ضخ الغدة الباروتية الرجعية من خلال قناة ستينسن في الرئيسيات غير البشرية لتسليم الجينات المتجهة

Summary

وقد اقترحت الغدد اللعابية كموقع مستهدف للأنسجة للعلاج الجيني، ولا سيما في مجال التطعيم عن طريق نقل الجينات. نحن نثبت تسليم الجينات في نموذج الرئيسيات غير البشرية باستخدام التسريب السباتي الرجعي.

Abstract

الغدد اللعابية هي هدف الأنسجة جذابة للعلاج الجيني مع نتائج واعدة تؤدي بالفعل إلى التجارب على الإنسان. فهي قادرة بطبيعتها على إفراز البروتينات في مجرى الدم ويمكن الوصول إليها بسهولة، مما يجعلها مواقع أنسجة متفوقة محتملة لإنتاج هرمون بديل أو التطعيم عن طريق نقل الجينات. وتشمل الطرق المقترحة لتسليم الجينات الحقن عبر الجلد والضخ الرجعي من خلال القنوات اللعابية. نحن نبين كيفية إجراء ضخ الغدة اللعابية الرجعية (RSGI) في الرئيسيات غير البشرية. نحن نصف المعالم التشريحية الهامة بما في ذلك تحديد الحليمة الباروتية ، وهي طريقة صدمية لتكتل وختم قناة ستينسن باستخدام أدوات الأسنان الأساسية ، وأنابيب البولي إيثيلين ، وسيانواكريلات ، والمعدل المناسب للتسريب. في حين أن هذه هي الطريقة الأقل صدمة للتسليم ، إلا أن الطريقة لا تزال محدودة بسبب الحجم الذي يمكن تسليمه (<0.5 مل) واحتمال حدوث صدمة في القناة والغدة. نحن نثبت باستخدام التنظير الفلوري أنه يمكن تسليم غرسة بالكامل في الغدة ، ونثبت كذلك من خلال الكيمياء المناعية نقل ناقل نموذجي والتعبير عن الجين المسلم.

Introduction

في حين أن الغدد اللعابية معروفة بإنتاجها للإفرازات من اللعاب ، فقد أدرك الباحثون منذ فترة طويلة قدرتها على إفراز البروتينات مباشرة في مجرى الدم¹، مما يجعلها هدفا محتملا للعلاج الجيني للإدارة الجهازية ، مثل الهرمونات البديلة أو إنتاج الأجسام المضادة. في الواقع ، توفر الغدد اللعابية العديد من المزايا على أهداف الأنسجة الأخرى ، مثل القدرة المتأصلة على إنتاج البروتينات للإفراز (نقص عضلات الخاصية) ، والتغليف الثقيل الذي يمكن أن يحد من انتشار النواقل ، والأنسجة المتباينة جيدا التي توفر الاستقرار للناقلات غير المتكاملة. وعلاوة على ذلك، في حالة حدوث حدث سلبي خطير، الغدد اللعابية ليست حاسمة للحياة ويمكن إزالتها جراحيا. في حين لا بديهية على الفور، الغدد السباتية هي أيضا يمكن الوصول إليها بسهولة من الفم من خلال القناة إفراز الرئيسية، القناة ستينسن².

نظرا لمزايا الأنسجة اللعابية للعلاج الجيني ، هناك اهتمام متزايد باستكشاف هذا الهدف النسيجي. وقد أجريت بالفعل العديد من الدراسات في القوارض, ال, ونماذج الرئيسيات غير البشرية وعلى الأقل تجربة سريرية بشرية واحدة جارية^3,4,5. ولمزيد من استكشاف وتطوير فائدة هذا الهدف من الأنسجة لأغراض العلاج الجيني، سيتعين إجراء المزيد من الدراسات غير البشرية على الرئيسيات. تصف هذه الورقة طريقة للوصول إلى الغدد السباتية من خلال قناة ستينسن لتقديم جين متجه للعبور في نموذج الرئيسيات غير البشرية. لإثبات بشكل واضح تسليم غرس وتشريح القناة عند دخولها الغدة ، تم إجراء التنظير الفلوري باستخدام الاتصالات الراديوية. ولإثبات نجاح نقل ناقل، استخدم جين فيروس أدينو المصلي 5 (Ad5) الموجه egfp. Ad5 هو ناقل يوصف جيدا قادرة على تحويل الأنسجة اللعابية. على الرغم من أنه مناعي للغاية للاستخدام السريري النهائي ، فقد تم اختيار ناقل Ad5 لهذه الدراسة التجريبية لضمان النقل الفعال. تقييم إنتاج البروتين الفلوري الأخضر المحسن (EGFP) هو طريقة موصوفة جيدا لإثبات النسخ الناجح والترجمة لجين متجه بعد النقل وتم القيام به هنا.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات في كلية ويك فورست للطب كلاركسون الحرم الجامعي للدراسات الحيوانية. واستشيرت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه للاعتبارات الأخلاقية وقدمت تفاصيل الإجراءات لاستعراضها. وافق Wake Forest IACUC على بروتوكول دراستنا وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب البروتوكول المعتمد من IACUC #A17-147.

1. إعداد جهاز التسريب

1. قطع حجم 10 أنبوب البولي ايثيلين (PET10) إلى 25 سم أطوال باستخدام زوج من مقص.
2. مارك PET10 في 1 سم و 2 سم من نهاية واحدة باستخدام علامة سوداء.
3. ملء مسبق 0.5 مل من محلول Ad5-EGFP (10^{9 جزيئات} فيروسية / مل) في حقنة 1 مل (tuberculin).
4. الشريحة نهاية غير ملحوظ من أنبوب PET10 أكثر من 29-31 G إبرة تعلق على حقنة. من الأسهل بشكل عام تنفيذ هذه المهمة تحت التكبير.
5. غرس الحل في PET10 حتى أنبوب كامل تماما (قطرة مرئية في نهاية حرة).
6. استخدم معدات الوقاية الشخصية القياسية الكاملة، بما في ذلك الدعك الجراحي، والثوب ذو الأكمام الطويلة، والقفازات غير المنيعة، والقناع الجراحي، ودرع الوجه، وغطاء الشعر، وأغطية الأحذية.

2. إعداد الحيوان

ملاحظة: تم استخدام المكاك Cynomolgus لمظاهرة الفيديو. تشريح الرئيسيات الأخرى غير البشرية والبشرية متشابه جدا ، ويجب أن يكون البروتوكول قابلا للترجمة إلى أنواع أخرى.

1. حقن تحت الجلد 0.05 ملغم/ كغ من الأتروبين 15 دقيقة قبل الإجراء لتقليل إفرازات اللعاب وتحسين توزيع واستبقاء ال infusate.
2. توفير التخدير باستخدام 5 مل المحاقن مع الكيتامين العضلي / ميدازولام (10-15 ملغ / كغ من الكيتامين و 0.01-0.05 ملغ / كغ من ميدازولام). تأكد من التخدير السليم عندما يصبح الحيوان المخدر فاقدا للوعي وغير قادر على التفاعل مع المحفزات.

3. تنفيذ الإجراء

1. استخدم الواجهات الفموية لتقويم الفم المفتوح.
   1. ضع وسادة مطاطية من طرف واحد من النازل على الحنك الصلب خلف الأسنان العلوية على جانب الفم المقابل للغدة التي سيتم غرسها. ضع وسادة مطاطية من الطرف الآخر على النعل السفلي على نفس الجانب كما السحب العلوي. السماح بلطف العمل الربيع من المتراجع لتوسيع وفتح الفم.
2. تحديد الحليمة السباتية، وفتح القناة ستينسن، على الخد الخلفي، المتاخمة للضرس العلوي^{2 nd.} هذا هو تصور أفضل باستخدام حلقات الأسنان للتكبير.
3. توسيع بلطف الحليمة السباتية مع نقطة من الموسع المخروطي. فمن الأفضل لوضع نقطة من المتوسع في وسط أو فتح الحليمة ومن ثم تدوير بلطف ذهابا وإيابا. النقطة يجب أن تدخل ببطء الحليمة وتوسعها على مدى ما يقرب من 20 -30 ق من الدورية لطيف.
4. أدخل أنابيب PET10 في الحليمة السباتية المتوسعة. ويتحقق ذلك على أفضل وجه من خلال عقد نهاية ملحوظ من أنبوب PET10 مع ملاقط حوالي 0.5 سم من نهاية البعيدة وإدراج بلطف غيض من الأنبوب في الحليمة المتوسعة.
   1. تقدم بلطف الأنبوب، الذي غالبا ما يسهله حركات دوارة صغيرة لمساعدة الشريحة أنبوب، تليها إعادة ضبط ملاقط 0.5 سم قريبة من قبضة السابقة. كرر ذلك حتى تصل علامة 2 سم إلى الحليمة الباروتية.
5. تطبيق سيانواكريلات على الخد حول الحليمة وأنبوب إدراج وانتظر حتى يجف (أي مبلغ محدد سجلت، فقط بما يكفي لختم مدخل الحليمة القناة ستينسن). هذا عادة ما يستغرق أقل من دقيقة ويساعد على ختم الحليمة السباتية والحد من انسكاب غرس مرة أخرى في تجويف الفم.
6. ادفع محتوى الحقنة ببطء لأكثر من 5 دقائق بمعدل 100 ميكرولتر/دقيقة. يقلل معدل التسريب البطيء هذا من خطر الإصابة بالقنوات بسبب الزيادة المفاجئة في الضغط داخل القناة.
7. اترك PET10 في مكانه لمدة 5 دقائق على الأقل بعد اكتمال التسريب. الحفاظ على القناة مختومة والسماح للغرس للبقاء في الغدة السباتية.
8. إزالة PET10 مع الجر لطيف. سيانواكريلات سوف تسحب مجانا مع الأنبوب.
9. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.8 على الجانب الآخر.
10. الإفراج ببطء عن طريق الفم بعد أن غرست كل من parotids وإزالة كل من أنابيب PET10.
    ملاحظة: يجب أن يستغرق الإجراء بأكمله لكلا الجانبين أقل من 30 دقيقة.

4. الرعاية بعد الإجراءات

1. بعد اكتمال التسريب وإزالة القناة ستينسن، مراقبة الحيوانات حتى تأثير التخدير يزول (عادة بين 20-30 دقيقة بعد العملية).
2. تقديم المشروبات الحيوانية ومن ثم الطعام بعد أن تكون مستيقظا تماما واستئناف الرعاية الروتينية.

النتائج

إجراء ناجح، ونقل ونسخ
يظهر الشكل 1 الحليمة الباروتية المجاورة للضرس^الثاني على الخد العلوي الخلفي. تظهر الصورة أيضا الموضع الصحيح لتقويم الفم ، ونهاية مطاطية واحدة على الحنك الصلب والنهاية المطاطية الأخرى على ال ipsilateral. يظهر الشكل 2 صورة تم ...

Discussion

هنا نصف بروتوكول التسريب إلى الوراء في الغدة السباتية من خلال قناة ستينسن. تقدم المنهجية الموصوفة إرشادات يمكن استخدامها من قبل الباحثين الذين يستكشفون فائدة الأنسجة اللعابية كموقع للعلاج الجيني والتطبيقات الأخرى.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان نجاح الإجراء. أولا و...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates