Un modèle de tranche cérébrale ex vivo pour étudier et cibler la croissance tumorale métastatique du cancer du sein

Résumé

Nous introduisons un protocole pour mesurer en temps réel la réponse médicamenteuse et radiologique des cellules métastatiques du cerveau du cancer du sein dans un modèle organotypique de tranches cérébrales. Les méthodes fournissent un test quantitatif pour étudier les effets thérapeutiques de divers traitements sur les métastases cérébrales du cancer du sein de manière ex vivo dans l’interface du microenvironnement cérébral.

Résumé

Les métastases cérébrales sont une conséquence grave du cancer du sein chez les femmes, car ces tumeurs sont difficiles à traiter et sont associées à de mauvais résultats cliniques. Les modèles murins précliniques de croissance métastatique du cerveau du cancer du sein (BCBM) sont utiles mais coûteux, et il est difficile de suivre les cellules vivantes et l’invasion des cellules tumorales dans le parenchyme cérébral. Présenté ici est un protocole pour les cultures de tranches de cerveau ex vivo de souris xénogreffées contenant des sous-lignées clonales de cancer du sein injectées par voie intracrânienne. Les cellules marquées par la luciférase MDA-MB-231BR ont été injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris femelles Nu / Nu, et après la formation de tumeurs, les cerveaux ont été isolés, tranchés et cultivés ex vivo. Les tranches tumorales ont été imagées pour identifier les cellules tumorales exprimant la luciférase et surveiller leur prolifération et leur invasion dans le parenchyme cérébral pendant 10 jours. En outre, le protocole décrit l’utilisation de la microscopie time-lapse pour imager la croissance et le comportement invasif des cellules tumorales après un traitement par rayonnement ionisant ou chimiothérapie. La réponse des cellules tumorales aux traitements peut être visualisée par microscopie d’imagerie en direct, en mesurant l’intensité de la bioluminescence et en effectuant une histologie sur la tranche de cerveau contenant des cellules BCBM. Ainsi, ce modèle de tranche ex vivo peut être une plate-forme utile pour tester rapidement de nouveaux agents thérapeutiques seuls ou en combinaison avec des radiations afin d’identifier des médicaments personnalisés pour cibler la croissance métastatique du cerveau du cancer du sein d’une patiente individuelle dans le microenvironnement cérébral.

Introduction

Les métastases cérébrales du cancer du sein (BCBM) se développent lorsque les cellules se propagent de la tumeur mammaire primaire au cerveau. Le cancer du sein est la deuxième cause la plus fréquente de métastases cérébrales après le cancer du poumon, avec des métastases survenant chez 10 à 16% des patientes¹. Malheureusement, les métastases cérébrales restent incurables car >80% des patients meurent dans l’année suivant leur diagnostic de métastases cérébrales et leur qualité de vie est altérée en raison de dysfonctionnements neurologiques². Il est urgent d’identifier des options de traitement plus efficaces. Les modèles de culture monocouches bidimensionnelles ou tridimensionnelles sont les méthodes les plus couramment utilisées pour tester les agents thérapeutiques en laboratoire. Cependant, ils n’imitent pas le microenvironnement complexe BCBM, un moteur majeur du phénotype et de la croissance de la tumeur. Bien que ces modèles soient utiles, ils ne capturent pas les interactions complexes tumeur-stromale, les besoins métaboliques uniques et l’hétérogénéité des tumeurs³. Pour récapituler plus fidèlement les interactions tumeur-stromale et l’hétérogénéité du microenvironnement, notre groupe et d’autres ont commencé à générer des cultures de métastases cérébrales organotypiques en « tranches » avec des cellules tumorales dérivées du patient (primaires ou métastatiques) ou des lignées cellulaires cancéreuses ^4,5,6. Comparé aux systèmes in vitro classiques, ce modèle ex vivo à court terme peut fournir des conditions plus pertinentes pour le dépistage de nouveaux traitements avant l’évaluation préclinique dans les grandes cohortes d’animaux.

Des modèles ex vivo ont été construits et utilisés avec succès principalement pour l’identification de traitements efficaces de divers cancers. Ils nécessitent quelques jours d’évaluation et peuvent en outre être adaptés au dépistage de médicaments spécifiques au patient. Par exemple, les tissus ex vivo du cancer de la vessie et de la prostate humains ont montré une réponse antitumorale dose-dépendante du docétaxel et de la gemcitabine⁷. Des tissus ex vivo similaires au carcinome colorectal ont été développés pour dépister les médicaments chimiothérapeutiques Oxaliplatin, Cetuximab et Pembrolizumab⁸. Cette application a été largement utilisée dans le cancer du pancréas, compte tenu de l’interaction essentielle entre l’environnement stromal et les caractéristiques génotypiques et phénotypiques de l’adénocarcinome canalaire pancréatique ^9,10. En outre, de tels modèles organotypiques ont été développés pour des dépistages similaires dans les tumeurs de la tête, du cou, de l’estomac et du sein^11,12.

Ici, un modèle de tranche de cerveau ex vivo de cellules tumorales métastatiques du cancer du sein xénogreffées dans leur microenvironnement est généré. Des souris ont été injectées par voie intracrânienne avec des cellules MDA-MB-231BR trophiques métastatiques du cerveau du cancer du sein¹³ dans le lobe pariétal du cortex cérébral - un site commun de métastases du CSTN^14,15 et ont permis de développer des tumeurs. Des tranches de cerveau ont été générées à partir de ces animaux xénogreffés et maintenues ex vivo sous forme de cultures organotypiques comme décrit^16,17. Ce nouveau modèle ex vivo permet d’analyser la croissance des cellules BCBM dans le parenchyme cérébral et peut être utilisé pour tester les agents thérapeutiques et les effets des radiations sur les cellules tumorales dans le microenvironnement cérébral.

Protocole

Ce protocole a été approuvé et suit les directives de soins aux animaux par le Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Des souris femelles athymiques Nu/Nu (âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.

1. Injection intracrânienne de cellules tumorales

1. Stériliser tout l’équipement (pince à épiler, ciseaux, ciseaux de suture, perceuse à main) sous un cycle sec d’un autoclave jusqu’à 45 min dans des sachets de stérilisation, y compris un indicateur de stérilisation. Si vous effectuez des chirurgies sur plusieurs animaux, stérilisez les outils entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur de perles chauffé (jusqu’à 3x).
2. Anesthésier les souris selon le protocole de soins aux animaux des utilisateurs (p. ex. isoflurane (4 % pour l’induction, 1 à 2 % d’entretien) et administrer une analgésie (sous-cutanée, 0,1 mL de 0,1 mg/kg de buprénorphine SR-LAB) avant le début de la chirurgie. Assurer une profondeur d’anesthésie optimale avec un pincement des orteils.
3. Placez les souris dans un cadre stéréotaxique et immobilisez la tête à l’aide de barres d’oreille standard (Figure 1A). Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
4. Stériliser la surface de la tête par application répétée et alternée (3x) d’écouvillons d’iode et d’éthanol à 70% avant l’incision.
5. Utilisez un scalpel chirurgical pour faire une incision médiane de 1 cm à travers la peau à un angle légèrement diagonal par rapport à la ligne imaginaire qui divise le cerveau de la souris en deux moitiés symétriques pour exposer le crâne. Essuyez tout sang avec un coton-tige.
6. Dévier la peau latéralement pour exposer le site d’injection : 2 mm à droite, 1 mm vers l’avant par rapport au bregma (+2 médiolatéral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
7. Utilisez un mèche de fraise (0,73 mm) pour pénétrer dans le crâne +2ML, +1RC jusqu’au bregma et percez un trou en utilisant une légère pression et un mouvement de torsion.
8. Utilisez une seringue d’injection cérébrale pour injecter 5 μL d’une solution de 100 000 MDA-MB-231BR (exprimant de manière stable la GFP-Luciférase) dans une solution stérile de 1x PBS en insérant initialement la seringue à 3,5 mm de profondeur dans le cerveau.
9. Laissez la seringue se déposer pendant 2 min. Tirez-le vers le haut d’environ 1 mm et, après 2 minutes, injectez lentement la première moitié du volume.
10. Attendez encore 2 minutes avant d’injecter le reste, puis tirez lentement la seringue 3 minutes après l’injection finale.
    REMARQUE: L’injection lente est empirique en permettant au volume d’être bien absorbé par le tissu cérébral et de ne pas créer de fuite après avoir tiré la seringue, ce qui peut entraîner la croissance de cellules cancéreuses à l’extérieur du site prévu.
11. Appliquez de la cire osseuse sur le site d’injection sur le crâne, puis utilisez des sutures en polypropylène pour suturer le tissu. Les souris se rétabliront dans les 5 minutes suivant le retrait de l’anesthésie.
12. Surveillez leur comportement juste après la chirurgie pendant environ 10 minutes, 3 heures plus tard et le lendemain pour déterminer si un traitement spécial, y compris l’injection de solution saline, les aliments mous, etc., est nécessaire pour aider à une récupération rapide.
13. Surveiller la croissance tumorale via l’imagerie par bioluminescence sur le système d’imagerie.
    1. Pour cela, activez d’abord l’oxygène et l’isoflurane sur le système d’imagerie. Permettre aux deux d’être distribués dans la chambre séparée à l’extérieur de la boîte d’imagerie.
    2. Ensuite, allumez le logiciel, initialisez l’instrument et choisissez l’option appropriée pour visualiser et capturer tout le corps de la souris.
14. Placez les souris dans la chambre séparée avec de l’isoflurane et assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie optimale avec un pincement des orteils. Injecter aux souris par voie intrapéritonéale 200 μL de 30 mg/mL de luciférine.
15. Transférez l’estomac de la souris jusqu’au nez de la chambre d’imagerie alimenté en oxygène et en isoflurane. Verrouillez la chambre et choisissez une exposition de 2 minutes pour commencer l’imagerie.
16. Utilisez l’outil ROI (région d’intérêt) du logiciel pour quantifier le signal bioluminescent de la tumeur.
17. Pour analyser la taille de la tumeur, choisissez l’outil de forme de cercle, ajustez-le autour de la forme et de la taille de la tumeur. Mesurez le retour sur investissement et rapportez les lectures totales.
18. Permettre la croissance de la tumeur solide pendant 12-14 jours (ou jusqu’à ce que la luciférase atteigne environ 7,0 x 10⁶ unités) (Figure 1B) avant de générer des tranches de cerveau.
    REMARQUE: L’augmentation du nombre de cellules à injecter entraînera une croissance tumorale plus rapide; par conséquent, la génération de tranches de cerveau peut se produire avant 12 jours. D’autre part, une tumeur plus grosse conduira à plus de tranches de GFP + si on la laisse se développer pendant 14 jours. Après 14 jours, la santé des souris commence à se détériorer rapidement; par conséquent, la surveillance de la santé animale devrait être augmentée à une fois par jour après le point de 10 jours, et toute souris présentant des signes de douleur et / ou d’inconfort devrait être utilisée pour générer les tranches.

2. Générer des tranches de cerveau

REMARQUE: Effectuez les étapes après l’isolement cérébral dans une hotte à flux laminaire stérile. Il est généralement possible de générer 35 à 40 tranches individuelles contenant des cellules tumorales (signal de luciférase) à partir d’une souris injectée avec des cellules MDA-MB-231BR (Figure 1C).

1. Stérilisez tous les outils chirurgicaux dans un autoclave. Placez la trancheuse de tissu dans la hotte à flux laminaire stérile et nettoyez tous les outils et instruments avec de l’éthanol à 70%.
2. Après 12 à 14 jours après l’injection intracrânienne de cellules MDA-MB-231BR, anesthésier les souris conformément au protocole de soins aux animaux des utilisateurs décrit au point 1.2. Assurer une profondeur d’anesthésie optimale avec un pincement des orteils.
3. Retirer et placer leur cerveau rapidement (dans les 45 s) dans le saccharose-ACSF glacé (4 °C) composé des éléments suivants : 280 mM de saccharose, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 20 mM de glucose, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbate, 3 mM de thiourée, 2 mM Na⁺, 29 mM de pyruvate; pH = 7,3.
4. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir tranchant et stérile, coupez les parties excédentaires du cerveau qui ne contiennent aucune tumeur de tous les côtés, y compris la partie inférieure du cerveau.
5. Apportez la forme du cerveau à un cube non parfait pour vous asseoir à plat sur le papier filtre mouillé ACSF sur un couvercle de plat de 60 mm pour faciliter le tranchage.
   REMARQUE: Le tissu supplémentaire du cerveau où il est peu probable que la tumeur se soit développée est enlevé avant le tranchage pour permettre la génération de tranches principalement GFP + et créer une forme du cerveau stable à la surface de l’instrument et ne sera pas perturbée par les vibrations causées par le tranchage.
6. Placez plusieurs feuilles de cercles de papier filtre pré-humides (avec ACSF) sur la plate-forme de coupe et placez le tissu bloqué au-dessus.
7. Réglez la taille de coupe sur l’instrument à 2 ou 2,5 unités sur la règle fournie pour couper le tissu en sections de 200 à 250 μm.
   REMARQUE: Des tranches jusqu’à 350 μm ou aussi fines que 100 μm sont viables. Pour les tranches <200 μm, utilisez un vibratome ou un compresstome.
8. Utilisez un pinceau (sable) pour transférer des tranches de cerveau dans un plat contenant du saccharose ACSF et séparez les tranches sous un microscope optique à l’aide d’aiguilles de 27 G.
9. Identifier les tranches GFP positives au microscope fluorescent et les transférer dans un nouveau plat de 60 mm contenant 2 à 3 mL de milieux tranchés adultes (milieu neurobasal A, supplément de B12 à 2 %, supplément de N2 à 1 %, 1 % de glutamine, 0,5 % de glucose, 10 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à l’aide d’une pipette stérile cassée de 1 mL (ouverture large).
   REMARQUE: Les tranches de cerveau qui contiennent des cellules tumorales se développant sur la surface du cerveau (peut-être en raison d’une fuite de cellules d’injection, etc.) sont exclues.
10. Transférer 3 à 5 tranches sur chaque insert de culture tissulaire de 30 mm et de 0,4 μm de la taille d’un pore dans des plaques de 6 puits à une distance qui ne permet pas de se développer les uns dans les autres.
11. Retirez l’excès de milieu de la surface de l’insert à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 1 mL de milieu de tranche de souris adulte sous chaque insert et équilibrez le milieu dans l’incubateur avant le tranchage.
12. Incuber les tissus à 37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité pendant 24 h avant l’imagerie.

3. Imagerie IVIS des tranches

REMARQUE: Effectuer des étapes d’ajout de luciférase et d’inhibiteur dans une hotte à écoulement laminaire stérile.

1. Pipette 5 μL de solution de luciférine de 30 mg/mL dans le milieu sous les inserts en soulevant l’insert avec une pince et en les replaçant dans le puits après addition de luciférine au milieu dans le puits.
2. Placez la plaque à 6 puits avec le couvercle à l’intérieur de la chambre d’imagerie de l’instrument sous la caméra fixe et verrouillez la porte de la chambre.
3. Ouvrez le logiciel et initialisez l’instrument.
4. Choisissez les paramètres de l’appareil photo qui permettent la visualisation et la capture d’un seul puits par image. Déplacez la scène vers le haut (FOV de 5 cm) et placez le puits qui doit être imagé directement sous la caméra.
5. Réglez le temps d’imagerie sur le plus approprié en fonction de l’intensité de la luciférase que la tumeur émettra, qui peut varier de 10 s à 5 min. Commencez par le régler sur 10 s, puis augmentez si le signal est faible, mais maintenez-le cohérent pour tous les points temporels et conditions jusqu’à la fin de l’expérience (Figure 1D).
6. Utilisez l’outil ROI (outil de forme de cercle), ajustez-le autour de la forme et de la taille de la tumeur, mesurez le retour sur investissement et rapportez les lectures totales pour quantifier le signal bioluminescent de chaque tumeur sur la tranche.
7. Ramenez la plaque à la hotte à écoulement laminaire stérile, utilisez des pinces pour soulever légèrement l’insert du puits.
8. Aspirer le milieu, le remplacer par 1 mL de milieu frais et replacer l’insert dans le puits.
9. Pour les expériences où les tranches sont traitées avec divers composés tels que des inhibiteurs, des métabolites, etc., préparer la concentration appropriée du réactif dans 1,2 mL de milieu de tranche cérébrale dans un tube de 1,5 mL, puis transférer 1 mL dans le puits contenant la tranche.
10. Répétez ce processus toutes les 48 heures pendant toute la durée de l’étude.

4. Imagerie en direct de la croissance tumorale dans des tranches de cerveau ex vivo

REMARQUE: Fournissez des inserts avec suffisamment de milieu (1,5 mL) pour durer toute la durée de l’expérience, car il n’est pas possible d’ajouter un support supplémentaire pendant l’imagerie en direct.

1. Placez la plaque à 6 puits sur le support de plaque de microscope automatisé à l’intérieur de l’incubateur (37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité).
2. Ouvrez le logiciel, activez le champ lumineux sur le premier quadrant pour ajuster l’exposition nécessaire pour afficher les tranches. Pour trouver la position (coordonnées « xy ») de la tranche, naviguez avec « xy » sur le deuxième quadrant pour contrôler les coordonnées « xyz » du microscope.
3. Sélectionnez la plaque à 6 puits comme matériel de laboratoire utilisé pour cette expérience. Sélectionnez l’éditeur de carte ROI et enregistrez cette position en sélectionnant un nouveau ROI, ajoutez et enregistrez ce ROI.
4. Répétez les mêmes étapes pour toutes les autres régions d’intérêt dans d’autres puits. Après avoir ajouté tous les rois, enregistrez tous les retours sur investissement.
5. Sous Protocole, sélectionnez Effacer existant et sélectionnez Time-Lapse sous Acquisition, puis sélectionnez les canaux d’intérêt (dans ce cas GFP).
6. Désactivez la mise au point automatique dans la configuration de la mise au point et réglez manuellement la mise au point appropriée pour toutes les tranches. Enfin, ajustez l’intensité du champ lumineux et l’excitation et le temps d’exposition du canal fluorescent au niveau approprié.
7. Réglez le protocole pour acquérir des images toutes les 15 minutes pendant 48 h.
8. Enregistrez et exécutez le protocole. À la fin de l’expérience, le fichier enregistré contiendra à la fois les images en fond clair et les images GFP capturées pour chaque retour sur investissement.
9. Pour combiner les images dans une vidéo, renommez toutes les images d’intérêt avec le même nom suivi d’un nombre binaire pour les organiser dans l’ordre dans lequel elles ont été capturées (par exemple, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
10. Ouvrez ImageJ et importez les images en cliquant sur Fichier > Importer > séquence d’images. Sélectionnez les noms de fichiers qui apparaissent dans une liste et écrivez le contenu du nom des fichiers dans la zone Nom de fichier contient qui apparaîtra pour identifier les fichiers sélectionnés pour la vidéo.
11. Enregistrez les images combinées sous Fichier > Enregistrer sous > AVI.

5. Dosage MTS et immunohistochimie du tissu cérébral ex vivo

1. ESSAI MTS
   1. Excisez les tranches en coupant la membrane de culture tissulaire sous chaque tranche le long des bords du tissu et transférez le tissu, toujours attaché à la membrane, dans une plaque de 96 puits.
   2. Ajouter le réactif MTS mélangé dans un rapport de 1:5 avec un milieu de culture et 0,01% de triton (1x) pour permettre la pénétration de la solution dans le tissu, dans un volume total de 120 μL dans chaque puits.
   3. Utilisez 4% de paraformaldéhyde (PFA) comme agent pour rendre les tranches de cerveau non viables, et donc un contrôle positif pour cette expérience. Immerger la tranche de cerveau d’intérêt dans 4% de PFA pendant 1 h à RT (température ambiante) ou pendant la nuit à 4 ° C avant de procéder au test MTS.
   4. Laissez le réactif MTS réagir sur les tranches pendant 4 h, retirez les tranches des puits et mesurez l’absorbance à 490 nm pour toutes les conditions, y compris un puits vide sans tranche comme référence.
   5. Rapportez les lectures en fonction de la zone de la tranche de tissu, mesurée à l’aide d’une règle d’étrier numérique.
2. Préparation d’immunohistochimie
   1. Immerger les tranches de cerveau attachées à la surface de l’insert membranaire dans 10% de formol pendant la nuit à 4 °C.
   2. Effectuer l’intégration, le traitement, le blocage et générer des lames non colorées du tissu. Utiliser le protocole de coloration immunohistochimique standard pour colorer pour H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. Irradiation de la tumeur dans des tranches de cerveau ex vivo

1. Irradier la tumeur avec 6 Gy (rayons X de 310 kVp).
   REMARQUE: Les unités saisies pour obtenir la dose totale de 6 Gy sont de 3522 unités après avoir pris en compte les unités R (mesurées à l’aide de l’électromètre Victoreen) et les corrections pour le dé, la densité de l’air et cGy / R comme décrit précédemment¹⁸. Le temps d’exposition est de 130,9 s.
2. Utilisez 0,25 mm Cu + 1 mm Al de filtration ajoutée, SSD de 50 cm, 125 cGy par min.
3. Effectuer la dosimétrie par une chambre d’ionisation dans le faisceau étalonnée par rapport à un étalon primaire.
4. Apportez quotidiennement des corrections pour l’humidité, la température et la pression barométrique.

Résultats

Les cellules MDA-MB-231BR-GFP-Luciférase ont été injectées par voie intracrânienne dans l’hémisphère droit de souris Nu/Nu âgées de 4 à 6 semaines, comme expliqué ci-dessus (Figure 1A) et ont été autorisées à se développer pendant 12 à 14 jours, période pendant laquelle la croissance tumorale a été surveillée par imagerie par bioluminescence (Figure 1B). Nous avons injecté 100 000 cellules cancéreuses par voie intracrânienne, comme l’...

Discussion

Cette étude établit une nouvelle méthode de culture cérébrale ex vivo pour les tumeurs cérébrales explantées de xénogreffes. Nous montrons que les cellules BCBM MDA-MB-231BR injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris peuvent survivre et se développer dans des tranches de cerveau ex vivo . L’étude a également testé des cellules de glioblastome U87MG (GBM) injectées par voie intracrânienne et a également constaté que ces cellules cancéreuses survivent et se développ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe, slip tip	BD	309659
30 G1/2 Needles	BD	305106
6-well plates	Genessee	25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Beaker 50 mL	Fisher	10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0	Electron Microscopy Sciences	66100-50
Bone Wax	ModoMed	DYNJBW25
Brain injection Syringe	Hamilton Company	80430
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody	Cell Signaling	14220S
DAPI	Invitrogen	P36935
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Double edge razor blade	VWR	55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0	Electron Microscopy Sciences	66100-20
Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Gamma-H2AX antibody	Millipore	05-636
GFAP antibody	Thermo Fisher	13-0300
GFP antibody	Santa Cruz	SC-9996
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
H&E and KI-67	Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid	Fisher Scientific	BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR cells	Kindly provided by Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl2·6H2O	Fisher Scientific	M33-500
Mice imaging device	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Mice imaging software	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagent	Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution	(Cat:G3582)
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nu/Nu athymic mice	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylene Suture	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatula/probe	Fine Science Tools	10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Surgical Scalpel	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(McIlwain type)
Tissue culture inserts	Millipore	PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine	Precision 250 kVp