ^M3 في ثلاثة أقفاص وفقا لمحرك الجينات: نسب إطلاق الذكور البرية من نوع. وأضيف إلى كل قفص 120 من الذكور من النوع البري و 120 أنثى من النوع البري. وأضاف أقفاص مع 1:1 نسبة الافراج عن الذكور محرك الجينات إضافية 120 الذكور المعدلة وراثيا. وأضاف أقفاص مع نسبة الإفراج 1:10 الذكور إضافية 12 الذكور المعدلة وراثيا. حتى إدخال كامل للمتحول، كل 3 أسابيع، يتم توفير الإناث البالغات مع bloodmeals ويتم جمع البيض وتفقيسها. تم اختيار ما مجموعه 240 يرقة بشكل عشوائي وإعادتها إلى أقفاصها. يتم اختيار ثلاثمائة (300) يرقة عشوائيا وفحصها للكشف عن العلامة المهيمنة. يتم فحصها في وقت لاحق كما الخوخ والبالغين للون العين والجنس. لا يتم إضافة ذكور معدلة وراثيا إضافية إلى الأقفاص الأصلية. مقتبس من فام وآخرون. (2019) ². الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم غير متداخلة الجينات محرك قفص المحاكمة التخطيطية.  يتم إعداد تسعة أقفاص صغيرة 0.005 ^M3 في ثلاثة أقفاص وفقا لمحرك الجينات: نسب إطلاق الذكور البرية من نوع. وأضاف أقفاص مع نسبة 1:1 إطلاق الذكور 100 من الإناث البرية من النوع، 50 من الذكور من النوع البري، و 50 الذكور محرك الجينات المضافة. واضاف ان الاقفاص ذات نسبة اطلاق سراح الذكور 1:3 بها 100 من الاناث البرية و 75 ذكرا من النوع البرى و 25 ذكرا دافعا للجينات . الأقفاص 1:10 نسبة الافراج عن الذكور لديها 100 من نوع الإناث البرية، 90 من الذكور من النوع البري، و 9 الذكور محرك الجينات المضافة. وتقدم الإناث وجبة دم والبيض التي تم جمعها وفقست. بالنسبة لأقفاص 1:1 و 1:3 ، يتم اختيار 200 يرقة عشوائيا واستخدامها لملء أقفاص جديدة ، منفصلة عن أقفاص والديهم ، للجيل القادم. يتم اختيار 500 يرقة إضافية بشكل عشوائي وتربيتها على الخوادر ، عندما يتم فحصها للكشف عن جين العلامة المهيمن. ثم يتم تربية 500 pupae للبالغين وسجل عن طريق الجنس. يتم فحص جميع اليرقات المتبقية للكشف عن العلامة. بالنسبة للأقفاص 1:10 ، يتم تسجيل جميع اليرقات في الأجيال 1-12 ويتم استخدام 200 يرقة تعكس تردد المتحولين الحاليين لملء أقفاص جديدة. ابتداء من الجيل 13، يتم إعداد هذه الأقفاص بشكل مماثل لأقفاص 1:1 و 1:3. مقتبس من فام وآخرون. (2019) ² وكاربالار - ليخارازو وآخرون. (2020) ³. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 ديناميات تثبيت المتحولين المتوقعة لتجارب قفص استبدال السكان المختلفة.  تمثيل الديناميكيات الظاهرية المتوقعة لأفضل النسخ المتماثلة أداء لكل تجربة من تجارب القفص التي أجراها فام وآخرون. (2019) ²، ورصدت أكثر من 7 أجيال. يتم وصف عمليات إعداد التجارب في البروتوكولات. وتستند التنبؤات إلى بيانات من جميع التجارب ال 9 على نماذج الإصدار 1:1 (تكرارات ثلاثية لكل بروتوكول من بروتوكولات المحاكمة القفصية الثلاثة المختلفة). المحور X هو رقم الجيل بعد المقدمة الأولية ومحور Y هو نسبة اليرقات التي تظهر النمط الظاهري لعلامة DsRed (DsRed+) بمرور الوقت. تمثل الخطوط المتقطعة خطوط الاتجاه الخطية للبيانات. ينتج النمط الظاهري DsRed+ من وجود نسخة واحدة على الأقل من أليل المعدلة. ومن هنا تعكس النتائج انتشار المتحول، المعجل في نظام محرك الجينات، ليصل إلى (قرب) التقديم الكامل في نهاية الملاحظة. للاطلاع على التباين بين التكرارات والبيانات التفصيلية الكاملة عن التجارب، يرجى الرجوع إلى فام وآخرون. (2019) ²، كاربالار - ليخارازو ر وآخرون (2020)³ وأدولفي أ وآخرون (2020)⁴. صور مقتبسة من فام TB وآخرون (2019) التعديل السكاني التجريبي لالبعوضة ناقلات الملاريا، أنوفيليس ستيفنسي. منظمة التحرير الفلسطينية جينيه 15 (12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A وآخرون (2020) نظام إنقاذ محرك الجينات الفعال لتعديل السكان في بعوضة الملاريا أنوفيليس ستيفنزي. نات كومون 11 (1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 وكاربالار-ليخارازو آر وآخرون (2020) الجيل التالي من الأقراص الجينية لتعديل السكان من البعوض ناقلات الملاريا، أنوفيليس غامبيا. بروك ناتل أكادي الخيال الولايات المتحدة الأمريكية 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: بناء قفص مستعمرة 0.005 ^M3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

ويشكل البعوض المعدل وراثيا الذي لديه قدرة على حجب مسببات الأمراض أو يحمل جينات عقم أدوات جديدة لمكافحة الأمراض المنقولة بالنواقل. ونظرا لتعدد البارامترات التي تشمل هذه النهج البديلة، فإن الخطوة الحاسمة في بحوثها تتمثل في التقييمات التجريبية المحصورة مختبريا التي تسمح بالتنبؤ السريع والآمن بالنتائج المحتملة لإطلاق متحول اصطناعي لأغراض المراقبة^(1).

ولأن رصد ديناميات المتحولين جنسيا في التجمعات السكانية المحبوسة يمكن أن يمتد لعدة أشهر، فإن أحد الجوانب المركزية للبروتوكولات هو الاتساق في التصميم التجريبي بين النماذج المتماثلة (بما في ذلك تربية البعوض، وحجم القفص، والسكان ذوي الهيكل العمري، ونسب الإطلاق الثابتة، ومصادر وجبات الدم المستقرة، وإجراءات الفحص طفيفة التوغل).

وتعتبر الإطلاقات التي تقتصر على الذكور مثالية لأن البعوض الذكر لا ينقل مسببات الأمراض ولا يتغذى على البشر، وبالتالي يمكنه إدخال الخصائص القابلة للتكريت بأمان في المجموعات البرية. في التجارب المختبرية القفص، فمن الممكن للكشف عن سلالات المعدلة وراثيا مع انخفاض القدرة التنافسية التزاوج الذكور وغيرها من الأحمال اللياقة البدنية المرتبطة التكامل المتحولين جنسيا. ومع ذلك، يمكن إجراء تجارب مباشرة ومحددة، مثل تلك التي أجريت في أقفاص ^كبيرة10، لتحليل القدرة التنافسية للذكور بشكل صحيح، فضلا عن براز الإناث في كثافات البعوض الأكثر ^{طبيعية2}. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البيانات التجريبية المستمدة من التجارب القفصية لتحديد نماذج الديناميات السكانية في الأقفاص، بما في ذلك تكوين الأليل المقاوم، وتوفير معلومات مفيدة عن الفعالية والتعديلات الممكنة في التكنولوجيا المقترحة.

يمكن تكييف البروتوكولات الموصوفة هنا بسهولة مع التصميمات التجريبية الأخرى حسب الحاجة ، مع الحد الأدنى من المتطلبات المتعلقة بالبنية التحتية والظروف الحشرية العادية. بالإضافة إلى ذلك ، باستثناء الأقفاص التجارية والمجاهر ، فإن معظم المواد غير مكلفة وتسمح بتكرار وتكرارات متعددة منخفضة التكلفة للتجارب. وتجدر الإشارة إلى أن هذا يسمح أيضا بفحص سلالات معدلة وراثيا متعددة مسبقا في تجارب الأقفاص الصغيرة من أجل إعطاء الأولوية للمرشحين الأفضل أداء للمضي قدما في مسار الاختبار المرحلي وتعليق الاختبار على أولئك الذين يظهرون أداء دون المستوى الأمثل.

وأخيرا، فإن القلق بشأن استخدام الكائنات المحورة وراثيا يحفز على وضع أطر لوضع وتقييم وتطبيق استراتيجيات جينية للوقاية من الأمراض المنقولة بالبعوض^(5)،8،9. وتتسق أهمية وتنفيذ البروتوكولات المحددة هنا مع هذه المبادئ التوجيهية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial feeders	Hemotek	SP6W1-3	Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs
Cage, commercial	BioQuip	1450D	Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" - 0.216 m3 (60 cm3)
Cage tub (popcorn)	Amazon.com	VP170-0006	0.005 m3 (170 fl oz)
Dissecting microscope with fluorescence light and filters	Leica	M165FC
Glue sticks	Michaels	88646598807	Gluesticks 40 pk,  0.4X4”
Hot glue gun	Woodwards Ace	2382513	Stanley, 40 watt, GR20
Nylon screen (netting)	Joann.com	1102912	Tulle 108" Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)
Oviposition cups	Fisher	259126	Beaker PP grad 50 mL
Razor cutting tool	Office Depot	487899	Box cutters
Scissors	Office Depot	978561	Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8"
Stapler	Office Depot	908194	Swingline Commercial Desk Stapler
Surgical sleeve (stockinette)	VWR	56612-664	~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y)
Zip ties	Home Depot	295715	Pk of 100, 14” cable ties - 35.6 cm (14 in)