Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali

Riepilogo

Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell'area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l'infusione retrograda di parotidi.

Abstract

Le ghiandole salivari sono un bersaglio tissutale attraente per la terapia genica con risultati promettenti che già portano a studi sull'uomo. Sono intrinsecamente in grado di secernere proteine nel flusso sanguigno e sono facilmente accessibili, rendendoli siti tissutali potenzialmente superiori per la produzione di ormoni sostitutivi o la vaccinazione mediante trasferimento genico. I metodi suggeriti per la somministrazione genica includono l'iniezione transcutanea e l'infusione retrograda attraverso i dotti salivari. Dimostriamo come eseguire l'infusione retrograda delle ghiandole salivari (RSGI) in primati non umani. Descriviamo gli importanti punti di riferimento anatomici tra cui l'identificazione della papilla parotide, un metodo atraumatico di cannulazione e sigillatura del dotto di Stensen utilizzando strumenti dentali di base, tubi in polietilene e cianoacrilato e la velocità appropriata di infusione. Mentre questo è il metodo di consegna meno traumatico, il metodo è ancora limitato dal volume in grado di essere consegnato (<0,5 ml) e dal potenziale trauma al dotto e alla ghiandola. Dimostriamo usando la fluoroscopia che un infusato può essere completamente consegnato nella ghiandola e dimostriamo ulteriormente con l'immunoistochimica la trasduzione di un vettore tipico e l'espressione del gene consegnato.

Introduzione

Mentre le ghiandole salivari sono ben note per la loro produzione esocrina di saliva, i ricercatori hanno da tempo riconosciuto la loro capacità di secernere proteine direttamente nel flusso sanguigno¹, rendendole un potenziale bersaglio per la terapia genica per la somministrazione sistemica, come ormoni sostitutivi o produzione di anticorpi. In effetti, le ghiandole salivari offrono diversi vantaggi rispetto ad altri bersagli tissutali, come la capacità intrinseca di produrre proteine per la secrezione (una proprietà che manca ai muscoli), l'incapsulamento pesante che può limitare la diffusione del vettore e il tessuto ben differenziato che f....

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite presso la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus per gli studi sugli animali. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) è stato consultato per considerazioni etiche e i dettagli delle procedure sono stati sottoposti a revisione. Wake Forest IACUC ha approvato il nostro protocollo di studio e tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato IACUC #A17-147.

1. Preparazione del dispositivo per infusione

1. Tagliare il tubo di polietilene taglia 10 (PET10) in lunghezze di 25 cm utilizzando un paio di forbici.
2. Contrassegna PET10 a 1 cm....

Risultati

Procedura, trasduzione e trascrizione di successo
La Figura 1 mostra la papilla parotide adiacente al 2^° molare sulla guancia superiore posteriore. L'immagine mostra anche il corretto posizionamento del tutore della bocca, un'estremità di gomma sul palato duro e l'altra estremità di gomma sul cane ipsilaterale. La Figura 2 mostra un'immagine scattata dopo il successo della cannulazione della papilla parotide al segno di 2 cm sul.......

Discussione

Qui descriviamo un protocollo di infusione retrograda nella ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen. La metodologia descritta offre una guida che può potenzialmente essere utilizzata dai ricercatori che esplorano l'utilità del tessuto salivare come sito per la terapia genica e altre applicazioni.

Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo della procedura. Innanzitutto, tutte le fasi procedurali dovrebbero essere completate delicatamente. Un rinforzo forzato della bo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates