Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Özet

Meme kanseri beyin metastatik hücrelerinin gerçek zamanlı ilaç ve radyasyon yanıtını ölçmek için organotipik bir beyin dilimi modelinde bir protokol sunuyoruz. Yöntemler, çeşitli tedavilerin meme kanserinden beyin metastazları üzerindeki terapötik etkilerini, beyin mikroçevre arayüzü içinde ex vivo bir şekilde araştırmak için nicel bir test sağlar.

Özet

Beyin metastazı, kadınlar için meme kanserinin ciddi bir sonucudur, çünkü bu tümörlerin tedavisi zordur ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. Meme kanseri beyin metastatik (BCBM) büyümesinin klinik öncesi fare modelleri yararlıdır, ancak pahalıdır ve beyin parankimi içindeki canlı hücreleri ve tümör hücresi invazyonunu izlemek zordur. Burada, intrakraniyal olarak enjekte edilen meme kanseri beyin arayan klonal alt hatları içeren ksenograflanmış farelerden ex vivo beyin dilimi kültürleri için bir protokol sunulmaktadır. MDA-MB-231BR lusiferaz etiketli hücreler, Nu/Nu dişi farelerin beyinlerine intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümör oluşumunu takiben, beyinler izole edildi, dilimlendi ve ex vivo kültüre alındı. Tümör dilimleri, lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerini tanımlamak ve beyin parankimindeki proliferasyonlarını ve istilalarını 10 güne kadar izlemek için görüntülendi. Ayrıca, protokol, iyonlaştırıcı radyasyon veya kemoterapi ile tedaviyi takiben tümör hücrelerinin büyümesini ve invaziv davranışını görüntülemek için hızlandırılmış mikroskopinin kullanımını açıklar. Tümör hücrelerinin tedavilere yanıtı, canlı görüntüleme mikroskopisi, biyolüminesans yoğunluğunun ölçülmesi ve BCBM hücrelerini içeren beyin dilimi üzerinde histoloji yapılması ile görselleştirilebilir. Bu nedenle, bu ex vivo dilim modeli, bireysel bir hastanın meme kanseri beyin metastatik büyümesini beyin mikro ortamında hedeflemek üzere kişiselleştirilmiş ilaçları tanımlamak için tek başına veya radyasyonla kombinasyon halinde yeni terapötik ajanların hızlı bir şekilde test edilmesi için yararlı bir platform olabilir.

Giriş

Meme kanseri beyin metastazları (BCBM), hücreler birincil meme tümöründen beyne yayıldığında gelişir. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra beyin metastazının ikinci en sık nedenidir ve metastazlar hastaların %10-16'sında görülür¹. Ne yazık ki, beyin metastazları, hastaların %>80'i beyin metastazı tanısından sonraki bir yıl içinde öldüğü ve nörolojik işlev bozuklukları nedeniyle yaşam kalitelerinin bozulduğu için tedavi edilemez olmaya devam etmektedir². Daha etkili tedavi seçeneklerinin belirlenmesi için acil bir ihtiyaç vardır. Tek katmanlı iki boyutlu veya üç boyutlu kültür modelleri, terapötik ajanların laboratuvarda test edilmesinde en sık kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, tümör fenotipinin ve büyümesinin önemli bir itici gücü olan karmaşık BCBM mikro ortamını taklit etmezler. Bu modeller yararlı olmasına rağmen, karmaşık tümör-stromal etkileşimleri, benzersiz metabolik gereksinimleri ve tümörlerin heterojenliğini yakalamaz³. Tümör-stromal etkileşimleri ve mikroçevre heterojenliğini daha sadık bir şekilde özetlemek için, grubumuz ve diğerleri, hasta kaynaklı tümör hücreleri (birincil veya metastatik) veya kanser hücresi hatları ^4,5,6 ile organotipik beyin metastazı "dilim" kültürleri üretmeye başlamıştır. Klasik in vitro sistemlerle karşılaştırıldığında, bu kısa süreli ex vivo model, büyük hayvan kohortlarında klinik öncesi değerlendirmeden önce yeni terapötiklerin taranması için daha uygun koşullar sağlayabilir.

Ex vivo modelleri, öncelikle çeşitli kanserlerin başarılı tedavilerinin tanımlanması için inşa edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Birkaç günlük değerlendirme gerektirirler ve ayrıca hastaya özgü ilaç taramasına uyarlanabilirler. Örneğin, insan mesane ve prostat kanseri ex vivo dokuları, dosetaksel ve gemsitabin^7'nin doza bağımlı bir anti-tümör yanıtı göstermiştir. Kemoterapötik ilaçlar Oxaliplatin, Cetuximab ve Pembrolizumab^8'i taramak için benzer kolorektal karsinom ex vivo dokular geliştirilmiştir. Bu uygulama pankreas kanserinde, pankreatik duktal adenokarsinomun stromal ortamı ile genotipik ve fenotipik özellikleri arasındaki temel etkileşim göz önüne alındığında yaygın olarak kullanılmaktadır ^9,10. Ayrıca, baş, boyun, gastrik ve meme tümörlerinde benzer taramalar için bu tür organotipik modeller geliştirilmiştir^11,12.

Burada, mikro-ortamlarındaki ksenograflanmış meme kanseri beyin metastatik tümör hücrelerinin ex vivo beyin dilim modeli üretilmektedir. Farelere, TNBC metastazı 14,15'in ortak bir bölgesi olan serebral korteks parietal lobunda meme kanseri beyin metastatik beyin trofik MDA-MB-231BR hücreleri ¹³ ile intrakraniyal olarak enjekte edildi ve ^tümörlerin gelişmesine izin verildi. Beyin dilimleri bu ksenograflanmış hayvanlardan üretildi ve ^16,17'de tanımlandığı gibi organotipik kültürler olarak ex vivo tutuldu. Bu yeni ex vivo model, BCBM hücresinin beyin parankimi içindeki büyümesinin analizine izin verir ve beyin mikro ortamındaki tümör hücreleri üzerindeki terapötik ajanları ve radyasyon etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Protokol

Bu protokol, Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kılavuzlarına uygundur. Bu çalışmada Nu/Nu atimik dişi fareler (6-8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Tümör hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu

1. Tüm ekipmanı (cımbız, makas, dikiş makası, el matkabı) bir otoklav kuru döngüsü altında, sterilizasyon göstergesi de dahil olmak üzere sterilizasyon torbalarında 45 dakikaya kadar sterilize edin. Birden fazla hayvan üzerinde ameliyat yapıyorsanız, ısıtılmış bir boncuk sterilizatörü (3x'e kadar) kullanarak hayvanlar arasındaki aletleri sterilize edin.
2. Fareleri kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi altına alın (örneğin, izofluran (indüksiyon için% 4,% 1-2 bakım) ve ameliyata başlamadan önce analjezi (deri altı, 0.1mg / kg buprenorfin SR-LAB'nin 0.1mL'si) uygulayın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.
3. Fareleri stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve standart kulak çubuklarını kullanarak kafayı hareketsiz hale getirin (Şekil 1A). Gözlere oftalmik merhem uygulayın.
4. Kesiden önce tekrarlanan, alternatif iyot çubukları ve %70 etanol uygulaması (3x) ile başın yüzeyini sterilize edin.
5. Kafatasını ortaya çıkarmak için farelerin beynini iki simetrik yarıya bölen hayali çizgiye hafif çapraz bir açıyla deriden 1 cm'lik bir orta hat kesisi yapmak için cerrahi bir neşter kullanın. Herhangi bir kanı pamuklu çubukla silin.
6. Enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için cildi yanal olarak saptırın: sağda 2 mm, bregmaya göre 1 mm öne (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).
7. Kafatasına +2ML, +1RC'yi bregmaya nüfuz ettirmek için bir bur ucu (0.73 mm) kullanın ve hafif basınç ve büküm hareketi kullanarak bir delik açın.
8. Başlangıçta şırıngayı beyne 3,5 mm derinlikte yerleştirerek steril 1x PBS'de 100.000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferaz'ı istikrarlı bir şekilde ifade eden) hücrelerini / μL çözeltisini 5 μL enjekte etmek için bir beyin enjeksiyon şırıngası kullanın.
9. Şırınganın 2 dakika yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 1 mm yukarı çekin ve 2 dakika sonra, hacmin ilk yarısını yavaşça enjekte edin.
10. Geri kalanını enjekte etmeden önce 2 dakika daha bekleyin ve ardından son enjeksiyondan 3 dakika sonra şırıngayı yavaşça çekin.
    NOT: Yavaş enjeksiyon, hacmin beyin dokusu tarafından iyi emilmesine ve şırıngayı çektikten sonra sızıntı yaratmamasına izin vermede ampiriktir, bu da amaçlanan bölgenin dışında büyüyen kanser hücrelerine yol açabilir.
11. Kafatasındaki enjeksiyon bölgesine kemik balmumu uygulayın ve ardından dokuyu dikmek için polipropilen dikişler kullanın. Fareler anestezinin çıkarılmasından sonra 5 dakika içinde iyileşir.
12. Hızlı iyileşmeye yardımcı olmak için tuzlu su enjeksiyonu, yumuşak yiyecekler vb. dahil olmak üzere özel tedaviye ihtiyaç duyulup duyulmadığını belirlemek için ameliyattan hemen sonra yaklaşık 10 dakika, 3 saat sonra ve ertesi gün davranışlarını izleyin.
13. Görüntüleme sisteminde biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyümesini izleyin.
    1. Bunun için önce görüntüleme sistemindeki oksijen ve izofluranı açın. Her ikisinin de görüntüleme kutusunun dışındaki ayrı odaya dağıtılmasına izin verin.
    2. Ardından, yazılımı açın, cihazı başlatın ve tüm fare gövdesini görselleştirmek ve yakalamak için uygun seçeneği belirleyin.
14. Fareleri izofluran ile ayrı odaya yerleştirin ve bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın. Farelere intraperitoneal olarak 200 μL 30 mg / mL lusiferin enjekte edin.
15. Farelerin midesini, görüntüleme odasının oksijen ve izofluran ile beslenen burun deliğine aktarın. Odayı kilitleyin ve görüntülemeye başlamak için 2 dakikalık süre pozlamayı seçin.
16. Tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için yazılımın ROI (ilgi bölgesi) aracını kullanın.
17. Tümör boyutunu analiz etmek için, daire şekli aracını seçin, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin. Yatırım getirisini ölçün ve toplam okumaları raporlayın.
18. Beyin dilimleri oluşturmadan önce 12-14 gün boyunca (veya lusiferaz yaklaşık 7.0 x 10⁶ üniteye ulaşana kadar) katı tümör büyümesine izin verin (Şekil 1B).
    NOT: Enjekte edilecek hücre sayısının arttırılması daha hızlı tümör büyümesine yol açacaktır; bu nedenle, beyin dilimlerinin oluşumu 12 günden daha erken gerçekleşebilir. Öte yandan, daha büyük bir tümör, 14 gün boyunca büyümesine izin verilirse daha fazla GFP + dilimine yol açacaktır. 14 gün sonra, farelerin sağlığı hızla bozulmaya başlar; Bu nedenle hayvan sağlığı izleme, 10 günlük zaman noktasından sonra günde bir kez arttırılmalı ve dilimleri oluşturmak için ağrı ve / veya rahatsızlık belirtileri gösteren fareler kullanılmalıdır.

2. Beyin dilimleri oluşturun

NOT: Steril laminer akış başlığında beyin izolasyonundan sonraki adımları uygulayın. MDA-MB-231BR hücreleri ile enjekte edilen bir fareden tümör hücreleri (lusiferaz sinyali) içeren 35-40 ayrı dilim üretmek tipik olarak mümkündür (Şekil 1C).

1. Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. Doku dilimleyiciyi steril laminer akış başlığına yerleştirin ve tüm alet ve aletleri %70 etanol ile temizleyin.
2. İntrakraniyal MDA-MB-231BR hücre enjeksiyonundan 12-14 gün sonra, fareleri 1.2'de açıklandığı gibi kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi yapın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.
3. Beyinlerini hızla (45 saniye içinde) buz gibi soğuk (4 °C) sakaroz-ACSF'ye çıkarın ve aşağıdakilerden oluşur: 280 mM sakaroz, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,₂₀ mM glikoz, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-askorbat, 3 mM tiourea,₂ mM Na⁺, 29 mM piruvat; pH=7,3.
4. Keskin, steril bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beynin alt kısmı da dahil olmak üzere her taraftan herhangi bir tümör içermeyen beynin fazla kısımlarını kesin.
5. Dilimlemeyi kolaylaştırmak için 60 mm'lik bir çanak kapağı üzerindeki ACSF ıslak filtre kağıdının üzerine düz oturmak için beynin şeklini mükemmel olmayan bir küpe getirin.
   NOT: Tümörün büyümesinin muhtemel olmadığı beynin ekstra dokusu, çoğunlukla GFP + dilimlerinin üretilmesine izin vermek ve aletin yüzeyinde stabil olan ve dilimlemenin neden olduğu titreşimlerden rahatsız olmayacak bir beyin şekli oluşturmak için dilimlemeden önce çıkarılır.
6. Kesme platformuna birkaç yaprak önceden ıslanmış (ACSF ile) filtre kağıdı çemberi yerleştirin ve tıkalı mendili bunun üzerine yerleştirin.
7. Dokuyu 200-250 μm kesitlere bölmek için cihaz üzerindeki kesim boyutunu sağlanan cetvel üzerinde 2 veya 2,5 birime ayarlayın.
   NOT: 350 μm'ye kadar veya 100 μm'ye kadar ince dilimler uygulanabilir. <200 μm dilimler için bir vibratom veya komprestom kullanın.
8. Beyin dilimlerini sakkaroz ACSF içeren bir kaba aktarmak için bir boya fırçası (samur) kullanın ve dilimleri 27 G iğneleri kullanarak hafif bir mikroskop altında ayırın.
9. Floresan mikroskop altında GFP pozitif dilimleri tanımlayın ve steril 1 mL kırık pipet (geniş açıklık) kullanarak 2-3 mL yetişkin dilim ortamı (Nörobazal ortam A,% 2 B12 takviyesi,% 1 N2 takviyesi,% 1 glutamin,% 0.5 glikoz, 10 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) içeren yeni bir 60 mm kaba aktarın.
   NOT: Beyin yüzeyinde büyüyen tümör hücrelerini içeren beyin dilimleri (belki enjeksiyon hücresi sızıntısı vb. nedeniyle) hariç tutulmuştur.
10. Her 30 mm, 0,4 μm gözenek boyutunda doku kültürü ekine, 6 delikli plakalar halinde birbirine büyümeye izin vermeyecek bir mesafede 3-5 dilim aktarın.
11. P1000 pipet kullanarak fazla ortamı kesici ucun yüzeyinden çıkarın, her bir kesici ucun altına 1 mL yetişkin fare dilimi ortamı ekleyin ve dilimlemeden önce inkübatördeki ortamı dengeleyin.
12. Görüntülemeden önce dokuları 37 °C, %5 CO₂ ve %95 nemde 24 saat boyunca inkübe edin.

3. Dilimlerin IVIS görüntülemesi

NOT: Steril laminer akış başlığında lusiferaz ve inhibitör ekleme adımları uygulayın.

1. Pipet, 5 μL'lik 30 mg/mL lusiferin çözeltisini kesici uçlarla kaldırıp kuyucuktaki ortama lusiferin ilavesinden sonra tekrar kuyuya yerleştirerek kesici uçların altındaki ortama döker.
2. 6 delikli plakayı, kapağı cihazın görüntüleme odasının içine yerleştirerek sabit kameranın altına yerleştirin ve hazne kapağını kilitleyin.
3. Yazılımı açın ve cihazı başlatın.
4. Görüntü başına yalnızca bir kuyunun görselleştirilmesine ve yakalanmasına izin veren kamera ayarlarını seçin. Sahneyi yukarı doğru hareket ettirin (5 cm'lik FOV) ve görüntülenmesi gereken kuyuyu doğrudan kameranın altına yerleştirin.
5. Tümörün yayacağı lusiferazın yoğunluğuna bağlı olarak görüntüleme süresini en uygun şekilde ayarlayın, bu da 10 s ila 5 dakika arasında değişebilir. 10 sn'ye ayarlayarak başlayın ve sinyal düşükse artırın, ancak deneyin sonuna kadar tüm zaman noktaları ve koşullar için tutarlı tutun (Şekil 1D).
6. ROI aracını (daire şekli aracı) kullanın, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin, ROI'yi ölçün ve dilimdeki her tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için toplam okumaları raporlayın.
7. Plakayı steril laminer akış başlığına geri getirin, kesici ucu kuyudan hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.
8. Ortamı aspire edin, 1 mL taze ortamla değiştirin ve kesici ucu tekrar kuyucuğa yerleştirin.
9. Dilimlerin inhibitörler, metabolitler vb. gibi çeşitli bileşiklerle muamele edildiği deneyler için, reaktifin uygun konsantrasyonunu 1.5 mL'lik bir tüp içinde 1.2 mL'lik beyin dilimi ortamında hazırlayın ve ardından 1 mL'yi dilimi içeren kuyuya aktarın.
10. Bu işlemi çalışma süresince her 48 saatte bir tekrarlayın.

4. ex vivo beyin dilimlerinde tümör büyümesinin canlı görüntülenmesi

NOT: Canlı görüntüleme sırasında ek ortam eklemek mümkün olmadığından, deneyin uzunluğuna dayanacak kadar ortama (1,5 mL) sahip kesici uçlar sağlayın.

1. 6 delikli plakayı inkübatörün içindeki otomatik mikroskop plakası tutucusuna yerleştirin (37 ° C,% 5 CO₂ ve% 95 nem).
2. Yazılımı açın, dilimleri görüntülemek için gereken pozlamayı ayarlamak için ilk kadranda parlak alanı açın. Dilimin konumunu ("xy" koordinatları) bulmak için, mikroskopun "xyz" koordinatlarını kontrol etmek için ikinci kadranda "xy" ile gezinin.
3. Bu deney için kullanılan laboratuvar yazılımı olarak 6 kuyulu plakayı seçin. YG harita düzenleyicisini seçin ve yeni bir YG seçerek bu konumu kaydedin, bu YG'yi ekleyin ve kaydedin.
4. Diğer kuyulardaki diğer tüm ilgi alanları için aynı adımları tekrarlayın. Tüm YG'leri ekledikten sonra, tüm YG'leri kaydedin.
5. Protokol altında, Varolanı Temizle'yi seçin ve Edinme altında Zaman Aşımı'nı seçin, ardından ilgilenilen kanalları (bu durumda GFP) seçin.
6. Netleme Ayarları'nda Otomatik Netleme'yi kapatın ve tüm dilimler için uygun odağa manuel olarak ayarlayın. Son olarak, Parlak Alan Yoğunluğu ve Floresan Kanal Uyarma ve Pozlama Süresi'ni uygun seviyeye ayarlayın.
7. Protokolü 48 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü alacak şekilde ayarlayın.
8. Protokolü kaydedin ve çalıştırın. Denemenin sonunda, kaydedilen dosya her yatırım getirisi için yakalanan hem parlak alan hem de GFP görüntülerini içerecektir.
9. Bir videodaki görüntüleri birleştirmek için, ilgilenilen tüm görüntüleri aynı adla yeniden adlandırın ve ardından yakalandıkları sırayla düzenlemek için ikili bir sayı ekleyin (örneğin, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
10. ImageJ'yi açın ve Dosya > Görüntü Dizisini İçe Aktar>a tıklayarak görüntüleri içe aktarın. Listede görünen dosya adlarını seçin ve video için seçilen dosyaları tanımlamak üzere görüntülenecek Dosya Adı İçeriği kutusuna dosyaların adının içeriğini yazın.
11. Birleştirilen görüntüleri Dosya > Farklı Kaydet > AVI altında kaydedin.

5. ex vivo beyin dokusunun MTS testi ve immünohistokimyası

1. MTS TAHLILİ
   1. Dokunun kenarları boyunca her dilimin altındaki doku kültürü zarını keserek dilimleri eksize edin ve hala zara bağlı olan dokuyu 96 delikli bir plakaya aktarın.
   2. MTS reaktifini, çözeltinin dokuya nüfuz etmesine izin vermek için, kültür ortamı ve% 0.01 triton (1x) ile 1: 5 oranında karıştırılmış olarak, her bir kuyucukta toplam 120 μL hacimde ekleyin.
   3. Beyin dilimlerini uygulanabilir hale getirmek için bir ajan olarak% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanın ve böylece bu deney için olumlu bir kontrol sağlayın. MTS testine devam etmeden önce RT'de (oda sıcaklığında) 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de ilgilendiğiniz beyin dilimini% 4 PFA'ya batırın.
   4. MTS reaktifinin dilimler üzerinde 4 saat boyunca reaksiyona girmesine izin verin, dilimleri kuyucuklardan çıkarın ve referans olarak dilim içermeyen boş bir kuyu da dahil olmak üzere tüm koşullar için 490 nm'de emiciliği ölçün.
   5. Okumaları, dijital bir kumpas cetveli ile ölçülen doku dilimi alanının bir fonksiyonu olarak raporlayın.
2. İmmünohistokimya preparatı
   1. Membran kesici uç yüzeyine tutturulmuş beyin dilimlerini 4 °C'de gece boyunca% 10 formalin içine daldırın.
   2. Gömme, işleme, bloke etme işlemlerini gerçekleştirin ve dokunun lekesiz slaytlarını oluşturun. H&E, Ki-67, gama-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI için boyama yapmak için standart immünohistokimya boyama protokolünü kullanın

6. Tümörün ex vivo beyin dilimlerinde ışınlanması

1. Tümörü 6 Gy (310 kVp röntgen) ile ışınlayın.
   NOT: Toplam 6 Gy dozunu almak için girilen birimler, R birimleri (Victoreen elektrometresi kullanılarak ölçülür) ve daha^{önce tarif edildiği} gibi zımba, hava yoğunluğu ve cGy / R için düzeltmeler dikkate alındıktan sonra 3522 birimdir. Pozlama süresi 130.9 sn'dir.
2. 0,25 mm Cu +1 mm Al ilave filtrasyon, 50 cm SSD, dakikada 125 cGy kullanın.
3. Dozimetriyi, birincil standarda göre kalibre edilmiş bir ışın içi iyonizasyon odası ile gerçekleştirin.
4. Nem, sıcaklık ve barometrik basınç için günlük düzeltmeler yapın.

Sonuçlar

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferaz hücreleri, yukarıda açıklandığı gibi 4-6 haftalık Nu/Nu farelerin sağ yarımküresine intrakraniyal olarak enjekte edildi (Şekil 1A) ve 12-14 gün boyunca büyümesine izin verildi, bu süre zarfında tümör büyümesi biyolüminesans görüntüleme ile izlendi (Şekil 1B). Diğer grup¹⁹ tarafından bildirildiği gibi kafa içi 100.000 kanser hücresi enjekte ettik, ancak 20.000 hücre

Tartışmalar

Bu çalışma, ekşik ksenogreft beyin tümörleri için yeni bir ex vivo beyin kültürü yöntemi ortaya koymaktadır. Farelerin beynine intrakraniyal olarak enjekte edilen BCBM hücreleri MDA-MB-231BR hücrelerinin ex vivo beyin dilimlerinde hayatta kalabileceğini ve büyüyebileceğini gösteriyoruz. Çalışma ayrıca intrakraniyal olarak enjekte edilen U87MG glioblastoma (GBM) hücrelerini test etti ve ayrıca bu kanser hücrelerinin beyin dilimlerinde hayatta kaldığını ve büyüdüğünü bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe, slip tip	BD	309659
30 G1/2 Needles	BD	305106
6-well plates	Genessee	25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Beaker 50 mL	Fisher	10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0	Electron Microscopy Sciences	66100-50
Bone Wax	ModoMed	DYNJBW25
Brain injection Syringe	Hamilton Company	80430
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody	Cell Signaling	14220S
DAPI	Invitrogen	P36935
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Double edge razor blade	VWR	55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0	Electron Microscopy Sciences	66100-20
Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Gamma-H2AX antibody	Millipore	05-636
GFAP antibody	Thermo Fisher	13-0300
GFP antibody	Santa Cruz	SC-9996
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
H&E and KI-67	Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid	Fisher Scientific	BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR cells	Kindly provided by Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl2·6H2O	Fisher Scientific	M33-500
Mice imaging device	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Mice imaging software	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagent	Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution	(Cat:G3582)
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nu/Nu athymic mice	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylene Suture	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatula/probe	Fine Science Tools	10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Surgical Scalpel	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(McIlwain type)
Tissue culture inserts	Millipore	PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine	Precision 250 kVp