מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Summary

אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת תרופות וקרינה בזמן אמת של תאים גרורתיים במוח של סרטן השד במודל פרוסת מוח אורגנוטיפית. השיטות מספקות בדיקה כמותית כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של טיפולים שונים על גרורות במוח מסרטן השד באופן ex vivo בתוך ממשק המיקרו-סביבה של המוח.

Abstract

גרורות במוח הן תוצאה חמורה של סרטן השד עבור נשים מכיוון שגידולים אלה קשים לטיפול וקשורים לתוצאות קליניות גרועות. מודלים פרה-קליניים של עכברים של גדילה גרורתית של סרטן השד במוח (BCBM) הם שימושיים אך הם יקרים, וקשה לעקוב אחר תאים חיים ופלישה של תאי גידול בתוך הפרנכימה המוחית. מוצג כאן פרוטוקול לתרביות פרוסות מוח ex vivo מעכברים עם קסנוגרפט המכילים תתי-שורות קלונליות תוך גולגולתיות של סרטן שד מוזרקות באופן תוך גולגולתי. תאים מתויגים של MDA-MB-231BR luciferase הוזרקו באופן תוך גולגולתי לתוך מוחם של עכברי נקבות Nu/Nu, ובעקבות היווצרות הגידול, המוחות בודדו, נחתכו ותרביתו ex vivo. פרוסות הגידול צולמו כדי לזהות תאים סרטניים המבטאים לוציפראז ולנטר את התפשטותם ופלישתם בפרנכימה המוחית במשך עד 10 ימים. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את השימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן כדי לדמות את הצמיחה וההתנהגות הפולשנית של תאי הגידול לאחר הטיפול בקרינה מייננת או בכימותרפיה. ניתן לדמיין את התגובה של תאי הגידול לטיפולים על ידי מיקרוסקופיה של הדמיה חיה, מדידת עוצמת הביולומינסנציה וביצוע היסטולוגיה על פרוסת המוח המכילה תאי BCBM. לפיכך, מודל פרוסת ex vivo זה עשוי להיות פלטפורמה שימושית לבדיקה מהירה של חומרים טיפוליים חדשניים בלבד או בשילוב עם קרינה כדי לזהות תרופות המותאמות אישית כדי להתמקד בצמיחה גרורתית של סרטן השד של מטופלת בודדת בתוך המיקרו-סביבה במוח.

Introduction

גרורות במוח של סרטן השד (BCBM) מתפתחות כאשר תאים מתפשטים מגידול השד הראשוני למוח. סרטן השד הוא הגורם השני בשכיחותו לגרורות במוח לאחר סרטן הריאות, כאשר גרורות מתרחשות אצל 10-16% מהחולות¹. למרבה הצער, גרורות במוח עדיין חשוכות מרפא מכיוון >80% מהחולים מתים תוך שנה לאחר אבחון גרורות במוח, ואיכות חייהם נפגעת עקב תפקוד נוירולוגי². יש צורך דחוף לזהות אפשרויות טיפול יעילות יותר. מודלים דו-ממדיים או תלת-ממדיים של תרביות חד-ממדיות הם השיטות הנפוצות ביותר בבדיקת חומרים טיפוליים במעבדה. עם זאת, הם אינם מחקים את המיקרו-סביבה המורכבת של BCBM, גורם עיקרי לפנוטיפ הגידול ולצמיחה. למרות שמודלים אלה שימושיים, הם אינם לוכדים את האינטראקציות המורכבות בין הגידול לסטרומל, את הדרישות המטבוליות הייחודיות ואת ההטרוגניות של הגידולים³. כדי לשחזר באופן נאמן יותר את האינטראקציות בין הגידול לסטרומל ואת ההטרוגניות של המיקרו-סביבה, הקבוצה שלנו ואחרים החלו ליצור תרביות "פרוסות" של גרורות מוחיות אורגנוטיפיות עם תאי גידול שמקורם בחולה (ראשוניים או גרורתיים) או קווי תאים סרטניים ^4,5,6. בהשוואה למערכות מבחנה קלאסיות, מודל ex vivo קצר טווח זה עשוי לספק תנאים רלוונטיים יותר לבדיקת טיפולים חדשים לפני הערכה פרה-קלינית בקבוצות גדולות של בעלי חיים.

מודלים של Ex vivo נבנו ושימשו בהצלחה בעיקר לזיהוי טיפולים מוצלחים בסוגי סרטן שונים. הם דורשים כמה ימים של הערכה ובנוסף ניתן להתאים אותם לבדיקת תרופות ספציפיות למטופל. לדוגמה, רקמות ex vivo של שלפוחית השתן והערמונית האנושיות הראו תגובה אנטי-סרטנית תלוית מינון של דוקטקסל וגמציטאבין⁷. רקמות קרצינומה מעי גס דומות ex vivo פותחו כדי לסנן תרופות כימותרפיות Oxaliplatin, Cetuximab, ו Pembrolizumab⁸. יישום זה נמצא בשימוש נרחב בסרטן הלבלב, בהתחשב באינטראקציה החיונית בין הסביבה הסטרומלית לבין המאפיינים הגנוטיפיים והפנוטיפיים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב ^9,10. יתר על כן, מודלים אורגנוטיפיים כאלה פותחו עבור בדיקות דומות בגידולי ראש, צוואר, קיבה ושד^11,12.

כאן נוצר מודל פרוסת מוח ex vivo של תאי גידול גרורתיים של סרטן שד קסנוגרטיבי במוח במיקרו-סביבה שלהם. עכברים הוזרקו להם באופן תוך גולגולתי תאי MDA-MB-231BR טרופיים של סרטן השד במוח^{, 13} באונה הקודקודית של קליפת המוח - אתר נפוץ של גרורות TNBC^14,15 והותר להם לפתח גידולים. פרוסות מוח נוצרו מחיות קסנוגרות אלה ושמרו על ex vivo כתרביות אורגנוטיפיות כמתואר^16,17. מודל ex vivo חדשני זה מאפשר ניתוח של גדילת תאי BCBM בתוך הפרנכימה המוחית וניתן להשתמש בו כדי לבחון חומרים טיפוליים והשפעות קרינה על תאי הגידול בתוך המיקרו-סביבה של המוח.

Protocol

פרוטוקול זה אושר ועוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל (IACUC). במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות נו/נו אתימיות (בנות 6-8 שבועות).

1. הזרקה תוך גולגולתית של תאי הגידול

1. לעקר את כל הציוד (פינצטה, מספריים, מספריים תפירה, מקדחה ביד) תחת מחזור יבש של אוטוקלאב למשך עד 45 דקות בשקיות עיקור, כולל מחוון עיקור. אם מבצעים ניתוחים בבעלי חיים מרובים, יש לעקר כלים בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזים מחומם (עד פי 3).
2. מרדימים את העכברים על פי פרוטוקול הטיפול בבעלי חיים של המשתמשים (למשל, איזופלורן (4% לאינדוקציה, 1-2% תחזוקה) ומנהלים משכך כאבים (תת עורי, 0.1 מ"ל של 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין SR-LAB) לפני תחילת הניתוח. הקפידו על עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן.
3. הכניסו את העכברים למסגרת סטריאוטקסית ושיתקו את הראש באמצעות מוטות אוזניים סטנדרטיים (איור 1A). יש למרוח משחה אופטלמית על העיניים.
4. לעקר את פני השטח של הראש על ידי יישום חוזר לסירוגין (3x) של מטושים יוד ו 70% אתנול לפני החתך.
5. השתמשו באזמל כירורגי כדי ליצור חתך בקו האמצע באורך 1 ס"מ דרך העור בזווית מעט אלכסונית לקו הדמיוני שמחלק את מוחם של העכברים לשני חצאים סימטריים כדי לחשוף את הגולגולת. נגבו כל דם עם צמר גפן.
6. הסטת העור לרוחב כדי לחשוף את אתר ההזרקה: 2 מ"מ מימין, 1 מ"מ קדימה עם התייחסות לברגמה (+2 מדיולטרלי (+2ML), +1 רוסטרל/קאודל (+1RC).
7. השתמש בביט בור (0.73 מ"מ) כדי לחדור את הגולגולת +2ML, +1RC לברגמה ולקדוח חור באמצעות לחץ קל ותנועת פיתול.
8. השתמש במזרק הזרקת מוח כדי להזריק 5 μL של 100,000 MDA-MB-231BR (מבטא ביציבות GFP-Luciferase) תאים / μL תמיסה ב- PBS סטרילי 1x על ידי החדרת המזרק בתחילה לעומק של 3.5 מ"מ למוח.
9. אפשרו למזרק להסתפק במשך 2 דקות. משכו אותו למעלה כ-1 מ"מ, ולאחר 2 דקות, הזריקו באיטיות את המחצית הראשונה של הווליום.
10. המתן עוד 2 דקות לפני שתזריק את השאר, ואז משך באיטיות את המזרק 3 דקות לאחר הזריקה הסופית.
    הערה: הזרקה איטית היא אמפירית בכך שהיא מאפשרת לנפח להיספג היטב ברקמת המוח ולא ליצור דליפה לאחר משיכת המזרק, מה שעלול להוביל לכך שתאים סרטניים יגדלו מחוץ לאתר המיועד.
11. יש למרוח שעוות עצם על אתר ההזרקה שעל הגולגולת ולאחר מכן להשתמש בתפרים פוליפרופילן כדי לתפור את הרקמה. עכברים יתאוששו תוך 5 דקות לאחר הסרת ההרדמה.
12. עקוב אחר התנהגותם מיד לאחר הניתוח במשך כ -10 דקות, 3 שעות מאוחר יותר ולמחרת כדי לקבוע אם יש צורך בטיפול מיוחד, כולל הזרקת מלח, מזון רך וכו ', כדי לסייע בהתאוששות מהירה.
13. עקוב אחר צמיחת הגידול באמצעות הדמיית bioluminescence במערכת ההדמיה.
    1. לשם כך, ראשית, להפעיל את החמצן ואת האיזופלורן על מערכת ההדמיה. אפשרו להפיץ את שניהם לתא הנפרד מחוץ לתיבת ההדמיה.
    2. לאחר מכן, הפעל את התוכנה, אתחל את המכשיר ובחר את האפשרות המתאימה להדמיה וללכידה של כל גוף העכבר.
14. מניחים את העכברים בתא הנפרד עם איזופלורן ומבטיחים עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן. הזריקו לעכברים באופן תוך-צפקי עם 200 μL של 30 מ"ג/מ"ל לוציפרין.
15. מעבירים את קיבת העכברים אל האף של תא ההדמיה המסופק עם חמצן ואיזופלורן. נעל את התא, ובחר חשיפה של שעתיים כדי להתחיל בהדמיה.
16. השתמש בכלי ROI (אזור העניין) של התוכנה כדי לכמת את האות הביולומינסנטי של הגידול.
17. כדי לנתח את גודל הגידול, בחר את כלי צורת העיגול, התאים אותו סביב צורת הגידול וגודלו. מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על סך הקריאות.
18. אפשר צמיחה של גידול מוצק למשך 12-14 יום (או עד שלוציפראז מגיע לכ-7.0 x 10⁶ יחידות) (איור 1B) לפני יצירת פרוסות מוח.
    הערה: הגדלת מספר התאים שיש להזריק תוביל לצמיחה מהירה יותר של הגידול; לכן, הדור של פרוסות המוח יכול להתרחש מוקדם יותר מ -12 ימים. מצד שני, גידול גדול יותר יוביל ליותר פרוסות GFP+ אם יורשה לו לגדול במשך 14 יום. לאחר 14 יום, בריאותם של העכברים מתחילה להידרדר במהירות; לפיכך יש להגביר את ניטור בריאות בעלי החיים לפעם אחת ביום לאחר נקודת הזמן של 10 ימים, וכל העכברים המציגים סימני כאב ו /או אי נוחות צריכים לשמש ליצירת הפרוסות.

2. צור פרוסות מוח

הערה: בצע את השלבים לאחר בידוד המוח במכסה זרימה למינרי סטרילי. בדרך כלל ניתן ליצור 35-40 פרוסות בודדות המכילות תאי גידול (אות לוציפראז) מעכבר אחד שהוזרק לו תאי MDA-MB-231BR (איור 1C).

1. לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלב. מניחים את חותך הרקמות במכסה הזרימה הלמינרי הסטרילי ומנקים את כל הכלים והמכשירים עם 70% אתנול.
2. לאחר 12-14 ימים לאחר הזרקת תאי MDA-MB-231BR תוך גולגולתיים, מרדימים את העכברים על פי פרוטוקול הטיפול בבעלי חיים של המשתמשים כמתואר ב-1.2. הקפידו על עומק הרדמה אופטימלי עם צביטה בבוהן.
3. הסר והנח את מוחם במהירות (בטווח של 45 שניות) לתוך סוכרוז-ACSF קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) המורכב מהבאים: 280 mM סוכרוז, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 20 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbate, 3 mM thiourea, 2 mM Na⁺, 29 mM pyruvate; pH=7.3.
4. באמצעות אזמל חד וסטרילי או סכין גילוח, חותכים חלקים עודפים במוח שאינם מכילים שום גידול מכל הצדדים, כולל החלק התחתון של המוח.
5. הביאו את צורת המוח לקובייה לא מושלמת כדי לשבת שטוח על נייר המסנן הרטוב ACSF על מכסה צלחת 60 מ"מ כדי להקל על החיתוך.
   הערה: רקמה נוספת של המוח שבה לא סביר שהגידול גדל מוסרת לפני החיתוך כדי לאפשר יצירת פרוסות GFP+ בעיקר וליצור צורה של המוח היציבה על פני המכשיר ולא תופרע על ידי התנודות הנגרמות על ידי החיתוך.
6. הניחו מספר גיליונות של עיגולי נייר מסנן טרום-רטובים (עם ACSF) על פלטפורמת החיתוך והניחו את הרקמה החסומה על גבי זה.
7. הגדר את גודל החיתוך במכשיר ל- 2 או 2.5 יחידות בסרגל שסופק כדי לפרוס את הרקמה למקטעים של 200-250 מיקרומטר.
   הערה: פרוסות של עד 350 מיקרומטר או דקות עד 100 מיקרומטר הן בנות קיימא. עבור פרוסות <200 מיקרומטר, השתמש בוויברטום או בדחיסה.
8. השתמשו במכחול (סייבל) כדי להעביר פרוסות מוח לתוך צלחת המכילה סוכרוז ACSF ולהפריד את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מחטים של 27 גרם.
9. זהה פרוסות חיוביות של GFP תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי והעביר אותן למנה חדשה של 60 מ"מ המכילה 2-3 מ"ל של מדיית פרוסות למבוגרים (תוסף נוירובאסל A, 2% תוסף B12, תוסף N2 1%, 1% גלוטמין, 0.5% גלוקוז, 10 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) באמצעות פיפטה סטרילית של 1 מ"ל שבורה (פתיחה רחבה).
   הערה: פרוסות המוח המכילות תאי גידול הגדלים על פני השטח של המוח (אולי עקב דליפת תאי הזרקה וכו ') אינן נכללות.
10. מעבירים 3-5 פרוסות על כל 30 מ"מ, 0.4 מיקרומטר נקבובית בגודל תרבית נקבובית מכניסים בצלחות של 6 בארות במרחק שאינו מאפשר צמיחה זה לתוך זה.
11. הסר את המדיום העודף מפני השטח של התוסף באמצעות פיפטה P1000, הוסף 1 מ"ל של מדיום פרוסת עכבר בוגר מתחת לכל תוספת ואזזן את המדיה באינקובטור לפני החיתוך.
12. דגירה של הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות למשך 24 שעות לפני ההדמיה.

3. הדמיית IVIS של פרוסות

הערה: בצעו שלבי תוספת לוציפראז ומעכבים במכסה זרימה למינרי סטרילי.

1. פיפטה 5 μL של תמיסת לוציפרין של 30 מ"ג/מ"ל לתוך המדיום שמתחת לתוספות על ידי הרמת התוספת עם מלקחיים והנחתם בחזרה לתוך הבאר לאחר הוספת לוציפרין למדיה בבאר.
2. הניחו את צלחת 6 הבארות עם המכסה בתוך תא ההדמיה של המכשיר מתחת למצלמה הנייחת ונעלו את דלת התא.
3. פתח את התוכנה ואתחל את המכשיר.
4. בחר הגדרות מצלמה המאפשרות תצוגה חזותית וצילום של באר אחת בלבד לכל תמונה. הזז את הבמה למעלה (FOV של 5 ס"מ) והנח את הבאר שיש לצלם ישירות מתחת למצלמה.
5. הגדר את זמן ההדמיה למתאים ביותר בהתאם לעוצמת הלוציפראז שהגידול יפלוט, שיכול לנוע בין 10 שניות ל -5 דקות. התחילו בהגדרתו ל-10 שניות ולאחר מכן הגדילו אם האות נמוך אך שמרו עליו עקבי עבור כל נקודות הזמן והתנאים עד סוף הניסוי (איור 1D).
6. השתמש בכלי ROI (כלי בצורת עיגול), התאם אותו סביב הצורה והגודל של הגידול, מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על הקריאות הכוללות כדי לכמת את האות הביו-לומינסצנטי של כל גידול על הפרוסה.
7. החזירו את הצלחת למכסה המנוע הסטרילי של הזרימה הלמינרית, השתמשו במלקחיים כדי להרים מעט את התוספת מהבאר.
8. לשאוף את המדיום, להחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום טרי ולהניח את התוספת בחזרה לבאר.
9. לניסויים שבהם הפרוסות מטופלות בתרכובות שונות כגון מעכבים, מטבוליטים וכו', הכינו את הריכוז המתאים של המגיב ב-1.2 מ"ל של מדיית פרוסת המוח בצינור של 1.5 מ"ל ואז העבירו 1 מ"ל לבאר המכילה את הפרוסה.
10. חזור על תהליך זה כל 48 שעות למשך המחקר.

4. הדמיה חיה של צמיחת הגידול בפרוסות המוח ex vivo

הערה: אספקת תוספות עם מספיק תווך (1.5 מ"ל) כדי להחזיק מעמד לאורך הניסוי מכיוון שלא ניתן להוסיף מדיום נוסף במהלך ההדמיה החיה.

1. הניחו את לוחית 6 הקידוחים על מחזיק לוחית המיקרוסקופ האוטומטית בתוך האינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות).
2. פתחו את התוכנה, הפעילו את Brightfield על הרביע הראשון כדי להתאים את החשיפה הדרושה כדי להציג את הפרוסות. כדי למצוא את המיקום (קואורדינטות "xy") של הפרוסה, נווט עם "xy" על הרביע השני כדי לשלוט בקואורדינטות "xyz" של המיקרוסקופ.
3. בחר צלחת 6-well כמו כלי המעבדה המשמש לניסוי זה. בחר את עורך מפת ההחזר על ההשקעה ורשום מיקום זה על-ידי בחירת החזר השקעה חדש, הוסף ושמור את ההחזר על ההשקעה.
4. חזור על אותם שלבים עבור כל אזורי העניין האחרים בבארות אחרות. לאחר הוספת כל ה- ROIs, שמור את כל ה- ROIs.
5. תחת פרוטוקול, בחר נקה קיים ובחר Time-Lapse תחת רכישה, ולאחר מכן בחר את ערוצי העניין (במקרה זה GFP).
6. כבה את המיקוד האוטומטי בהגדרת המיקוד והתכוונן באופן ידני למיקוד המתאים עבור כל הפרוסות. לבסוף, התאם את עוצמת ברייטפילד ואת עירור הערוץ הפלואורסצנטי ואת זמן החשיפה לרמה המתאימה.
7. הגדר את הפרוטוקול לרכישת תמונות כל 15 דקות למשך 48 שעות.
8. שמור והפעל את הפרוטוקול. בסיום הניסוי, הקובץ שנשמר יכיל גם את תמונות brightfield וגם את תמונות ה-GFP שצולמו עבור כל ROI.
9. כדי לשלב את התמונות בסרטון, שנה את שם כל התמונות המעניינות עם אותו שם ואחריו מספר בינארי כדי לארגן אותן לפי הסדר שבו הן צולמו (למשל, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
10. פתח את ImageJ ויבא את התמונות על-ידי לחיצה על קובץ > ייבוא רצף תמונות >. בחר את שמות הקבצים המופיעים ברשימה וכתוב את תוכן שם הקבצים בתיבה 'שם הקובץ מכיל' שיופיעו כדי לזהות את הקבצים שנבחרו עבור הסרטון.
11. שמור את התמונות המשולבות תחת קובץ > שמור כ- AVI >.

5. בדיקת MTS ואימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח ex vivo

1. בדיקת MTS
   1. הבלו את הפרוסות על ידי חיתוך קרום תרבית הרקמה שמתחת לכל פרוסה לאורך שולי הרקמה והעבירו את הרקמה, שעדיין מחוברת לממברנה, לצלחת של 96 בארות.
   2. הוסף את מגיב ה- MTS המעורב ביחס של 1:5 עם מדיית תרבית ו- 0.01% טריטון (1x) כדי לאפשר חדירה של התמיסה ברקמה, בנפח כולל של 120 μL בכל באר.
   3. השתמש ב-4% Paraformaldehyde (PFA) כסוכן כדי להפוך את פרוסות המוח לבלתי ניתנות לערעור, ובכך שליטה חיובית לניסוי זה. טבלו את פרוסת העניין במוח ב-4% PFA למשך שעה אחת ב-RT (טמפרטורת החדר) או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיכו עם בדיקת ה-MTS.
   4. אפשרו לריאגנט MTS להגיב על הפרוסות במשך 4 שעות, הסירו את הפרוסות מהבארות ומדדו את הספיגה ב-490 ננומטר עבור כל התנאים, כולל באר ריקה ללא פרוסה כהפניה.
   5. דווחו על הקריאות כפונקציה של שטח פרוסת הרקמה, הנמדדת באמצעות סרגל קליפר דיגיטלי.
2. הכנה לאימונוהיסטוכימיה
   1. טבלו את פרוסות המוח המחוברות למשטח החדרת הממברנה ב-10% פורמלין למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   2. בצע הטמעה, עיבוד, חסימה וצור שקופיות לא מוכתמות של הרקמה. השתמש בפרוטוקול צביעה אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי כדי להכתים עבור H&E, Ki-67, גמא-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. הקרנה של גידול בפרוסות מוח ex vivo

1. להקרין את הגידול עם 6 Gy (310 kVp צילומי רנטגן).
   הערה: היחידות שהוזנו כדי לקבל את המינון הכולל של 6 Gy הן 3522 יחידות לאחר ששקלו יחידות R (שנמדדו באמצעות אלקטרומטר ויקטורין) ותיקונים עבור thimble, צפיפות האוויר ו- cGy/R כפי שתואר קודם לכן¹⁸. זמן החשיפה הוא 130.9 שניות.
2. השתמש 0.25 מ"מ Cu + 1 מ"מ אל הוסיף סינון, 50 ס"מ SSD, 125 cGy לדקה.
3. בצע דוזימטריה על ידי תא יינון בתוך הקרן המכויל כנגד תקן ראשי.
4. בצע תיקונים מדי יום עבור לחות, טמפרטורה ולחץ ברומטרי.

תוצאות

תאי MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase הוזרקו באופן תוך גולגולתי לתוך ההמיספרה הימנית של עכברי Nu/Nu בני 4-6 שבועות כפי שהוסבר לעיל (איור 1A) והורשו לגדול במשך 12-14 ימים, שבמהלכם ניתן היה לנטר את צמיחת הגידול על ידי הדמיית ביולומינסנציה (איור 1B). הזרקנו 100,000 תאים סרטניים באופן תוך גול?...

Discussion

מחקר זה מבסס שיטה חדשנית של תרבית מוח ex vivo עבור גידולי מוח של קסנוגרפט מוסברים. אנו מראים שתאי BCBM MDA-MB-231BR המוזרקים באופן תוך גולגולתי במוחם של עכברים יכולים לשרוד ולגדול בפרוסות מוח ex vivo . המחקר בחן גם תאי גליובלסטומה תוך גולגולתית מסוג U87MG (GBM) שהוזרקו להם, וגם מצא שתאים סרטניים אלה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe, slip tip	BD	309659
30 G1/2 Needles	BD	305106
6-well plates	Genessee	25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Beaker 50 mL	Fisher	10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0	Electron Microscopy Sciences	66100-50
Bone Wax	ModoMed	DYNJBW25
Brain injection Syringe	Hamilton Company	80430
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody	Cell Signaling	14220S
DAPI	Invitrogen	P36935
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Double edge razor blade	VWR	55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0	Electron Microscopy Sciences	66100-20
Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Gamma-H2AX antibody	Millipore	05-636
GFAP antibody	Thermo Fisher	13-0300
GFP antibody	Santa Cruz	SC-9996
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
H&E and KI-67	Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid	Fisher Scientific	BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR cells	Kindly provided by Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl2·6H2O	Fisher Scientific	M33-500
Mice imaging device	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Mice imaging software	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagent	Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution	(Cat:G3582)
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nu/Nu athymic mice	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylene Suture	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100)	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatula/probe	Fine Science Tools	10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Surgical Scalpel	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(McIlwain type)
Tissue culture inserts	Millipore	PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine	Precision 250 kVp