עירוי בלוטת פרוטידים מדרדר דרך צינור סטנסן בפרימט לא אנושי לאספקת גנים וקטורית

Summary

בלוטות הרוק הוצעו כאתר יעד לרקמות לטיפול גנטי, במיוחד בתחום החיסון על ידי העברת גנים. אנו מדגימים אספקת גנים במודל פרימטים לא אנושיים המשתמש בעירוי פרוטידים מדרדר.

Abstract

בלוטות הרוק הן יעד רקמות אטרקטיבי לטיפול גנטי עם תוצאות מבטיחות כבר מוביל לניסויים בבני אדם. הם מסוגלים מטבעם להפריש חלבונים למחזור הדם והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם לאתרי רקמות מעולים פוטנציאליים לייצור הורמונים חלופיים או חיסון על ידי העברת גנים. שיטות מוצעות להעברת גנים כוללות הזרקה עורית ועירוי מדרדר דרך צינורות רוק. אנו מדגימים כיצד לבצע עירוי בלוטת הרוק מדרדר (RSGI) בפרימטים שאינם אנושיים. אנו מתארים את ציוני הדרך האנטומיים החשובים כולל זיהוי של הפפילה הפרוטידית, שיטה אטארומטית של שינון ואיטום צינור סטנסן תוך שימוש בכלים דנטליים בסיסיים, צינורות פוליאתילן ו cyanoacrylate, ואת השיעור המתאים של עירוי. אמנם זוהי שיטת המסירה הפחות טראומטית, אך השיטה עדיין מוגבלת על ידי הנפח המסוגלת להימסר (<0.5 מ"ל) והפוטנציאל לטראומה לצינור ובבלוטות. אנו מדגימים באמצעות פלואורוסקופיה כי אינפוזאט יכול להיות מועבר באופן מלא לתוך הבלוטה, ולהדגים עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה את transduction של וקטור טיפוסי ביטוי של הגן נמסר.

Introduction

בעוד בלוטות הרוק ידועים בייצור האקסוקריני שלהם של רוק, חוקרים מזה זמן רב זיהו את יכולתם להפריש חלבונים ישירות למחזור הדם 1 , מה^שהופךאותם למטרה פוטנציאלית לטיפול גנטי לניהול מערכתי, כגון הורמונים חלופיים או ייצור נוגדנים. למעשה, בלוטות הרוק מציעות מספר יתרונות על פני מטרות רקמות אחרות, כגון היכולת הטבועה לייצר חלבונים להפרשה (חסר שרירי רכוש), אנקפסולציה כבדה שיכולה להגביל דיפוזיה וקטורית, ורקמות מובחנות היטב המספקות יציבות לווקטורים שאינם משתלבים. יתר על כן, במקרה של אירוע לוואי חמור, בלוטות הרוק אינן קריטיות לחיים וניתן להסירן בניתוח. אמנם לא אינטואיטיבי מיד, בלוטות פרוטידים נגישים גם מהפה דרך צינור ההפרשה הראשי שלהם, צינור²של סטנסן .

בהתחשב ביתרונות של רקמת הרוק לטיפול גנטי, יש עניין גובר לחקור את יעד הרקמה הזה. מחקרים רבים כבר בוצעו במודלים של מכרסמים, כלבים ופרימטים לא אנושיים ולפחות ניסוי קליני אחד בבני אדם נמצא בעיצומו^3,4,5. כדי להמשיך לחקור ולפתח את התועלת של יעד רקמות זה למטרות ריפוי גנטי, יותר מחקרים פרימטים שאינם אנושיים יצטרכו להתבצע. מאמר זה מתאר שיטה לגישה לבלוטות הפרוטידים דרך צינור סטנסן כדי לספק גן וקטורי להחלפת מודל הפרימטים הלא אנושי. כדי להדגים באופן ניכר את המסירה של infusate ואת האנטומיה של הצינור כפי שהוא נכנס בלוטה, פלואורוסקופיה באמצעות radiocontrast בוצע. כדי להדגים טרנסולציה מוצלחת של וקטור, נעשה שימוש בגן egfp וקטורי של אדנווירוס 5 (Ad5). Ad5 הוא וקטור מתואר היטב המסוגל לבצע חילוף של רקמת רוק. למרות שזה אימונוגני מדי לשימוש קליני אולטימטיבי, וקטור Ad5 נבחר למחקר הדגמה זה כדי להבטיח טרנסולמה יעילה. הערכת ייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) היא שיטה המתוארת היטב כדי להדגים שעתוק ותרגום מוצלחים של גן וקטורי לאחר התמרה ונעשה כאן.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בקמפוס קלרקסון של בית הספר לרפואה ווייק פורסט ללימודי בעלי חיים. הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) התייעצה משיקולים אתיים ופרטי ההליכים הוגשו לעיון. Wake Forest IACUC אישר את פרוטוקול המחקר שלנו וכל ההליכים נעשו תחת פרוטוקול שאושר על ידי IACUC #A17-147.

1. הכנת מכשיר העירוי

1. חותכים את גודל 10 צינור פוליאתילן (PET10) לאורכים של 25 ס"מ באמצעות זוג מספריים.
2. סמן PET10 ב 1 ס"מ ו 2 ס"מ מקצה אחד באמצעות סמן שחור.
3. מילוי מראש 0.5 מ"ל של פתרון Ad5-EGFP (10⁹ חלקיקים ויראליים / מ"ל) לתוך מזרק 1 מ"ל (שחפת).
4. החלק קצה לא מסומן של צינור PET10 מעל מחט 29-31 G מחובר מזרק. בדרך כלל קל יותר לבצע משימה זו תחת הגדלה.
5. להחדיר את הפתרון לתוך PET10 עד הצינור מלא לחלוטין (טיפה גלויה בקצה חופשי).
6. השתמש PPE סטנדרטי מלא, כולל סקראבס כירורגי, שמלה עם שרוולים ארוכים, כפפות בלתי חדירות, מסכה כירורגית, מגן פנים, מצנפת שיער וכיסויי נעליים.

2. הכנת החיה

הערה: מקוק Cynomolgus שימש להדגמת הווידאו. האנטומיה של פרימטים לא אנושיים ואנושיים אחרים דומה מאוד, והפרוטוקול צריך להיות מתורגם למינים אחרים.

1. הזריקו תת עורית 0.05 מ"ג/ק"ג אטרופין 15 דקות לפני ההליך כדי למזער הפרשות רוק ולייעל את ההפצה והשימור של אינפוסאט.
2. ספק הרדמה באמצעות מזרקי 5 מ"ל עם קטמין תוך שרירי / midazolam (10-15 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו 0.01-0.05 מ"ג / קילוגרם של midazolam). אשר הרדמה נאותה כאשר החיה מסוממת הופכת מחוסרת הכרה ואינה מסוגלת להגיב לגירויים.

3. ביצוע ההליך

1. השתמש במשחזרים אוראליים כדי להכין את הפה הפתוח.
   1. מניחים את משטח הגומי של קצה אחד של המפסק על החיך הקשה שמאחורי השיניים העליונות בצד הפה מול הבלוטה כי יהיה חדור. מניחים את משטח הגומי של הקצה השני על הכלב התחתון באותו צד כמו המפסק העליון. אפשר בעדינות לפעולת האביב של המפסק להתרחב ולפתוח את הפה.
2. זהה את הפפילה הפרוטידית, פתח צינור סטנסן, על הלחי האחורית, בסמוך לטוחנת העליונה^{השנייה.} זה הוא הדמיה הטובה ביותר באמצעות לולאות שיניים להגדלה.
3. מרחיבים בעדינות את הפפילה הפרוטידית בנקודה של מרחיב החרוט. עדיף למקם את הנקודה של המפרש למרכז או הפתיחה של הפפילה ולאחר מכן בעדינות לסובב אותו קדימה ואחורה. הנקודה צריכה לאט להיכנס הפפילה ולהרחיב אותו על פני כ 20 - 30 s של סיבוב עדין.
4. הכנס את צינורות PET10 לתוך פפילה פרוטידית המוחלפת. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי החזקת הקצה המסומן של צינור PET10 עם פינצטה כ 0.5 ס"מ מן הקצה דיסטלי בעדינות החדרת קצה הצינור לתוך הפפילה המוגברת.
   1. לקדם בעדינות את הצינור, אשר לעתים קרובות מקל על ידי תנועות סיבוב קטנות כדי לעזור להחליק את הצינור, ואחריו הסתגלות מחדש של פינצטה 0.5 ס"מ קרוב לאחיזה הקודמת. חוזרים על הפעולה עד שסימן 2 ס"מ מגיע לפפילה הפרוטידית.
5. החל ציאנואקרילט על הלחי סביב הפפילה והצינור המוחדר ולחכות שהוא יתייבש (לא נרשמה כמות ספציפית, רק מספיק כדי לאטום את הכניסה של פפילה צינור של סטנסן). זה בדרך כלל לוקח פחות מדקה ומסייע לאטום את הפפילה הפרוטידים ולהפחית שפיכה של infusate בחזרה בחלל הפה.
6. לדחוף לאט את תוכן המזרק מעל 5 דקות בקצב של 100 μL / min. קצב עירוי איטי זה ממזער את הסיכון לפגיעה בצינור עקב עלייה פתאומית בלחץ תוך-צינורי.
7. השאירו PET10 במקום לפחות 5 דקות לאחר עירוי הושלם. שמור את הצינור אטום ולאפשר infusate להישאר בבלוטה פרוטיד.
8. הסר PET10 עם אחיזה עדינה. הציאנואקרילט ישתחרר עם הצינור.
9. חזור על שלבים 3.2 עד 3.8 בצד הנגדי.
10. לשחרר לאט מפסקים אוראלי לאחר שני פרוטידים כבר חדורים ושני צינורות PET10 הוסרו.
    הערה: כל ההליך עבור שני הצדדים צריך לקחת פחות מ 30 דקות.

4. טיפול פוסט-פרוצדורלי

1. לאחר עירוי הושלם ואת הצינור של סטנסן decannulated, להתבונן בבעלי חיים עד אפקט הרדמה פג (בדרך כלל בין 20-30 דקות לאחר ההליך).
2. הצע לבעלי החיים משקאות ולאחר מכן מזון לאחר שהם ערים לחלוטין ולחדש את הטיפול השגרתי.

תוצאות

הליך מוצלח, התמרה ותעתיק
איור 1 מציג את הפאפילה הפרוטידית הצמודה לאוחנת^השנייה על הלחי העליונה האחורית. התמונה מציגה גם את המיקום הנכון של סד הפה, קצה גומי אחד על החיך הקשה ואת קצה הגומי השני על הכלב ipsilateral. איור 2 מציג תמונה שצולמה לאחר שינון ?...

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול של עירוי מדרדר לתוך בלוטת הפרוטיד דרך צינור סטנסן. המתודולוגיה המתוארת מציעה הדרכה שיכולה לשמש חוקרים החוקרים את התועלת של רקמת הרוק כאתר לטיפול גנטי ויישומים אחרים.

ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת ההליך. בראש ובראשונה, יש להשלים בעדינות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates