Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Résumé

Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.

Résumé

Les glandes salivaires sont une cible tissulaire attrayante pour la thérapie génique avec des résultats prometteurs menant déjà à des essais sur l’homme. Ils sont intrinsèquement capables de sécrétion de protéines dans la circulation sanguine et sont facilement accessibles, ce qui en fait des sites tissulaires potentiellement supérieurs pour la production d’hormones de remplacement ou la vaccination par transfert de gènes. Les méthodes suggérées pour l’administration de gènes comprennent l’injection transcutanée et la perfusion rétrograde par les canaux salivaires. Nous démontrons comment effectuer une perfusion rétrograde de glandes salivaires (RSGI) chez des primates non humains. Nous décrivons les points de repère anatomiques importants, y compris l’identification de la papille parotide, une méthode atraumatique de canulation et de scellement du conduit de Stensen à l’aide d’outils dentaires de base, de tubes en polyéthylène et de cyanoacrylate, et le taux de perfusion approprié. Bien qu’il s’agisse de la méthode d’accouchement la moins traumatisante, la méthode est encore limitée par le volume pouvant être délivré (<0,5 mL) et le risque de traumatisme du canal et de la glande. Nous démontrons par fluoroscopie qu’un infusate peut être entièrement délivré dans la glande, et démontrons en outre par immunohistochimie la transduction d’un vecteur typique et l’expression du gène délivré.

Introduction

Alors que les glandes salivaires sont bien connues pour leur production exocrine de salive, les chercheurs ont depuis longtemps reconnu leur capacité à sécrétionner des protéines directement dans la circulation sanguine^1,ce qui en fait une cible potentielle pour la thérapie génique pour l’administration systémique, comme les hormones de remplacement ou la production d’anticorps. En fait, les glandes salivaires offrent plusieurs avantages par rapport à d’autres cibles tissulaires, tels que la capacité inhérente à produire des protéines pour la sécrétion (une propriété qui manque aux muscles), une encapsulation lourde qui peut limiter la diffusion des vecteurs et des tissus bien différenciés assurant la stabilité des vecteurs non intégrateurs. De plus, en cas d’événement indésirable grave, les glandes salivaires ne sont pas critiques pour la vie et peuvent être enlevées chirurgicalement. Bien qu’elles ne soient pas immédiatement intuitives, les glandes parotides sont également facilement accessibles depuis la bouche par leur principal canal excréteur, le canal²de Stensen.

Compte tenu des avantages du tissu salivaire pour la thérapie génique, il y a un intérêt croissant pour l’exploration de cette cible tissulaire. De nombreuses études ont déjà été réalisées sur des modèles de primates rongeurs, canins et non humains et au moins un essai clinique humain est en cours^3,4,5. Pour explorer et développer davantage l’utilité de cette cible tissulaire à des fins de thérapie génique, d’autres études sur les primates non humains devront être effectuées. Cet article décrit une méthode d’accès aux glandes parotides par le canal de Stensen pour délivrer un gène vectoriel de transduction dans le modèle de primate non humain. Pour démontrer visiblement l’administration de l’infusate et l’anatomie du canal lorsqu’il pénètre dans la glande, une fluoroscopie à l’aide d’un radiocontraste a été effectuée. Pour démontrer la transduction réussie d’un vecteur, un gène egfp vectoriel adénovirus de sérotype 5 (Ad5) a été utilisé. Ad5 est un vecteur bien décrit capable de transduire le tissu salivaire. Bien qu’il soit trop immunogène pour une utilisation clinique finale, un vecteur Ad5 a été choisi pour cette étude de démonstration afin d’assurer une transduction efficace. L’évaluation de la production de protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) est une méthode bien décrite pour démontrer la transcription et la traduction réussies d’un gène vectoriel après la transduction et a été réalisée ici.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées à la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus pour des études animales. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) a été consulté pour des considérations éthiques et les détails des procédures ont été soumis pour examen. Wake Forest IACUC a approuvé notre protocole d’étude et toutes les procédures ont été effectuées en vertu du protocole approuvé par l’IACUC #A17-147.

1. Préparation du dispositif de perfusion

1. Coupez le tube en polyéthylène de taille 10 (PET10) en longueurs de 25 cm à l’aide d’une paire de ciseaux.
2. Marquez PET10 à 1 cm et 2 cm d’une extrémité à l’aide d’un marqueur noir.
3. Préremplir 0,5 mL de solution Ad5-EGFP (10⁹ particules virales/mL) dans une seringue de 1 mL (tuberculine).
4. Faire glisser l’extrémité non marquée du tube PET10 sur une aiguille de 29-31 G attachée à une seringue. Il est généralement plus facile d’effectuer cette tâche sous grossissement.
5. Infuser la solution dans le PET10 jusqu’à ce que le tube soit complètement plein (goutte visible à l’extrémité libre).
6. Utilisez un EPI standard complet, y compris des gommages chirurgicaux, une blouse à manches longues, des gants imperméables, un masque chirurgical, un écran facial, un bonnet de cheveux et des couvre-chaussures.

2. Préparation de l’animal

REMARQUE: Les macaques Cynomolgus ont été utilisés pour la démonstration vidéo. L’anatomie d’autres primates non humains et humains est très similaire, et le protocole devrait être traduisible à d’autres espèces.

1. Injecter par voie sous-cutanée 0,05 mg/kg d’atropine 15 min avant la procédure afin de minimiser les sécrétions salivaires et d’optimiser la distribution et la rétention de l’infusate.
2. Fournir une anesthésie à l’aide de seringues de 5 mL avec de la kétamine/midazolam intramusculaire (10-15 mg/kg de kétamine et 0,01-0,05 mg/kg de midazolam). Confirmez une anesthésie appropriée lorsque l’animal sous sédated devient inconscient et est incapable de réagir aux stimuli.

3. Exécution de la procédure

1. Utilisez des rétracteurs oraux pour ouvrir la bouche.
   1. Placez le tampon en caoutchouc d’une extrémité de l’enrouleur sur le palais dur derrière les dents supérieures du côté de la bouche opposé à la glande qui sera infusée. Placez le tampon en caoutchouc de l’autre extrémité sur la canine inférieure du même côté que le rétracteur supérieur. Laissez doucement l’action du ressort de l’enrouleur se dilater et ouvrir la bouche.
2. Identifiez la papille parotide, l’ouverture du canal de Stensen, sur la joue postérieure, adjacente à la 2^e molaire supérieure. Ceci est mieux visualisé en utilisant des boucles dentaires pour le grossissement.
3. Dilater doucement la papille parotide avec la pointe du dilatateur conique. Il est préférable de placer le point du dilatateur au centre ou à l’ouverture de la papille, puis de le faire pivoter doucement d’avant en arrière. Le point doit entrer lentement dans la papille et la dilater sur environ 20 à 30 s de rotation douce.
4. Insérez le tube PET10 dans la papille parotide dilatée. Ceci est mieux réalisé en maintenant l’extrémité marquée du tube PET10 avec une pince à épiler à environ 0,5 cm de l’extrémité distale et en insérant doucement la pointe du tube dans la papille dilatée.
   1. Avancez doucement le tube, ce qui est souvent facilité par de petits mouvements de rotation pour aider le tube à glisser, suivis d’un réajustement de la pince à épile de 0,5 cm proximal à la poignée précédente. Répétez cette opération jusqu’à ce que la marque de 2 cm atteigne la papille parotide.
5. Appliquez du cyanoacrylate sur la joue autour de la papille et du tube inséré et attendez qu’il sèche (aucune quantité spécifique enregistrée, juste assez pour sceller l’entrée de la papille du canal de Stensen). Cela prend généralement moins d’une minute et aide à sceller la papille parotide et à réduire le déversement d’infusate dans la cavité buccale.
6. Poussez lentement le contenu de la seringue sur 5 min à une vitesse de 100 μL/min. Ce débit de perfusion lent minimise le risque de lésion des conduits en raison de l’augmentation soudaine de la pression intra-canalaire.
7. Laissez pet10 en place pendant au moins 5 minutes après la fin de la perfusion. Gardez le conduit scellé et laissez l’infusate rester dans la glande parotide.
8. Retirez le PET10 avec une traction douce. Le cyanoacrylate se libérera avec le tube.
9. Répétez les étapes 3.2 à 3.8 du côté opposé.
10. Libérez lentement les rétracteurs oraux après l’infusation des deux parotides et l’enlèvement des deux tubes en PET10.
    REMARQUE: L’ensemble de la procédure pour les deux côtés devrait prendre moins de 30 minutes.

4. Soins post-procéduraux

1. Une fois la perfusion terminée et le canal de Stensen décannulé, observez les animaux jusqu’à ce que l’effet d’anesthésie s’estompe (généralement entre 20 et 30 minutes après la procédure).
2. Offrez aux animaux des boissons, puis de la nourriture après qu’ils soient complètement éveillés et reprenez les soins de routine.

Résultats

Procédure, transduction et transcription réussies
La figure 1 montre la papille parotide adjacente à la 2 e molaire sur la joue supérieure^{postérieure.} L’image montre également l’emplacement correct de l’attelle buccale, une extrémité en caoutchouc sur le palais dur et l’autre extrémité en caoutchouc sur la canine ipsilatérale. La figure 2 montre une image prise après une canulation réussie de la papille parotid...

Discussion

Nous décrivons ici un protocole d’infusion rétrograde dans la glande parotide à travers le canal de Stensen. La méthodologie décrite offre des conseils qui peuvent potentiellement être utilisés par les chercheurs qui explorent l’utilité du tissu salivaire en tant que site pour la thérapie génique et d’autres applications.

Il existe plusieurs étapes critiques pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, toutes les étapes de la procédure doivent être complétées...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates