Vektörlü Gen Teslimatı için İnsan Olmayan Bir Primatta Stensen Kanalı aracılığıyla Retrograd Parotid Bezi İnfüzyonu

Özet

Tükürük bezleri, özellikle gen transferi ile aşılama alanında gen tedavisi için doku hedef bölgesi olarak önerilmiştir. Retrograd parotis infüzyonu kullanarak insan olmayan bir primat modelinde gen iletimi gösteriyoruz.

Özet

Tükürük bezleri gen tedavisi için çekici bir doku hedefidir ve umut verici sonuçlar zaten insan deneylerine yol açıpmaktadır. Doğal olarak kan dolaşımına protein salgılayabilirler ve kolayca erişilebilirler, bu da onları gen transferi ile hormon üretimi veya aşılanması için potansiyel olarak üstün doku bölgeleri haline getirir. Gen iletimi için önerilen yöntemler arasında transkütan enjeksiyon ve tükürük kanalları yoluyla retrograd infüzyon bulunur. İnsan olmayan primatlarda Retrograd Tükürük Bezi İnfüzyonunun (RSGI) nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Temel diş aletleri, polietilen boru ve siyanoakrilat kullanarak Stensen Kanalı'nı kanüle etmek ve sızdırmaz hale getirebilir atraumatik bir yöntem olan parotis papillanın tanımlanması ve uygun infüzyon oranı da dahil olmak üzere önemli anatomik simgesel yapıları açıklıyoruz. Bu en az travmatik doğum yöntemi olmakla birlikte, yöntem hala teslim edilebilen hacim (<0,5 mL) ve kanal ve bezde travma potansiyeli ile sınırlıdır. Floroskopi kullanarak bir infüzyonun beze tam olarak teslim edilebileceğini gösteriyoruz ve immünhistokimya ile tipik bir vektörün transdüksiyonunun ve verilen genin ekspresyonunun daha da gösterileceğini gösteriyoruz.

Giriş

Tükürük bezleri tükürük ekzokrin üretimi ile iyi bilinirken, araştırmacılar proteinleri doğrudan kan dolaşımına salgılama yeteneklerini uzun zamandır fark etmişlerdir 1 , bu da onları yedek hormonlar veya antikor üretimi gibi sistemik uygulama için gen tedavisi için potansiyel bir hedef^halinegetirmektedir. Aslında, tükürük bezleri, salgı için protein üretme yeteneği (bir özellik kaslarının eksikliği), vektör difüzyonunu sınırlandırabilen ağır kapsülleme ve entegre olmayan vektörler için stabilite sağlayan iyi ayırt edilmiş doku gibi diğer doku hedeflerine göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, ciddi bir olumsuz olay durumunda, tükürük bezleri yaşam için kritik değildir ve cerrahi olarak çıkarılabilir. Hemen sezgisel olmasa da, parotis bezlerine ana boşaltım kanalı olan Stensen's Duct²aracılığıyla ağızdan kolayca erişilebilir.

Tükürük dokusunun gen tedavisi için avantajları göz önüne alındığında, bu doku hedefini keşfetmeye olan ilgi artmaktadır. Kemirgen, köpek ve insan dışı primat modellerinde çok sayıda çalışma zaten yapıldı ve en az bir insan klinik çalışması devam ediyor^3,4,5. Gen tedavisi amacıyla bu doku hedefinin yararını daha fazla araştırmak ve geliştirmek için daha fazla insan dışı primat çalışması yapılması gerekecektir. Bu makalede, insan olmayan primat modelinde transdüksiyon için vektörel bir gen sunmak için Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezlerine erişmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İnfüzyonun doğumunun ve kanalın beze girerken anatomisinin gözle görülür bir şekilde ortaya konmasını sağlamak için radyokontrast kullanılarak floroskopi yapıldı. Bir vektörün başarılı bir şekilde transdüksiyonunun ortaya konması için Adenovirüs serotip 5 (Ad5) vektörlü egfp geni kullanılmıştır. Ad5 tükürük dokusunu transdükleyebilen iyi tanımlanmış bir vektördür. Nihai klinik kullanım için çok immünojenik olmasına rağmen, verimli transdüksiyon sağlamak için bu gösteri çalışması için bir Ad5 vektörü seçilmiştir. Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein (EGFP) üretiminin değerlendirilmesi, transdüksiyondan sonra vektörel bir genin başarılı transkripsiyonunu ve çevirisini göstermek için iyi tanımlanmış bir yöntemdir ve burada yapılmıştır.

Protokol

Tüm işlemler hayvan çalışmaları için Wake Forest School of Medicine Clarkson Kampüsü'nde gerçekleştirildi. Etik hususlar için Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) danışıldı ve prosedürlerin ayrıntıları incelenmek üzere sunuldu. Wake Forest IACUC çalışma protokolümüzü onayladı ve tüm prosedürler IACUC onaylı protokol #A17-147 kapsamında yapıldı.

1. infüzyon cihazının hazırlanması

1. Bir makas kullanarak 10 Polietilen Tüp (PET10) boyutunu 25 cm uzunluklarda kesin.
2. PET10'u siyah bir işaretleyici kullanarak bir uçtan 1 cm ve 2 cm olarak işaretleyin.
3. 0,5 mL Ad5-EGFP çözeltisini (10⁹ viral parçacık/mL) 1 mL (tüberkülin) şırınna önceden doldurun.
4. PET10 tüpünün işaretlenmemiş ucunun şırıngaya bağlı 29-31 G iğnenin üzerine kaydırın. Bu görevi büyütme altında gerçekleştirmek genellikle daha kolaydır.
5. Boru tamamen dolana kadar çözeltiyi PET10'a demleyin (serbest uçta görünür damla).
6. Cerrahi önlük, uzun kollu gece elbisesi, geçirimsiz eldiven, cerrahi maske, yüz siperliği, saç bonesi ve ayakkabı kılıfları dahil olmak üzere tam standart KKD kullanın.

2. Hayvanın hazırlanması

NOT: Video gösterimi için cynomolgus makaklar kullanılmıştır. Diğer insan olmayan ve insan primatların anatomisi çok benzerdir ve protokol diğer türlere çevrilebilir olmalıdır.

1. Tükürük salgılarını en aza indirmek ve infüzyonun dağılımını ve tutulmasını optimize etmek için işlemden önce 0,05 mg/kg atropin 15 dk deri altından enjekte edin.
2. İntramüsküler ketamin/midazolam (10-15 mg/kg ketamin ve 0.01-0.05 mg/kg midazolam) ile 5 mL şırıngır kullanarak anestezi sağlayın. Sakinleştirilmiş hayvan bilinçsiz hale geldiğinde ve uyaranlara tepki veremediğinde uygun anesteziyi onaylayın.

3. Prosedürün gerçekleştirilmesi

1. Ağzı açmak için oral retraktörler kullanın.
   1. Retraktörün bir ucunun kauçuk pedini, üst dişlerin arkasındaki sert damağa, aşılanacak bezin karşısındaki ağzın kenarına yerleştirin. Diğer ucun kauçuk pedini alt köpek üzerine üst retraktörle aynı tarafa yerleştirin. Retraktörün yay eyleminin ağzı genişletmesine ve açmasına yavaşça izin verin.
2. Parotis papillayı, Stensen Kanalı'nın açılmasını, arka yanakta, üst 2^nd azı dişine bitişik olarak tanımlayın. Bu en iyi büyütme için diş döngüleri kullanılarak görselleştirilir.
3. Parotis papillayı konik dilatör noktasıyla hafifçe genişletin. Dilatörün noktasını papillanın ortasına veya açıklığına yerleştirmek ve ardından hafifçe ileri geri döndürmek en iyisidir. Nokta yavaşça papillaya girmeli ve yaklaşık 20 - 30 sn hafif döndürme üzerinde genişletilmelidir.
4. PET10 boruyu genişlemiş parotis papillaya yerleştirin. Bu, PET10 tüpünün işaretli ucunu distal ucundan yaklaşık 0,5 cm cımbızla tutarak ve tüpün ucunu genişlemiş papillaya hafifçe yerleştirerek elde edilir.
   1. Tüpün kaymasına yardımcı olmak için genellikle küçük dönen hareketlerle kolaylaştırılan tüpü hafifçe ilerletin, ardından cımbızın önceki kavramaya 0,5 cm proksimal olarak yeniden doğrulanması. 2 cm işareti parotis papillaya ulaşana kadar bunu tekrarlayın.
5. Papilla ve eklenen tüpün etrafındaki yanağa siyanoakrilat uygulayın ve kurumasını bekleyin (belirli bir miktar kaydedilmedi, sadece Stensen'in kanal papillasının girişini mühürlemek için yeterli). Bu genellikle bir dakikadan az sürer ve parotis papillanın sızdırmazlığına ve ağız boşluğuna geri infüze dökülmesini azaltmaya yardımcı olur.
6. Şırınd içeriğini 100 μL/dk hızında 5 dakikadan fazla yavaşça itin. Bu yavaş infüzyon oranı, kanal içi basınçtaki ani artış nedeniyle kanal yaralanması riskini en aza indirir.
7. pet10 infüzyon tamamlandıktan sonra en az 5 dakika yerinde bırakın. Kanalı kapalı tutun ve infüzyonun parotis bezinde kalmasına izin verin.
8. PET10'ı hafif çekiş gücüyle çıkarın. Siyanoakrilat tüple serbest kalacak.
9. Karşı tarafta 3.2 ile 3.8 arasında olan adımları yineleyin.
10. Her iki parotis aşılandıktan ve her iki PET10 tüpü çıkarıldıktan sonra yavaşça oral retraktörleri serbest bırakın.
    NOT: Her iki taraf için de tüm prosedür 30 dakikadan az sürmelidir.

4. Prosedür sonrası bakım

1. infüzyon tamamlandıktan ve Stensen'in kanalı dekannüle edildikten sonra, anestezi etkisi geçene kadar hayvanları gözlemleyin (genellikle işlem sonrası 20-30 dakika arasında).
2. Hayvan içeceklerini ve daha sonra tamamen uyandıktan sonra yiyecek sunun ve rutin bakıma devam edin.

Sonuçlar

Başarılı prosedür, transdüksiyon ve transkripsiyon
Şekil 1, arka üst yanak üzerindeki 2^nd azı dişine bitişik parotis papillayı gösterir. Görüntü ayrıca ağız ayracı, bir lastik ucu sert damakta ve diğer lastik ucun ipsilateral köpek üzerinde doğru yerleşimini gösterir. Şekil 2, PAROTID papillanın PET10'daki 2 cm işaretinde başarılı bir şekilde canülasyonundan sonra çekilen bir görüntüyü göster...

Tartışmalar

Burada, Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezine retrograd infüzyon protokolünü açıklıyoruz. Açıklanan metodoloji, gen tedavisi ve diğer uygulamalar için bir alan olarak tükürük dokusunun yararını araştıran araştırmacılar tarafından potansiyel olarak kullanılabilecek rehberlik sunmaktadır.

Yordamın başarısını sağlamak için birden çok kritik adım vardır. Her şeyden önce, tüm prosedür adımları nazikçe tamamlanmalıdır. Ağzın güçlü bir şekilde...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates