Infusão de glândula parotóide retrógrada através do duto de Stensen em um primata não humano para entrega de genes vetoriados

Resumo

As glândulas salivares têm sido propostas como um local alvo tecidual para a terapia genética, especialmente na área de vacinação por transferência genética. Demonstramos a entrega de genes em um modelo de primata não humano utilizando infusão parotída retrógrada.

Resumo

As glândulas salivares são um alvo atraente para a terapia genética com resultados promissores já levando a testes em humanos. Eles são inerentemente capazes de segregar proteínas na corrente sanguínea e são facilmente acessíveis, tornando-os locais de tecido potencialmente superior para a produção de hormônios de reposição ou vacinação por transferência genética. Os métodos sugeridos para a entrega de genes incluem injeção transcutânea e infusão retrógrada através de dutos salivares. Demonstramos como realizar a Infusão de GlândulaS Salivares Retrógradas (RSGI) em primatas não humanos. Descrevemos os importantes marcos anatômicos, incluindo a identificação da papila parótida, um método atrauático de cânulação e vedação do Duto de Stensen utilizando ferramentas básicas dentárias, tubos de polietileno e cianoacrilato, e a taxa apropriada de infusão. Embora este seja o método menos traumático de entrega, o método ainda é limitado pelo volume capaz de ser entregue (<0,5 mL) e o potencial de trauma no duto e na glândula. Demonstramos usando fluoroscopia que um infusor pode ser totalmente entregue na glândula, e demonstramos ainda pela imunohistoquímica a transdução de um vetor típico e expressão do gene entregue.

Introdução

Embora as glândulas salivares sejam bem conhecidas por sua produção exócrina de saliva, os pesquisadores há muito reconhecem sua capacidade de segregar proteínas diretamente na corrente sanguínea¹, tornando-as um alvo potencial para a terapia genética para administração sistêmica, como hormônios de reposição ou produção de anticorpos. De fato, as glândulas salivares oferecem várias vantagens sobre outros alvos teciduais, como a capacidade inerente de produzir proteínas para secreção (falta de músculos de propriedade), encapsulamento pesado que pode limitar a difusão vetorial e tecido bem diferenciado que proporciona estabilidade para vetores não integradores. Além disso, no caso de um evento adverso grave, as glândulas salivares não são críticas para a vida e podem ser removidas cirurgicamente. Embora não seja imediatamente intuitiva, as glândulas parótida também são facilmente acessíveis da boca através de seu principal ducto excretório, o Ducto²de Stensen .

Dadas as vantagens do tecido salivar para a terapia genética, há um interesse crescente em explorar esse alvo tecidual. Inúmeros estudos já foram realizados em modelos de primatas roedores, caninos e não humanos e pelo menos um ensaio clínico humano está em andamento^3,4,5. Para explorar e desenvolver ainda mais a utilidade desse alvo tecidual para fins de terapia genética, mais estudos de primatas não humanos precisarão ser realizados. Este artigo descreve um método para acessar as glândulas parótidas através do Ducto de Stensen para fornecer um gene vetorial para transdução no modelo de primata não humano. Para demonstrar visivelmente a entrega do infundido e a anatomia do duto ao entrar na glândula, foi realizada fluoroscopia por radiocontrato. Para demonstrar a transdução bem sucedida de um vetor, foi utilizado um sorotipo Adenovírus 5 (Ad5) vetored gene egfp. O Ad5 é um vetor bem descrito capaz de transduir tecido salivar. Embora seja muito imunogênico para o uso clínico final, um vetor Ad5 foi escolhido para este estudo de demonstração para garantir uma transdução eficiente. Avaliar a produção de Proteína Fluorescente Verde Aprimorada (EGFP) é um método bem descrito para demonstrar transcrição e tradução bem-sucedidas de um gene vetorial após a transdução e foi feito aqui.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados na Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus para estudos em animais. O Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) foi consultado para considerações éticas e detalhes dos procedimentos foram submetidos à revisão. A Wake Forest IACUC aprovou nosso protocolo de estudo e todos os procedimentos foram feitos sob o protocolo aprovado pela IACUC #A17-147.

1. Preparando o dispositivo de infusão

1. Corte tamanho 10 Tubo de polietileno (PET10) em comprimentos de 25 cm usando um par de tesouras.
2. Marque PET10 a 1 cm e 2 cm de uma extremidade usando um marcador preto.
3. Prefill 0,5 mL de solução Ad5-EGFP (10⁹ partículas virais/mL) em uma seringa de 1 mL (tuberculina).
4. Deslize a extremidade não marcada do tubo PET10 sobre a agulha de 29-31 G presa a uma seringa. Geralmente é mais fácil realizar essa tarefa sob ampliação.
5. Infunda a solução no PET10 até que o tubo esteja completamente cheio (gota visível na extremidade livre).
6. Use EPI padrão completo, incluindo esfoliações cirúrgicas, vestido de manga comprida, luvas impermeáveis, máscara cirúrgica, escudo facial, capô de cabelo e tampas de sapato.

2. Preparando o animal

NOTA: Macaques cynomolgus foram usados para a demonstração de vídeo. A anatomia de outros primatas não humanos e humanos é muito semelhante, e o protocolo deve ser traduzível para outras espécies.

1. Injete subcutâneamente 0,05 mg/kg de atropina 15 min antes do procedimento para minimizar secreções salivares e otimizar a distribuição e retenção do infusor.
2. Forneça anestesia utilizando seringas de 5 mL com cetamina intramuscular/midazolam (10-15 mg/kg de cetamina e 0,01-0,05 mg/kg de midazolam). Confirme a anestesia adequada quando o animal sedado ficar inconsciente e não conseguir reagir a estímulos.

3. Realização do procedimento

1. Use retráteis orais para preparar a boca aberta.
   1. Coloque a almofada de borracha de uma extremidade do retrátil no paladar duro atrás dos dentes superiores na lateral da boca em frente à glândula que será infundida. Coloque a almofada de borracha da outra extremidade no canino inferior no mesmo lado do retrátil superior. Deixe suavemente a ação de mola do retrátil para expandir e abrir a boca.
2. Identifique a papila parotída, a abertura do Ducto de Stensen, na bochecha posterior, adjacente ao^2º molar superior. Este é melhor visualizado usando laços dentários para ampliação.
3. Dilate suavemente a papila parótida com o ponto do dilatador cônico. É melhor colocar o ponto do dilatador no centro ou abertura da papila e, em seguida, girar suavemente para frente e para trás. O ponto deve entrar lentamente na papila e dilatar-na ao longo de aproximadamente 20 - 30 s de rotação suave.
4. Insira a tubulação PET10 na papila parótida dilatada. Isso é melhor conseguido segurando a extremidade marcada do tubo PET10 com pinças aproximadamente 0,5 cm da extremidade distal e inserindo suavemente a ponta do tubo na papila dilatada.
   1. Avance suavemente o tubo, que muitas vezes é facilitado por pequenos movimentos rotativos para ajudar o tubo a deslizar, seguido de reajuste da pinça de 0,5 cm proximal para a aderência anterior. Repita isso até que a marca de 2 cm atinja a papila parótida.
5. Aplique cianoacrilato na bochecha ao redor da papila e do tubo inserido e espere que ele seque (nenhuma quantidade específica registrada, apenas o suficiente para selar a entrada da papila ducta de Stensen). Isso normalmente leva menos de um minuto e ajuda a selar a papila parótida e reduzir o derramamento de infusão de volta na cavidade oral.
6. Empurre lentamente o teor de seringa por mais de 5 min a uma taxa de 100 μL/min. Esta lenta taxa de infusão minimiza o risco de lesão do ducto devido ao aumento repentino da pressão intra-ductal.
7. Deixe PET10 no lugar por pelo menos 5 minutos após a infusão estiver completa. Mantenha o duto selado e deixe que o infusor permaneça na glândula parótida.
8. Remova PET10 com tração suave. O cianoacrilato se soltará com o tubo.
9. Repita as etapas 3.2 até 3.8 no lado oposto.
10. Solte lentamente os retráteis orais depois que ambos os parotídeos foram infundidos e ambos os tubos PET10 removidos.
    NOTA: Todo o procedimento para ambos os lados deve levar menos de 30 minutos.

4. Cuidados pós-processuais

1. Após a infusão ser concluída e o duto de Stensen descanalizado, observe os animais até que o efeito anestesia desapaixe (geralmente entre 20-30 min pós-procedimento).
2. Ofereça as bebidas animais e depois a comida depois que eles estiverem totalmente acordados e retome os cuidados de rotina.

Resultados

Procedimento bem sucedido, transdução e transcrição
A Figura 1 mostra a papila parótida adjacente ao 2º molar na bochecha superior posterior. A imagem também mostra a colocação correta da cinta bucal, uma extremidade de borracha no paladar duro e a outra ponta de borracha no canino ipsilateral. A Figura 2 mostra uma imagem tirada após a canulação bem sucedida da papila parotíide na marca de 2 cm no PET10.

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo de infusão retrógrada na glândula parótida através do Duto de Stensen. A metodologia descrita oferece orientações que podem ser potencialmente utilizadas por pesquisadores que exploram a utilidade do tecido salivar como local para terapia genética e outras aplicações.

Existem várias etapas críticas para garantir o sucesso do procedimento. Em primeiro lugar, todas as etapas processuais devem ser concluídas suavemente. O forte aumento da boca pode resul...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates