ベクター化遺伝子導入のための非ヒト霊長類におけるステンセンダクトによる逆行性耳下腺注入

要約

唾液腺は、遺伝子治療の組織標的部位として、特に遺伝子導入によるワクチン接種の領域において提案されている。逆行性の耳下腺注入を利用した非ヒト霊長類モデルにおける遺伝子導入を実証する。

要約

唾液腺は、すでにヒトの試験につながる有望な結果を有する遺伝子治療のための魅力的な組織標的である。彼らは本質的に血流中にタンパク質を分泌することができ、容易にアクセス可能であり、遺伝子導入による置換ホルモン産生またはワクチン接種のための潜在的に優れた組織サイトを作る。遺伝子導入の推奨方法としては、唾液管を介した経皮注射および逆行注入が挙げられる。ヒト以外の霊長類で逆行唾液腺注入(RSGI)を行う方法を実演する。我々は、耳下腺乳頭の同定、基本的な歯科用具、ポリエチレンチューブ、シアノアクリル酸塩を利用したステンセンのダクトをカニューララットおよびシールする無外傷性方法、および適切な注入速度を含む重要な解剖学的ランドマークを記述する。これは最も外傷性の低い送達方法ですが、この方法は、引き渡し可能な体積(<0.5 mL)と、ダクトおよび腺への外傷の可能性によって依然として制限されています。蛍光検査を用いて、蛍光検査を用いて、インフューズトを完全に腺に送達できることを実証し、免疫体系化学によって、典型的なベクターの導入と、送達された遺伝子の発現を更に実証する。

概要

唾液腺は唾液の外分泌産生でよく知られていますが、研究者は長い間、タンパク質を血流¹に直接分泌する能力を認識しており、置換ホルモンや抗体産生などの全身投与のための遺伝子治療の潜在的な標的となっています。実際、唾液腺は、分泌のためのタンパク質を産生する固有の能力(プロパティ筋不足)、ベクター拡散を制限できる重いカプセル化、非統合ベクターの安定性を提供する十分に分化された組織など、他の組織ターゲットに対していくつかの利点を提供します。さらに、重篤な有害事象が発生した場合、唾液腺は生命にとって重要ではなく、外科的に除去することができる。直ちに直ぐには直視できないが、耳下腺は口から主な排泄管、ステンセンのダクト²を通して容易にアクセスできる。

遺伝子治療のための唾液組織の利点を考えると、この組織標的を探索することに関心が高まっている。げっ歯類、イヌ、ヒト以外の霊長類モデルでは既に数多くの研究が行われ、少なくとも1つのヒト臨床試験が^3、4、5で進行中である。遺伝子治療目的のためにこの組織標的の有用性をさらに探求し、開発するためには、より多くの非ヒト霊長類研究が行われる必要がある。本論文では、Stensenのダ....

プロトコル

すべての手順は、動物研究のためにウェイクフォレスト医学部クラークソンキャンパスで行われました。制度的動物管理・使用委員会(IACUC)は倫理的配慮について協議され、手続きの詳細は審査のために提出された。ウェイクフォレストIACUCは、私たちの研究プロトコルを承認し、すべての手順は、IACUC承認プロトコル#A17-147の下で行われました。

1. 輸液装置の準備

1. サイズ10ポリエチレンチューブ(PET10)をハサミで25cmの長さにカット。
2. 黒いマーカーを使用して片端から1 cmと2 cmでPET10をマークします。
3. Ad5-EGFP溶液(10⁹ ウイルス粒子/mL)を1mL(結核)シリンジにプレフィル0.5 mL。
4. 29-31 G針に取り付けられたPET10チューブの無印の端を注射器に取り付けます。一般的に、このタスクは拡大率で実行する方が簡単です。
5. チューブが完全に満杯になるまでPET10に溶液を注入します(フリーエンドで目に見える落下)。
6. 外科用スクラブ、長袖ガウン、不浸透性手袋、外科用マスク、フェイスシールド、ヘアボンネット、靴カバーを含むフルスタンダードPPEを使用してください。

2. 動物の準備

注:サイノ....

結果

成功した手順、伝達および転写
図1 は、後部上頬の2^番目 の大臼歯に隣接する耳下腺乳頭を示す。画像はまた、口のブレースの正しい配置を示しています, 硬口蓋に一方のゴム端とイプシラテラレのイプシラテラの上に他のゴム端. 図2 は、PET10上の2cmマークでの耳蓋乳頭のカヌリン化に成功した後に撮影した画像を示す。

ディスカッション

ここでは、ステンセンのダクトを介して耳下腺への逆行注入のプロトコルについて説明します。説明された方法論は、遺伝子治療やその他のアプリケーションの部位として唾液組織の有用性を探求する研究者によって潜在的に使用することができるガイダンスを提供する。

この手順を成功させるためには、複数の重要な手順があります。まず第一に、すべての手順は穏?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles	Becton Dickinson	328466	fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond)	Various		Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G	Walmart	N/A	Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue)	Ethicon	DNX12	Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-137
Ketamine injectable solution	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator	Surgipro	SPOI-132	Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors	Amazon (DDP)	N/A	Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips	Walmart	N/A	Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10)	Scientific Commodities	BB31695-PE/1	low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener	Amazon (DDP)	B01F3LVJXC	Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers	Amazon (DDP)	N/A	Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Included in plasmid DNA infusates