Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali

Riepilogo

Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell'area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l'infusione retrograda di parotidi.

Abstract

Le ghiandole salivari sono un bersaglio tissutale attraente per la terapia genica con risultati promettenti che già portano a studi sull'uomo. Sono intrinsecamente in grado di secernere proteine nel flusso sanguigno e sono facilmente accessibili, rendendoli siti tissutali potenzialmente superiori per la produzione di ormoni sostitutivi o la vaccinazione mediante trasferimento genico. I metodi suggeriti per la somministrazione genica includono l'iniezione transcutanea e l'infusione retrograda attraverso i dotti salivari. Dimostriamo come eseguire l'infusione retrograda delle ghiandole salivari (RSGI) in primati non umani. Descriviamo gli importanti punti di riferimento anatomici tra cui l'identificazione della papilla parotide, un metodo atraumatico di cannulazione e sigillatura del dotto di Stensen utilizzando strumenti dentali di base, tubi in polietilene e cianoacrilato e la velocità appropriata di infusione. Mentre questo è il metodo di consegna meno traumatico, il metodo è ancora limitato dal volume in grado di essere consegnato (<0,5 ml) e dal potenziale trauma al dotto e alla ghiandola. Dimostriamo usando la fluoroscopia che un infusato può essere completamente consegnato nella ghiandola e dimostriamo ulteriormente con l'immunoistochimica la trasduzione di un vettore tipico e l'espressione del gene consegnato.

Introduzione

Mentre le ghiandole salivari sono ben note per la loro produzione esocrina di saliva, i ricercatori hanno da tempo riconosciuto la loro capacità di secernere proteine direttamente nel flusso sanguigno¹, rendendole un potenziale bersaglio per la terapia genica per la somministrazione sistemica, come ormoni sostitutivi o produzione di anticorpi. In effetti, le ghiandole salivari offrono diversi vantaggi rispetto ad altri bersagli tissutali, come la capacità intrinseca di produrre proteine per la secrezione (una proprietà che manca ai muscoli), l'incapsulamento pesante che può limitare la diffusione del vettore e il tessuto ben differenziato che fornisce stabilità per i vettori non integranti. Inoltre, in caso di evento avverso grave, le ghiandole salivari non sono critiche per la vita e possono essere rimosse chirurgicamente. Sebbene non siano immediatamente intuitive, le ghiandole parotidi sono anche facilmente accessibili dalla bocca attraverso il loro principale dotto escretore, il dotto di Stensen².

Dati i vantaggi del tessuto salivare per la terapia genica, c'è un crescente interesse nell'esplorare questo bersaglio tissutale. Numerosi studi sono già stati condotti in modelli di primati roditori, canini e non umani e almeno uno studio clinico umano è in corso^3,4,5. Per esplorare ulteriormente e sviluppare l'utilità di questo bersaglio tissutale ai fini della terapia genica, saranno necessari ulteriori studi sui primati non umani. Questo articolo descrive un metodo per accedere alle ghiandole parotidi attraverso il dotto di Stensen per fornire un gene vettoriale per la trasduzione nel modello di primate non umano. Per dimostrare visibilmente la consegna dell'infuso e l'anatomia del dotto quando entra nella ghiandola, è stata eseguita la fluoroscopia con radiocontrasto. Per dimostrare la trasduzione riuscita di un vettore, è stato utilizzato un gene egfp vettoriale di sierotipo 5 (Ad5) adenovirus. Ad5 è un vettore ben descritto in grado di trasdurre il tessuto salivare. Sebbene sia troppo immunogenico per l'uso clinico finale, per questo studio dimostrativo è stato scelto un vettore Ad5 per assicurare una trasduzione efficiente. La valutazione della produzione di Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) è un metodo ben descritto per dimostrare il successo della trascrizione e della traduzione di un gene vettoriale dopo la trasduzione ed è stato fatto qui.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite presso la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus per gli studi sugli animali. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) è stato consultato per considerazioni etiche e i dettagli delle procedure sono stati sottoposti a revisione. Wake Forest IACUC ha approvato il nostro protocollo di studio e tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato IACUC #A17-147.

1. Preparazione del dispositivo per infusione

1. Tagliare il tubo di polietilene taglia 10 (PET10) in lunghezze di 25 cm utilizzando un paio di forbici.
2. Contrassegna PET10 a 1 cm e 2 cm da un'estremità utilizzando un pennarello nero.
3. Preriempire 0,5 mL di soluzione di Ad5-EGFP^{(10 9} particelle virali/mL) in una siringa da 1 mL (tubercolina).
4. Far scorrere l'estremità non marcata del tubo PET10 su un ago da 29-31 G attaccato a una siringa. In genere è più facile eseguire questa attività in ingrandimento.
5. Infondere la soluzione nel PET10 fino a quando il tubo non è completamente pieno (goccia visibile all'estremità libera).
6. Utilizzare DPI standard completi, tra cui scrub chirurgici, camice a maniche lunghe, guanti impermeabili, maschera chirurgica, visiera, cofano per capelli e copriscarpe.

2. Preparare l'animale

NOTA: i macachi Cynomolgus sono stati utilizzati per la dimostrazione video. L'anatomia di altri primati non umani e umani è molto simile e il protocollo dovrebbe essere traducibile in altre specie.

1. Iniettare per via sottocutanea 0,05 mg / kg di atropina 15 minuti prima della procedura per ridurre al minimo le secrezioni salivari e ottimizzare la distribuzione e la ritenzione dell'infusato.
2. Fornire anestesia utilizzando siringhe da 5 mL con ketamina intramuscolare / midazolam (10-15 mg / kg di ketamina e 0,01-0,05 mg / kg di midazolam). Confermare la corretta anestesia quando l'animale sedato diventa incosciente e non è in grado di reagire agli stimoli.

3. Esecuzione della procedura

1. Utilizzare divaricatori orali per sostenere la bocca aperta.
   1. Posizionare il cuscinetto di gomma di un'estremità del divaricatore sul palato duro dietro i denti superiori sul lato della bocca opposto alla ghiandola che verrà infusa. Posizionare il cuscinetto di gomma dell'altra estremità sul cane inferiore sullo stesso lato del riavvolgitore superiore. Lasciare delicatamente l'azione a molla del divaricatore per espandere e aprire la bocca.
2. Identificare la papilla parotide, l'apertura del dotto di Stensen, sulla guancia posteriore, adiacente al 2^° molare superiore. Questo è meglio visualizzato utilizzando i loop dentali per l'ingrandimento.
3. Dilatare delicatamente la papilla parotide con la punta del dilatatore conico. È meglio posizionare il punto del dilatatore al centro o l'apertura della papilla e quindi ruotarlo delicatamente avanti e indietro. Il punto dovrebbe entrare lentamente nella papilla e dilatarlo su circa 20 - 30 s di rotazione delicata.
4. Inserire il tubo PET10 nella papilla parotide dilatata. Ciò si ottiene al meglio tenendo l'estremità marcata del tubo PET10 con una pinzetta a circa 0,5 cm dall'estremità distale e inserendo delicatamente la punta del tubo nella papilla dilatata.
   1. Avanzare delicatamente il tubo, che è spesso facilitato da piccoli movimenti rotanti per aiutare il tubo a scorrere, seguito da riregolazione delle pinzette di 0,5 cm prossimali alla presa precedente. Ripeti questo fino a quando il segno di 2 cm raggiunge la papilla parotide.
5. Applicare il cianoacrilato sulla guancia intorno alla papilla e al tubo inserito e attendere che si asciughi (nessuna quantità specifica registrata, quanto basta per sigillare l'ingresso della papilla del dotto di Stensen). Questo in genere richiede meno di un minuto e aiuta a sigillare la papilla parotide e ridurre la fuoriuscita di infuso nella cavità orale.
6. Spingere lentamente il contenuto della siringa oltre 5 minuti ad una velocità di 100 μL/min. Questa lenta velocità di infusione riduce al minimo il rischio di lesioni del dotto a causa di un improvviso aumento della pressione intra-duttale.
7. Lasciare PET10 in posizione per almeno 5 minuti dopo il completamento dell'infusione. Mantenere il condotto sigillato e lasciare che l'infusato rimanga nella ghiandola parotide.
8. Rimuovere PET10 con una trazione delicata. Il cianoacrilato tirerà libero con il tubo.
9. Ripetere i passaggi da 3.2 a 3.8 sul lato opposto.
10. Rilasciare lentamente i riavvolgitori orali dopo che entrambi i parotidi sono stati infusi ed entrambi i tubi PET10 rimossi.
    NOTA: l'intera procedura per entrambe le parti dovrebbe richiedere meno di 30 minuti.

4. Assistenza post-procedurale

1. Dopo che l'infusione è stata completata e il dotto di Stensen è stato decannulato, osservare gli animali fino a quando l'effetto anestesia svanisce (di solito tra 20-30 minuti dopo la procedura).
2. Offri all'animale bevande e poi cibo dopo che sono completamente svegli e riprendono le cure di routine.

Risultati

Procedura, trasduzione e trascrizione di successo
La Figura 1 mostra la papilla parotide adiacente al 2^° molare sulla guancia superiore posteriore. L'immagine mostra anche il corretto posizionamento del tutore della bocca, un'estremità di gomma sul palato duro e l'altra estremità di gomma sul cane ipsilaterale. La Figura 2 mostra un'immagine scattata dopo il successo della cannulazione della papilla parotide al segno di 2 cm sul...

Discussione

Qui descriviamo un protocollo di infusione retrograda nella ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen. La metodologia descritta offre una guida che può potenzialmente essere utilizzata dai ricercatori che esplorano l'utilità del tessuto salivare come sito per la terapia genica e altre applicazioni.

Ci sono diversi passaggi critici per garantire il successo della procedura. Innanzitutto, tutte le fasi procedurali dovrebbero essere completate delicatamente. Un rinforzo forzato della bo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates