نموذج شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة واستهداف سرطان الثدي نمو الورم النقيلي في الدماغ

Summary

نحن نقدم بروتوكولا لقياس الاستجابة الدوائية والإشعاعية في الوقت الحقيقي لخلايا الدماغ النقيلية لسرطان الثدي في نموذج شريحة الدماغ العضوية النمطية. توفر الطرق فحصا كميا للتحقيق في الآثار العلاجية للعلاجات المختلفة على نقائل الدماغ من سرطان الثدي بطريقة خارج الجسم الحي داخل واجهة البيئة الدقيقة للدماغ.

Abstract

ورم خبيث في الدماغ هو نتيجة خطيرة لسرطان الثدي للنساء حيث يصعب علاج هذه الأورام وترتبط بنتائج سريرية سيئة. نماذج الفئران قبل السريرية لسرطان الثدي نمو الدماغ النقيلي (BCBM) مفيدة ولكنها باهظة الثمن ، ومن الصعب تتبع الخلايا الحية وغزو الخلايا السرطانية داخل حمة الدماغ. يظهر هنا بروتوكول لمزارع شرائح الدماغ خارج الجسم الحي من الفئران المطعمة بالأجانب التي تحتوي على خطوط فرعية نسلية لسرطان الثدي عن طريق الحقن داخل الجمجمة. تم حقن الخلايا الموسومة ب MDA-MB-231BR luciferase داخل الجمجمة في أدمغة الفئران الإناث Nu / Nu ، وبعد تكوين الورم ، تم عزل الأدمغة وتقطيعها وزراعتها خارج الجسم الحي. تم تصوير شرائح الورم لتحديد الخلايا السرطانية التي تعبر عن luciferase ومراقبة انتشارها وغزوها في حمة الدماغ لمدة تصل إلى 10 أيام. علاوة على ذلك ، يصف البروتوكول استخدام المجهر بفاصل زمني لتصوير النمو والسلوك الغازي للخلايا السرطانية بعد العلاج بالإشعاع المؤين أو العلاج الكيميائي. يمكن تصور استجابة الخلايا السرطانية للعلاجات عن طريق التصوير المجهري الحي ، وقياس شدة التلألؤ الحيوي ، وإجراء علم الأنسجة على شريحة الدماغ التي تحتوي على خلايا BCBM. وبالتالي ، قد يكون نموذج شريحة خارج الجسم الحي هذا منصة مفيدة للاختبار السريع للعوامل العلاجية الجديدة بمفردها أو بالاشتراك مع الإشعاع لتحديد الأدوية المخصصة لاستهداف نمو الدماغ النقيلي لسرطان الثدي لدى المريض داخل البيئة الدقيقة للدماغ.

Introduction

تتطور نقائل الدماغ لسرطان الثدي (BCBM) عندما تنتشر الخلايا من ورم الثدي الأساسي إلى الدماغ. سرطان الثدي هو السبب الثاني الأكثر شيوعا لانبثاث الدماغ بعد سرطان الرئة ، مع حدوث النقائل في 10-16 ٪ من المرضى¹. لسوء الحظ ، تظل النقائل الدماغية غير قابلة للشفاء حيث يموت >80٪ من المرضى في غضون عام بعد تشخيص ورم خبيث في الدماغ ، وتضعف نوعية حياتهم بسبب الاختلالات العصبية². هناك حاجة ملحة لتحديد خيارات علاج أكثر فعالية. نماذج الثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد هي الطرق الأكثر استخداما في اختبار العوامل العلاجية في المختبر. ومع ذلك ، فإنها لا تحاكي البيئة الدقيقة BCBM المعقدة ، وهي محرك رئيسي للنمط الظاهري للورم ونموه. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة ، إلا أنها لا تلتقط التفاعلات المعقدة بين الورم واللحمية ، ومتطلبات التمثيل الغذائي الفريدة ، وعدم تجانس الأورام³. لتلخيص التفاعلات بين الورم واللحمية وعدم تجانس البيئة الدقيقة بشكل أكثر إخلاصا ، بدأت مجموعتنا وغيرها في توليد ثقافات "شرائح" خبيثة في الدماغ العضوي مع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض (الأولية أو النقيلية) أو خطوط الخلايا السرطانية⁴،^5،6. بالمقارنة مع الأنظمة المختبرية الكلاسيكية ، قد يوفر هذا النموذج خارج الجسم الحي قصير الأجل ظروفا أكثر ملاءمة لفحص العلاجات الجديدة قبل التقييم قبل السريري في مجموعات الحيوانات الكبيرة.

تم بناء نماذج خارج الجسم الحي واستخدامها بنجاح في المقام الأول لتحديد العلاجات الناجحة لمختلف أنواع السرطان. وهي تتطلب بضعة أيام من التقييم ويمكن بالإضافة إلى ذلك أن تكون مصممة خصيصا لفحص الأدوية الخاصة بالمريض. على سبيل المثال ، أظهرت أنسجة المثانة وسرطان البروستاتا البشري خارج الجسم الحي استجابة مضادة للورم تعتمد على الجرعة من دوسيتاكسيل وجيمسيتابين⁷. تم تطوير سرطان القولون والمستقيم المماثل خارج أنسجة الجسم الحي لفحص أدوية العلاج الكيميائي Oxaliplatin و Cetuximab و Pembrolizumab⁸. وقد استخدم هذا التطبيق على نطاق واسع في سرطان البنكرياس، مع الأخذ في الاعتبار التفاعل الأساسي بين البيئة اللحمية والخصائص الجينية والنمط الظاهري للسرطان الغدي الأقنوي البنكرياس ^9,10. علاوة على ذلك ، تم تطوير مثل هذه النماذج العضوية لإجراء فحوصات مماثلة في أورام الرأس والرقبة والمعدة والثدي^11,12.

هنا ، يتم إنشاء نموذج شريحة دماغية خارج الجسم الحي من الخلايا السرطانية النقيلية لسرطان الثدي في بيئتها الدقيقة. تم حقن الفئران داخل الجمجمة مع سرطان الثدي الدماغ النقيلي الدماغ التغذية MDA-MB-231BR الخلايا¹³ في الفص الجداري القشرة الدماغية - وهو موقع شائع من TNBC ورم خبيث^14,15 وسمح لتطوير الأورام. تم توليد شرائح الدماغ من هذه الحيوانات المطعمة بالأجانب وحافظت عليها خارج الجسم الحي كثقافات عضوية كما هو موضح^{في 16,17}. يسمح هذا النموذج الجديد خارج الجسم الحي بتحليل نمو خلية BCBM داخل حمة الدماغ ويمكن استخدامه لاختبار العوامل العلاجية والتأثيرات الإشعاعية على الخلايا السرطانية داخل البيئة الدقيقة للدماغ.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول ويتبع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة دريكسل (IACUC). تم استخدام الفئران الإناث Nu / Nu athymic (6-8 أسابيع) في هذه الدراسة.

1. الحقن داخل الجمجمة للخلايا السرطانية

1. تعقيم جميع المعدات (ملاقط ، مقص ، مقص خياطة ، مثقاب يدوي) تحت دورة جافة من الأوتوكلاف لمدة تصل إلى 45 دقيقة في أكياس التعقيم ، بما في ذلك مؤشر التعقيم. في حالة إجراء عمليات جراحية على متعددة ، قم بتعقيم الأدوات بين الحيوانات باستخدام معقم خرز ساخن (حتى 3x).
2. تخدير الفئران وفقا لبروتوكول رعاية الحيوانات للمستخدمين (على سبيل المثال ، الأيزوفلوران (4 ٪ للحث ، 1-2 ٪ الصيانة) وإدارة التسكين (تحت الجلد ، 0.1 مل من 0.1mg / kg buprenorphine SR-LAB) قبل بدء الجراحة. ضمان عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
3. ضع الفئران في إطار مجسمة وشل حركة الرأس باستخدام قضبان الأذن القياسية (الشكل 1A). تطبيق مرهم العيون على العينين.
4. تعقيم سطح الرأس عن طريق التطبيق المتكرر بالتناوب (3x) من مسحات اليود و 70٪ من الإيثانول قبل الشق.
5. استخدم مشرطا جراحيا لإجراء شق خط الوسط 1 سم عبر الجلد بزاوية قطرية قليلا إلى الخط الوهمي الذي يقسم دماغ الفئران إلى نصفين متماثلين لفضح الجمجمة. امسح أي دم بقطعة قطن.
6. قم بتحويل الجلد أفقيا لفضح موقع الحقن: 2 مم على اليمين ، 1 مم إلى الأمام مع الإشارة إلى البريجما (+2 متوسط الجانب) ، +1 السطح / الذيلي (+1RC).
7. استخدم بت بير (0.73 مم) لاختراق الجمجمة +2ML ، +1RC إلى bregma وحفر ثقب باستخدام ضغط طفيف وحركة التواء.
8. استخدم حقنة حقن الدماغ لحقن 5 ميكرولتر من 100000 خلية MDA-MB-231BR (تعبر بثبات عن GFP-Luciferase) / محلول ميكرولتر في محلول 1x PBS معقم عن طريق إدخال المحقنة في البداية بعمق 3.5 مم إلى الدماغ.
9. اترك المحقنة تستقر لمدة 2 دقيقة. اسحبه لأعلى حوالي 1 مم ، وبعد 2 دقيقة ، قم بحقن النصف الأول من الحجم ببطء.
10. انتظر لمدة 2 دقيقة أخرى قبل حقن الباقي ، ثم اسحب المحقنة ببطء بعد 3 دقائق من الحقن النهائي.
    ملاحظة: الحقن البطيء تجريبي في السماح لأنسجة المخ بامتصاص الحجم جيدا وعدم خلق تسرب بعد سحب المحقنة ، مما قد يؤدي إلى نمو الخلايا السرطانية خارج الموقع المقصود.
11. ضع شمع العظام على موقع الحقن على الجمجمة ثم استخدم خيوط البولي بروبيلين لخياطة الأنسجة. سوف تتعافى الفئران في غضون 5 دقائق بعد إزالة التخدير.
12. راقب سلوكهم مباشرة بعد الجراحة لمدة 10 دقائق و 3 ساعات في وقت لاحق وفي اليوم التالي لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى علاج خاص ، بما في ذلك الحقن الملحي والأغذية اللينة وما إلى ذلك ، للمساعدة في الشفاء السريع.
13. راقب نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي على نظام التصوير.
    1. لهذا ، أولا ، قم بتشغيل الأكسجين والأيزوفلوران على نظام التصوير. اسمح بتوزيع كليهما على الغرفة المنفصلة خارج صندوق التصوير.
    2. ثم قم بتشغيل البرنامج وتهيئة الأداة واختر الخيار المناسب لتصور جسم الماوس بالكامل والتقاطه.
14. ضع الفئران في الغرفة المنفصلة مع الأيزوفلوران وتأكد من عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم. حقن الفئران داخل الصفاق مع 200 ميكرولتر من 30 ملغ / مل لوسيفيرين.
15. انقل معدة الفئران إلى أنف غرفة التصوير المزود بالأكسجين والأيزوفلوران. قفل الغرفة ، واختيار التعرض 2 دقيقة لبدء التصوير.
16. استخدم أداة ROI (منطقة الاهتمام) الخاصة بالبرنامج لتحديد كمية إشارة اللمعان الحيوي للورم.
17. لتحليل حجم الورم ، اختر أداة شكل الدائرة ، وتناسبها حول شكل الورم وحجمه. قياس عائد الاستثمار والإبلاغ عن إجمالي القراءات.
18. اسمح بنمو الورم الصلب لمدة 12-14 يوما (أو حتى يصل لوسيفيراز إلى حوالي 7.0 × 10⁶ وحدات) (الشكل 1 ب) قبل توليد شرائح الدماغ.
    ملاحظة: زيادة عدد الخلايا المراد حقنها سيؤدي إلى نمو الورم بشكل أسرع. لذلك ، يمكن أن يحدث توليد شرائح الدماغ قبل 12 يوما. من ناحية أخرى ، سيؤدي الورم الأكبر إلى المزيد من شرائح GFP + إذا سمح لها بالنمو لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما ، تبدأ صحة الفئران في التدهور بسرعة ؛ وبالتالي يجب زيادة مراقبة صحة الحيوان إلى مرة واحدة يوميا بعد النقطة الزمنية البالغة 10 أيام ، ويجب استخدام أي فئران تظهر عليها علامات الألم و / أو عدم الراحة لتوليد الشرائح.

2. توليد شرائح الدماغ

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات بعد عزل الدماغ في غطاء تدفق صفحي معقم. من الممكن عادة توليد 35-40 شريحة فردية تحتوي على خلايا سرطانية (إشارة luciferase) من فأر واحد يتم حقنه بخلايا MDA-MB-231BR (الشكل 1C).

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. ضع قطاعة الأنسجة في غطاء التدفق الرقائقي المعقم ونظف جميع الأدوات والأدوات باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪.
2. بعد 12-14 يوما من حقن خلايا MDA-MB-231BR داخل الجمجمة ، قم بتخدير الفئران وفقا لبروتوكول رعاية الحيوانات للمستخدمين كما هو موضح في 1.2. ضمان عمق التخدير الأمثل مع قرصة إصبع القدم.
3. إزالة ووضع أدمغتهم بسرعة (في غضون 45 ثانية) في الثلج البارد (4 درجة مئوية) السكروز-ACSF تتكون مما يلي: 280 mM السكروز ، 5 mM KCl ، 2 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl 2 ، 20 mM الجلوكوز ، 10 mM HEPES ، 5 mM Na + - الأسكوربات ، 3 mM thiouria ،₂ mM Na ⁺ ، 29 mM pyruvate ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3.
4. باستخدام مشرط حاد ومعقم أو شفرة حلاقة، قم بقطع الأجزاء الزائدة من الدماغ التي لا تحتوي على أي ورم من جميع الجوانب، بما في ذلك الجزء السفلي من الدماغ.
5. أحضر شكل الدماغ إلى مكعب غير مثالي للجلوس بشكل مسطح على ورق الترشيح المبلل ACSF على غطاء طبق 60 مم لتسهيل التقطيع.
   ملاحظة: تتم إزالة الأنسجة الإضافية للدماغ حيث من غير المحتمل أن يكون الورم قد نما قبل التقطيع للسماح بتوليد شرائح GFP + في الغالب وإنشاء شكل من أشكال الدماغ مستقر على سطح الأداة ولن ينزعج من الاهتزازات الناجمة عن التقطيع.
6. ضع عدة أوراق من دوائر ورق الترشيح المبللة مسبقا (مع ACSF) على منصة القطع وضع الأنسجة المسدودة فوقها.
7. اضبط حجم القطع على الأداة على 2 أو 2.5 وحدة على المسطرة المتوفرة لتقطيع الأنسجة إلى أقسام 200-250 ميكرومتر.
   ملاحظة: الشرائح التي يصل حجمها إلى 350 ميكرومتر أو التي يصل سمكها إلى 100 ميكرومتر قابلة للحياة. بالنسبة للشرائح <200 ميكرومتر ، استخدم اهتزازا أو ضغطا.
8. استخدم فرشاة الطلاء (السمور) لنقل شرائح الدماغ إلى طبق يحتوي على السكروز ACSF وفصل الشرائح تحت المجهر الضوئي باستخدام إبر 27 G.
9. حدد شرائح GFP الإيجابية تحت المجهر الفلوري وانقلها إلى طبق جديد 60 مم يحتوي على 2-3 مل من وسائط الشرائح البالغة (Neurobasal medium A ، 2٪ B12 supplement ، 1٪ N2 supplement ، 1٪ glutamine ، 0.5٪ glucose ، 10 U / ml penicillin ، و 100 μg / mL streptomycin) باستخدام ماصة معقمة 1 مل مقطوعة (فتحة واسعة).
   ملاحظة: يتم استبعاد شرائح الدماغ التي تحتوي على خلايا سرطانية تنمو على سطح الدماغ (ربما بسبب تسرب خلايا الحقن ، وما إلى ذلك).
10. انقل 3-5 شرائح على كل 30 مم ، 0.4 ميكرومتر حجم المسام مزرعة الأنسجة إدراج في لوحات 6 آبار على مسافة لا تسمح بالنمو في بعضها البعض.
11. قم بإزالة الوسط الزائد من سطح الإدراج باستخدام ماصة P1000 ، وأضف 1 مل من وسط شريحة الماوس البالغ أسفل كل إدراج وقم بموازنة الوسائط في الحاضنة قبل التقطيع.
12. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO_{2 ،} ورطوبة 95٪ لمدة 24 ساعة قبل التصوير.

3. تصوير IVIS للشرائح

ملاحظة: قم بإجراء خطوات إضافة اللوسيفيراز والمثبطات في غطاء التدفق الرقائقي المعقم.

1. ماصة 5 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين 30 ملغم / مل في الوسط تحت الإدخالات عن طريق رفع الإدراج بالملقط ووضعه مرة أخرى في البئر بعد إضافة لوسيفيرين إلى الوسائط الموجودة في البئر.
2. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مع الغطاء داخل غرفة التصوير الخاصة بالأداة أسفل الكاميرا الثابتة وقم بقفل باب الغرفة.
3. افتح البرنامج وقم بتهيئة الأداة.
4. اختر إعدادات الكاميرا التي تسمح بالتصور والتقاط بئر واحد فقط لكل صورة. حرك المرحلة لأعلى (FOV من 5 سم) ووضع البئر الذي يجب تصويره مباشرة تحت الكاميرا.
5. اضبط وقت التصوير على الأنسب اعتمادا على شدة اللوسيفيراز التي سينبعث منها الورم ، والتي يمكن أن تختلف من 10 ثوان إلى 5 دقائق. ابدأ بضبطها على 10 ثوان ثم قم بزيادتها إذا كانت الإشارة منخفضة ولكن احتفظ بها متسقة لجميع النقاط والظروف الزمنية حتى نهاية التجربة (الشكل 1D).
6. استخدم أداة عائد الاستثمار (أداة شكل الدائرة) ، وقم بملاءمتها حول شكل الورم وحجمه ، وقم بقياس عائد الاستثمار ، وأبلغ عن إجمالي القراءات لتحديد إشارة اللمعان الحيوي لكل ورم على الشريحة.
7. أعد اللوحة إلى غطاء التدفق الرقائقي المعقم ، واستخدم الملقط لرفع الإدراج قليلا من البئر.
8. استنشق الوسط واستبدله ب 1 مل من الوسط الطازج وضع الإدراج مرة أخرى في البئر.
9. بالنسبة للتجارب التي يتم فيها معالجة الشرائح بمركبات مختلفة مثل المثبطات والأيضات وما إلى ذلك ، قم بإعداد التركيز المناسب للكاشف في 1.2 مل من وسائط شرائح الدماغ في أنبوب 1.5 مل ثم انقل 1 مل إلى البئر الذي يحتوي على الشريحة.
10. كرر هذه العملية كل 48 ساعة طوال مدة الدراسة.

4. التصوير الحي لنمو الورم في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي

ملاحظة: إمداد الإدخالات بمتوسط كاف (1.5 مل) لتحمل طول التجربة حيث لا يمكن إضافة وسيط إضافي أثناء التصوير المباشر.

1. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار على حامل لوحة المجهر الآلي داخل الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO_{2 ،} ورطوبة 95٪).
2. افتح البرنامج، وقم بتشغيل brightfield على الربع الأول لضبط التعرض اللازم لعرض الشرائح. للعثور على موضع (إحداثيات "xy") للشريحة ، انتقل باستخدام "xy" على الربع الثاني للتحكم في إحداثيات "xyz" للمجهر.
3. حدد لوحة 6-well كأدوات مختبرية مستخدمة لهذه التجربة. حدد محرر خرائط عائد الاستثمار وسجل هذا الموضع عن طريق تحديد عائد استثمار جديد، وإضافة عائد استثمار هذا وحفظه.
4. كرر نفس الخطوات لجميع المناطق الأخرى ذات الأهمية في الآبار الأخرى. بعد إضافة جميع عائد الاستثمار، احفظ جميع عائد الاستثمار.
5. ضمن البروتوكول، حدد مسح موجود وحدد الفاصل الزمني ضمن الاستحواذ، متبوعا بتحديد قنوات الاهتمام (في هذه الحالة GFP).
6. أوقف التركيز البؤري التلقائي في إعداد التركيز البؤري واضبط التركيز البؤري المناسب لجميع الشرائح يدويا. أخيرا ، اضبط كثافة Brightfield وإثارة قناة الفلورسنت ووقت التعرض إلى المستوى المناسب.
7. اضبط البروتوكول للحصول على صور كل 15 دقيقة لمدة 48 ساعة.
8. حفظ البروتوكول وتشغيله. في نهاية التجربة ، سيحتوي الملف المحفوظ على كل من صور brightfield و GFP التي تم التقاطها لكل عائد استثمار.
9. لدمج الصور في مقطع فيديو، أعد تسمية جميع الصور ذات الأهمية بنفس الاسم متبوعة برقم ثنائي لتنظيمها بالترتيب الذي تم التقاطها به (على سبيل المثال، ROI1 (1)، RO1 (2) ...)
10. افتح ImageJ واستورد الصور بالنقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور. حدد أسماء الملفات التي تظهر في قائمة، واكتب محتوى اسم الملفات في المربع يحتوي على اسم الملف الذي سيظهر لتحديد تلك الملفات المحددة للفيديو.
11. احفظ الصور المدمجة ضمن ملف > حفظ باسم > AVI.

5. فحص MTS والكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة المخ خارج الجسم الحي

1. فحص MTS
   1. قم باستئصال الشرائح عن طريق قطع غشاء زراعة الأنسجة أسفل كل شريحة على طول حواف الأنسجة ونقل الأنسجة ، التي لا تزال متصلة بالغشاء ، إلى صفيحة من 96 بئرا.
   2. أضف كاشف MTS الممزوج بنسبة 1:5 مع وسائط الثقافة و 0.01٪ triton (1x) للسماح باختراق المحلول في الأنسجة ، بحجم إجمالي قدره 120 ميكرولتر في كل بئر.
   3. استخدم 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) كعامل لجعل شرائح الدماغ غير قابلة للحياة ، وبالتالي تحكم إيجابي لهذه التجربة. اغمر شريحة الدماغ ذات الأهمية في 4٪ PFA لمدة 1 ساعة في RT (درجة حرارة الغرفة) أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية قبل المتابعة في فحص MTS.
   4. اسمح لكاشف MTS بالتفاعل على الشرائح لمدة 4 ساعات ، وقم بإزالة الشرائح من الآبار وقياس الامتصاص عند 490 نانومتر لجميع الظروف ، بما في ذلك بئر فارغ بدون شريحة كمرجع.
   5. الإبلاغ عن القراءات كدالة لمنطقة شريحة الأنسجة، التي تم قياسها باستخدام مسطرة الفرجار الرقمية.
2. إعداد الكيمياء النسيجية المناعية
   1. اغمر شرائح الدماغ المتصلة بسطح الغشاء في 10٪ من الفورمالين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإجراء التضمين والمعالجة والحجب وتوليد شرائح غير ملطخة من الأنسجة. استخدم بروتوكول تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية القياسي لتلطيخ H & E و Ki-67 و gamma-H2AX و CC3 و GFAP و GFP و DAPI

6. تشعيع الورم في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي

1. تشعيع الورم مع 6 Gy (310 كيلو فولت من الأشعة السينية).
   ملاحظة: الوحدات التي تم إدخالها للحصول على الجرعة الإجمالية من 6 Gy هي 3522 وحدة بعد النظر في وحدات R (تم قياسها باستخدام مقياس فيكتورين الكهربائي) وتصحيحات ل thimble وكثافة الهواء و cGy / R كما هو موضح سابقا¹⁸. وقت التعرض هو 130.9 ثانية.
2. استخدم 0.25 مم Cu + 1 مم Al Add filtration ، 50 سم SSD ، 125 cGy في الدقيقة.
3. قم بإجراء قياس الجرعات بواسطة غرفة تأين داخل الحزمة معايرة وفقا لمعيار أساسي.
4. قم بإجراء تصحيحات يومية للرطوبة ودرجة الحرارة والضغط الجوي.

النتائج

تم حقن خلايا MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase داخل الجمجمة في نصف الكرة الأيمن لفئران Nu / Nu البالغة من العمر 4-6 أسابيع كما هو موضح أعلاه (الشكل 1A) وسمح لها بالنمو لمدة 12-14 يوما ، وخلال هذه الفترة تم رصد نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي (الشكل 1B). لقد حقن 100,000 خلية سرطانية...

Discussion

تؤسس هذه الدراسة طريقة جديدة لزراعة الدماغ خارج الجسم الحي لأورام الدماغ xenograft المزروعة. نظهر أن خلايا BCBM MDA-MB-231BR التي يتم حقنها داخل الجمجمة في دماغ الفئران يمكن أن تبقى على قيد الحياة وتنمو في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي . اختبرت الدراسة أيضا خلايا الورم الأرومي الدبقي U87MG (GBM) ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe, slip tip	BD	309659
30 G1/2 Needles	BD	305106
6-well plates	Genessee	25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Beaker 50 mL	Fisher	10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0	Electron Microscopy Sciences	66100-50
Bone Wax	ModoMed	DYNJBW25
Brain injection Syringe	Hamilton Company	80430
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody	Cell Signaling	14220S
DAPI	Invitrogen	P36935
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Double edge razor blade	VWR	55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0	Electron Microscopy Sciences	66100-20
Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Gamma-H2AX antibody	Millipore	05-636
GFAP antibody	Thermo Fisher	13-0300
GFP antibody	Santa Cruz	SC-9996
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
H&E and KI-67	Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid	Fisher Scientific	BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR cells	Kindly provided by Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl2·6H2O	Fisher Scientific	M33-500
Mice imaging device	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Mice imaging software	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagent	Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution	(Cat:G3582)
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nu/Nu athymic mice	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylene Suture	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatula/probe	Fine Science Tools	10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Surgical Scalpel	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(McIlwain type)
Tissue culture inserts	Millipore	PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine	Precision 250 kVp