Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

Resumen

Presentamos un protocolo para medir la respuesta a la droga y la radiación en tiempo real de las células metastásicas cerebrales del cáncer de mama en un modelo organotípico de corte cerebral. Los métodos proporcionan un ensayo cuantitativo para investigar los efectos terapéuticos de varios tratamientos en las metástasis cerebrales del cáncer de mama de manera ex vivo dentro de la interfaz del microambiente cerebral.

Resumen

La metástasis cerebral es una consecuencia grave del cáncer de mama para las mujeres, ya que estos tumores son difíciles de tratar y se asocian con malos resultados clínicos. Los modelos preclínicos de ratón de crecimiento metastásico cerebral (BCBM) del cáncer de mama son útiles pero son costosos, y es difícil rastrear las células vivas y la invasión de células tumorales dentro del parénquima cerebral. Aquí se presenta un protocolo para cultivos de cortes cerebrales ex vivo de ratones xenoinjertados que contienen sublíneas clonales de búsqueda de cerebro de cáncer de mama inyectado intraranalmente. Las células marcadas con la luciferasa MDA-MB-231BR se inyectaron intracranealmente en los cerebros de ratones hembra Nu/Nu, y después de la formación del tumor, los cerebros se aislaron, cortaron y cultivaron ex vivo. Las rebanadas tumorales fueron fotografiadas para identificar células tumorales que expresan luciferasa y monitorear su proliferación e invasión en el parénquima cerebral durante un máximo de 10 días. Además, el protocolo describe el uso de la microscopía de lapso de tiempo para obtener imágenes del crecimiento y el comportamiento invasivo de las células tumorales después del tratamiento con radiación ionizante o quimioterapia. La respuesta de las células tumorales a los tratamientos se puede visualizar mediante microscopía de imágenes en vivo, midiendo la intensidad de la bioluminiscencia y realizando histología en la rebanada cerebral que contiene células BCBM. Por lo tanto, este modelo de corte ex vivo puede ser una plataforma útil para la prueba rápida de nuevos agentes terapéuticos solos o en combinación con radiación para identificar medicamentos personalizados para atacar el crecimiento metastásico cerebral de cáncer de mama de un paciente individual dentro del microambiente cerebral.

Introducción

Las metástasis cerebrales del cáncer de mama (BCBM) se desarrollan cuando las células se diseminan del tumor primario de mama al cerebro. El cáncer de mama es la segunda causa más frecuente de metástasis cerebral después del cáncer de pulmón, con metástasis que ocurren en el 10-16% de las pacientes¹. Desafortunadamente, las metástasis cerebrales siguen siendo incurables, ya que >80% de los pacientes mueren dentro de un año después de su diagnóstico de metástasis cerebral, y su calidad de vida se ve afectada debido a disfunciones neurológicas². Existe una necesidad urgente de identificar opciones de tratamiento más efectivas. Los modelos de cultivo monocapa bidimensionales o tridimensionales son los métodos más utilizados en la prueba de agentes terapéuticos en el laboratorio. Sin embargo, no imitan el complejo microambiente BCBM, un importante impulsor del fenotipo y el crecimiento del tumor. Aunque estos modelos son útiles, no capturan las complejas interacciones tumor-estroma, los requerimientos metabólicos únicos y la heterogeneidad de los tumores³. Para recapitular más fielmente las interacciones tumor-estroma y la heterogeneidad del microambiente, nuestro grupo y otros han comenzado a generar cultivos organotípicos de metástasis cerebrales "slice" con células tumorales derivadas del paciente (primarias o metastásicas) o líneas celulares cancerosas ^4,5,6. En comparación con los sistemas in vitro clásicos, este modelo ex vivo a corto plazo puede proporcionar condiciones más relevantes para el cribado de nuevas terapias antes de la evaluación preclínica en cohortes de animales grandes.

Los modelos ex vivo se han construido y utilizado con éxito principalmente para la identificación de tratamientos exitosos de varios tipos de cáncer. Requieren pocos días de evaluación y, además, se pueden adaptar a la detección de medicamentos específicos del paciente. Por ejemplo, los tejidos ex vivo de cáncer de vejiga y próstata humano han mostrado una respuesta antitumoral dependiente de la dosis de docetaxel y gemcitabina⁷. Se desarrollaron tejidos similares de carcinoma colorrectal ex vivo para detectar los fármacos quimioterapéuticos Oxaliplatino, Cetuximab y Pembrolizumab⁸. Esta aplicación ha sido ampliamente utilizada en cáncer de páncreas, considerando la interacción esencial entre el ambiente estromal y las características genotípicas y fenotípicas del adenocarcinoma ductal pancreático ^9,10. Además, se han desarrollado modelos organotípicos para exámenes similares en tumores de cabeza, cuello, gástricos y de mama^11,12.

Aquí, se está generando un modelo de corte cerebral ex vivo de células tumorales metastásicas cerebrales de cáncer de mama xenoinjertadas en su microambiente. A los ratones se les inyectó intracranealmente cáncer de mama cerebro metastásico cerebral trófico MDA-MB-231BR células¹³ en el lóbulo parietal de la corteza cerebral, un sitio común de metástasis TNBC ^14,15 y se les permitió desarrollar tumores. Se generaron cortes cerebrales a partir de estos animales xenoinjertados y se mantuvieron ex vivo como cultivos organotípicos como se describe^16,17. Este nuevo modelo ex vivo permite el análisis del crecimiento de las células BCBM dentro del parénquima cerebral y se puede utilizar para probar agentes terapéuticos y efectos de radiación en las células tumorales dentro del microambiente cerebral.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado y sigue las pautas de cuidado animal por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. En este estudio se utilizaron ratones hembra atímicos Nu/Nu (6-8 semanas de edad).

1. Inyección intracraneal de células tumorales

1. Esterilizar todo el equipo (pinzas, tijeras, tijeras de sutura, taladro manual) bajo un ciclo seco de un autoclave durante un máximo de 45 minutos en bolsas de esterilización, incluido un indicador de esterilización. Si realiza cirugías en varios animales, esterilice las herramientas entre animales con un esterilizador de cuentas calentado (hasta 3x).
2. Anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios (por ejemplo, isoflurano (4% para la inducción, 1-2% de mantenimiento) y administrar analgesia (subcutánea, 0,1 ml de 0,1 mg / kg de buprenorfina SR-LAB) antes del inicio de la cirugía. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
3. Coloque los ratones en un marco estereotáxico e inmovilice la cabeza con barras auditivas estándar (Figura 1A). Aplique ungüento oftálmico en los ojos.
4. Esterilizar la superficie de la cabeza mediante la aplicación repetida y alterna (3x) de hisopos de yodo y etanol al 70% antes de la incisión.
5. Use un bisturí quirúrgico para hacer una incisión de línea media de 1 cm a través de la piel en un ángulo ligeramente diagonal con respecto a la línea imaginaria que divide el cerebro de los ratones en dos mitades simétricas para exponer el cráneo. Limpie la sangre con un hisopo de algodón.
6. Desvíe la piel lateralmente para exponer el sitio de inyección: 2 mm a la derecha, 1 mm hacia adelante con referencia a la bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
7. Use una broca de fresa (0,73 mm) para penetrar el cráneo +2ML, +1RC en el bregma y perfore un orificio con una ligera presión y movimiento de torsión.
8. Use una jeringa de inyección cerebral para inyectar 5 μL de una solución de 100,000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferasa que expresa de manera estable) / μL en 1x PBS estéril insertando inicialmente la jeringa de 3.5 mm de profundidad en el cerebro.
9. Deje que la jeringa se asiente durante 2 min. Tire de él hacia arriba aproximadamente 1 mm, y después de 2 minutos, inyecte lentamente la primera mitad del volumen.
10. Espere otros 2 minutos antes de inyectar el resto y luego tire lentamente de la jeringa 3 minutos después de la inyección final.
    NOTA: La inyección lenta es empírica al permitir que el volumen sea bien absorbido por el tejido cerebral y no cree fugas después de tirar de la jeringa, lo que puede provocar que las células cancerosas crezcan fuera del sitio previsto.
11. Aplique cera ósea en el sitio de inyección en el cráneo y luego use suturas de polipropileno para suturar el tejido. Los ratones se recuperarán dentro de los 5 minutos posteriores a la extracción de la anestesia.
12. Controle su comportamiento inmediatamente después de la cirugía durante aproximadamente 10 minutos, 3 h más tarde y al día siguiente para determinar si se necesita un tratamiento especial, que incluye inyección de solución salina, alimentos blandos, etc., para ayudar a una recuperación rápida.
13. Monitoree el crecimiento del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia en el sistema de imágenes.
    1. Para esto, primero, encienda el oxígeno y el isoflurano en el sistema de imágenes. Permita que ambos se distribuyan a la cámara separada fuera de la caja de imágenes.
    2. Luego, encienda el software, inicialice el instrumento y elija la opción adecuada para visualizar y capturar todo el cuerpo del mouse.
14. Coloque los ratones en la cámara separada con isoflurano y asegure una profundidad de anestesia óptima con un pellizco en el dedo del pie. Inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con 200 μL de 30 mg/ml de luciferina.
15. Transfiera el estómago de los ratones hasta la nariz de la cámara de imágenes suministrada con oxígeno e isoflurano. Bloquee la cámara y elija 2 minutos de exposición para comenzar a tomar imágenes.
16. Utilice la herramienta ROI (región de interés) del software para cuantificar la señal bioluminiscente del tumor.
17. Para analizar el tamaño del tumor, elija la herramienta de forma de círculo, colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor. Mida el ROI e informe las lecturas totales.
18. Permitir el crecimiento del tumor sólido durante 12-14 días (o hasta que la luciferasa alcance aproximadamente 7.0 x 10⁶ unidades) (Figura 1B) antes de generar cortes cerebrales.
    NOTA: Aumentar el número de células a inyectar conducirá a un crecimiento tumoral más rápido; por lo tanto, la generación de cortes cerebrales puede ocurrir antes de 12 días. Por otro lado, un tumor más grande conducirá a más rebanadas de GFP + si se deja crecer durante 14 días. Después de 14 días, la salud de los ratones comienza a deteriorarse rápidamente; por lo tanto, el monitoreo de la salud animal debe aumentarse a una vez al día después del punto de tiempo de 10 días, y cualquier ratón que muestre signos de dolor y / o incomodidad debe usarse para generar las rebanadas.

2. Generar cortes cerebrales

NOTA: Realice los pasos después del aislamiento cerebral en una campana de flujo laminar estéril. Por lo general, es posible generar 35-40 rebanadas individuales que contienen células tumorales (señal de luciferasa) a partir de un ratón inyectado con células MDA-MB-231BR (Figura 1C).

1. Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas en autoclave. Coloque la cortadora de tejido en la campana de flujo laminar estéril y limpie todas las herramientas e instrumentos con etanol al 70%.
2. Después de 12-14 días después de la inyección intracraneal de células MDA-MB-231BR, anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios como se describe en 1.2. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
3. Retiren y coloquen sus cerebros rápidamente (dentro de los 45 s) en sacarosa-ACSF helada (4 °C) compuesta por lo siguiente: 280 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 20 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 5 mM de Na+-ascorbato, 3 mM de tiourea, 2 mM de Na⁺, 29 mM de piruvato; pH=7,3.
4. Usando un bisturí afilado y estéril o una cuchilla de afeitar, corte el exceso de partes del cerebro que no contienen ningún tumor de todos los lados, incluida la parte inferior del cerebro.
5. Lleve la forma del cerebro a un cubo no perfecto para sentarse sobre el papel de filtro humedecido ACSF en una tapa de plato de 60 mm para facilitar el corte.
   NOTA: El tejido adicional del cerebro donde es poco probable que el tumor haya crecido se extirpa antes del corte para permitir la generación de rodajas en su mayoría GFP + y crear una forma del cerebro que sea estable en la superficie del instrumento y no se perturbe por las vibraciones causadas por el corte.
6. Coloque varias hojas de círculos de papel de filtro prehúmedos (con ACSF) en la plataforma de corte y coloque el tejido bloqueado encima de esta.
7. Ajuste el tamaño de corte en el instrumento a 2 o 2.5 unidades en la regla provista para cortar el tejido en secciones de 200-250 μm.
   NOTA: Las rodajas de hasta 350 μm o tan delgadas como 100 μm son viables. Para rebanadas <200 μm, use un vibratomo o un comprimido.
8. Use un pincel (sable) para transferir rebanadas de cerebro a un plato que contenga sacarosa ACSF y separe las rodajas bajo un microscopio de luz con agujas de 27 G.
9. Identifique las rodajas positivas de GFP bajo el microscopio fluorescente y transfiéralas a un nuevo plato de 60 mm que contenga 2-3 ml de medios de rebanada para adultos (medio neurobasal A, suplemento de B12 al 2%, suplemento de N2 al 1%, glutamina al 1%, glucosa al 0,5%, penicilina de 10 U / ml y estreptomicina de 100 μg / ml) utilizando una pipeta estéril de 1 ml rota (abertura ancha).
   NOTA: Se excluyen las rebanadas cerebrales que contienen células tumorales que crecen sobre la superficie del cerebro (tal vez debido a la fuga de células inyectables, etc.).
10. Transfiera 3-5 rodajas a cada inserto de cultivo de tejido de 30 mm y 0,4 μm de tamaño de poro en placas de 6 pocillos a una distancia que no permita crecer entre sí.
11. Retire el exceso de medio de la superficie del inserto con una pipeta P1000, agregue 1 ml de medio de corte de ratón adulto debajo de cada inserto y equilibre el medio en la incubadora antes de cortar.
12. Incubar los tejidos a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad durante 24 h antes de la toma de imágenes.

3. Imágenes IVIS de rebanadas

NOTA: Realice los pasos de adición de luciferasa e inhibidor en una campana de flujo laminar estéril.

1. Pipetear 5 μL de 30 mg/ml de solución de luciferina en el medio debajo de los insertos levantando el inserto con fórceps y colocándolos de nuevo en el pozo después de la adición de luciferina a los medios en el pozo.
2. Coloque la placa de 6 pocillos con la tapa dentro de la cámara de imágenes del instrumento debajo de la cámara estacionaria y cierre la puerta de la cámara.
3. Abra el software e inicialice el instrumento.
4. Elija la configuración de la cámara que permita la visualización y captura de un solo pozo por imagen. Mueva el escenario hacia arriba (FOV de 5 cm) y coloque el pozo que debe ser fotografiado directamente debajo de la cámara.
5. Establezca el tiempo de imagen en el más apropiado dependiendo de la intensidad de la luciferasa que emitirá el tumor, que puede variar de 10 s a 5 min. Comience con el ajuste a 10 s y luego aumente si la señal es baja, pero manténgala consistente para todos los puntos de tiempo y condiciones hasta el final del experimento (Figura 1D).
6. Use la herramienta ROI (herramienta de forma de círculo), colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor, mida el ROI e informe las lecturas totales para cuantificar la señal bioluminiscente de cada tumor en la rebanada.
7. Lleve la placa de vuelta a la campana de flujo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeramente el inserto del pozo.
8. Aspire el medio, reemplácelo con 1 ml de medio fresco y vuelva a colocar el inserto en el pozo.
9. Para experimentos en los que las rebanadas están siendo tratadas con varios compuestos como inhibidores, metabolitos, etc., prepare la concentración adecuada del reactivo en 1,2 ml de medios de corte cerebral en un tubo de 1,5 ml y luego transfiera 1 ml al pozo que contiene la rebanada.
10. Repita este proceso cada 48 h durante la duración del estudio.

4. Imágenes en vivo del crecimiento tumoral en cortes cerebrales ex vivo

NOTA: Suministre insertos con suficiente medio (1,5 ml) para durar la duración del experimento, ya que no es posible agregar medio adicional durante la toma de imágenes en vivo.

1. Coloque la placa de 6 pocillos en el soporte de placa del microscopio automatizado dentro de la incubadora (37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad).
2. Abra el software, active brightfield en el primer cuadrante para ajustar la exposición necesaria para ver las rebanadas. Para encontrar la posición (coordenadas "xy") de la rebanada, navegue con "xy" en el segundo cuadrante para controlar las coordenadas "xyz" del microscopio.
3. Seleccione la placa de 6 pocillos como el material de laboratorio utilizado para este experimento. Seleccione el editor de mapas de ROI y registre esa posición seleccionando un nuevo ROI, agregue y guarde ese ROI.
4. Repita los mismos pasos para todas las demás regiones de interés en otros pozos. Después de haber agregado todos los ROI, guarde todos los ROI.
5. En Protocolo, seleccione Borrar existente y seleccione Lapso de tiempo en Adquisición, seguido de seleccionar los canales de interés (en este caso, GFP).
6. Desactive el enfoque automático en la configuración de enfoque y ajuste manualmente al enfoque adecuado para todos los sectores. Finalmente, ajuste la intensidad del campo brillante y la excitación del canal fluorescente y el tiempo de exposición al nivel apropiado.
7. Configura el protocolo para adquirir imágenes cada 15 min durante 48 h.
8. Guarde y ejecute el protocolo. Al final del experimento, el archivo guardado contendrá las imágenes de campo brillante y GFP capturadas para cada ROI.
9. Para combinar las imágenes en un video, cambie el nombre de todas las imágenes de interés con el mismo nombre seguido de un número binario para organizarlas en el orden en que fueron capturadas (por ejemplo, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
10. Abra ImageJ e importe las imágenes haciendo clic en Archivo > Importar > secuencia de imágenes. Seleccione los nombres de archivo que aparecen en una lista y escriba el contenido del nombre de los archivos en el cuadro Contiene nombre de archivo que aparecerá para identificar los archivos seleccionados para el vídeo.
11. Guarde las imágenes combinadas en Archivo > Guardar como > AVI.

5. Ensayo MTS e inmunohistoquímica del tejido cerebral ex vivo

1. ENSAYO MTS
   1. Elimine las rodajas cortando la membrana de cultivo de tejido debajo de cada rebanada a lo largo de los bordes del tejido y transfiera el tejido, aún unido a la membrana, en una placa de 96 pocillos.
   2. Añadir el reactivo MTS mezclado en una proporción de 1:5 con medios de cultivo y tritón al 0,01% (1x) para permitir la penetración de la solución en el tejido, en un volumen total de 120 μL en cada pocillo.
   3. Use paraformaldehído al 4% (PFA) como agente para hacer que las rebanadas cerebrales sean inviables y, por lo tanto, un control positivo para este experimento. Sumerja la rebanada cerebral de interés en PFA al 4% durante 1 h a RT (temperatura ambiente) o durante la noche a 4 ° C antes de continuar con el ensayo MTS.
   4. Permita que el reactivo MTS reaccione sobre las rodajas durante 4 h, retire las rodajas de los pocillos y mida la absorbancia a 490 nm para todas las condiciones, incluido un pozo vacío sin rebanada como referencia.
   5. Informe las lecturas en función del área de corte de tejido, medida con una regla de pinza digital.
2. Preparación inmunohistoquímica
   1. Sumerja las rodajas cerebrales unidas a la superficie del inserto de membrana en formalina al 10% durante la noche a 4 °C.
   2. Realizar incrustaciones, procesar, bloquear y generar portaobjetos no manchados del tejido. Utilice el protocolo de tinción inmunohistoquímica estándar para teñir para H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. Irradiación del tumor en rodajas cerebrales ex vivo

1. Irradiar el tumor con 6 Gy (radiografías de 310 kVp).
   NOTA: Las unidades ingresadas para obtener la dosis total de 6 Gy son 3522 unidades después de considerar las unidades R (medidas con el electrómetro Victoreen) y las correcciones para el dedal, la densidad del aire y cGy / R como se describió anteriormente¹⁸. El tiempo de exposición es de 130,9 s.
2. Utilice 0,25 mm Cu + 1 mm Al filtración añadida, 50 cm SSD, 125 cGy por minuto.
3. Realice la dosimetría mediante una cámara de ionización en el haz calibrada contra un estándar primario.
4. Haga correcciones diarias para la humedad, la temperatura y la presión barométrica.

Resultados

Las células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa se inyectaron intracranealmente en el hemisferio derecho de ratones Nu/Nu de 4-6 semanas de edad como se explicó anteriormente (Figura 1A) y se les permitió crecer durante 12-14 días, tiempo durante el cual el crecimiento del tumor fue monitoreado por imágenes de bioluminiscencia (Figura 1B). Inyectamos 100,000 células cancerosas intracranealmente según lo informado por otros grupos¹⁹, pero e...

Discusión

Este estudio establece un nuevo método de cultivo cerebral ex vivo para tumores cerebrales de xenoinjerto explantados. Demostramos que las células BCBM MDA-MB-231BR inyectadas intracranealmente en el cerebro de ratones pueden sobrevivir y crecer en rodajas cerebrales ex vivo . El estudio también probó células de glioblastoma U87MG (GBM) inyectadas intracranealmente y también encontró que estas células cancerosas sobreviven y crecen en cortes cerebrales (datos no mostrados). Creemos que este mode...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe, slip tip	BD	309659
30 G1/2 Needles	BD	305106
6-well plates	Genessee	25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Beaker 50 mL	Fisher	10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0	Electron Microscopy Sciences	66100-50
Bone Wax	ModoMed	DYNJBW25
Brain injection Syringe	Hamilton Company	80430
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody	Cell Signaling	14220S
DAPI	Invitrogen	P36935
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Double edge razor blade	VWR	55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0	Electron Microscopy Sciences	66100-20
Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Gamma-H2AX antibody	Millipore	05-636
GFAP antibody	Thermo Fisher	13-0300
GFP antibody	Santa Cruz	SC-9996
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
H&E and KI-67	Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid	Fisher Scientific	BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR cells	Kindly provided by Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl2·6H2O	Fisher Scientific	M33-500
Mice imaging device	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Mice imaging software	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagent	Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution	(Cat:G3582)
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nu/Nu athymic mice	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylene Suture	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatula/probe	Fine Science Tools	10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Surgical Scalpel	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(McIlwain type)
Tissue culture inserts	Millipore	PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine	Precision 250 kVp