التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد دون استخدام صانعي التدرج الآلي أو أنظمة تجزئة التدرج.

Abstract

يعد تجزئة الترسبات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز أداة قوية يمكن استخدامها لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد الذي يتم ترجمته بواسطة الريبوسومات ، وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات. في حين أن صانعي التدرج الآلي وأنظمة تجزئة التدرج تستخدم عادة مع هذه التقنية ، فإن هذه الأنظمة باهظة الثمن بشكل عام ويمكن أن تكون باهظة التكلفة للمختبرات التي لديها موارد محدودة أو لا يمكنها تبرير النفقات بسبب حاجتها النادرة أو العرضية لأداء هذه الطريقة لأبحاثها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد ملفات تعريف متعددة الوسائط بشكل متكرر باستخدام المعدات القياسية المتوفرة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية دون أدوات تجزئة متخصصة. علاوة على ذلك ، يتم توفير مقارنة بين الملامح المتعددة التي تم إنشاؤها مع وبدون نظام تجزئة التدرج. تتم مناقشة استراتيجيات لتحسين وإنتاج ملفات تعريف متعددة قابلة للتكرار. يستخدم Saccharomyces cerevisiae ككائن حي نموذجي في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتكييفه بسهولة لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم للعديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا المختلفة.

Introduction

الريبوسومات هي مجمعات البروتين النووي الريبي الضخمة دالتون التي تؤدي العملية الأساسية لترجمة الحمض النووي الريبي المرسال إلى بروتينات. الريبوسومات هي المسؤولة عن تنفيذ تخليق جميع البروتينات داخل الخلية. تتكون الريبوسومات حقيقية النواة من وحدتين فرعيتين معينتين باسم الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة (40S) والوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة (60S) وفقا لمعاملات الترسيب الخاصة بها. تم تعيين الريبوسوم المجمع بالكامل على أنه أحادي 80S. Polysomes هي مجموعات من الريبوسومات التي تعمل في ترجمة جزيء mRNA واحد. تجزئة الجزيئات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج بكثافة السكروز هي طريقة قوية تستخدم لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد المرتبط بترجمة الريبوسومات وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات¹،²،³،⁴،⁵،⁶،⁷،^8،9،¹⁰،^{11،12 ، 13}. غالبا ما تستخدم هذه التقنية لفصل البوليسومات عن الريبوسومات المفردة والوحدات الفرعية الريبوسومية وجزيئات البروتين النووي الريبي الرسول. يمكن أن توفر الملامح التي تم الحصول عليها من التجزئة معلومات قيمة فيما يتعلق بنشاط ترجمة البوليسومات¹⁴ وحالة تجميع الريبوسومات¹⁵،^16،17.

تجميع الريبوسوم هو عملية معقدة للغاية تسهيلها مجموعة من البروتينات المعروفة باسم عوامل تجميع الريبوسوم¹⁸،¹⁹،^20،21. تؤدي هذه العوامل مجموعة واسعة من الوظائف أثناء التكوين الحيوي للريبوسوم من خلال التفاعلات مع العديد من البروتينات الأخرى ، بما في ذلك ATPases و endo- و exo-nucleases و GTPases و RNA helicases و RNA binding proteins²². كان تجزئة التريبوسوم أداة قوية تستخدم للتحقيق في دور هذه العوامل في تجميع الريبوسوم. على سبيل المثال ، تم استخدام هذه الطريقة لتوضيح كيف يمكن للطفرات في كيناز متعدد النوكليوتيدات Grc3 ، وهو عامل معالجة ما قبل rRNA ، أن يؤثر سلبا على عملية تجميع الريبوسوم^17,23. كما سلط التنميط المتعدد الضوء على كيفية كون الزخارف المحفوظة داخل ATPase Rix7 ضرورية لإنتاج الريبوسوم¹⁶ وبينها.

يبدأ إجراء تجزئة البولسوم بصنع محللات الخلايا القابلة للذوبان من الخلايا ذات الاهتمام. يحتوي الليزات على الحمض النووي الريبي ، والوحدات الفرعية الريبوسومية ، والبوليسومات ، بالإضافة إلى مكونات خلوية أخرى قابلة للذوبان. يتم إجراء تدرج مستمر وخطي من السكروز داخل أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. يتم تحميل الجزء القابل للذوبان من تحلل الخلايا بلطف على الجزء العلوي من أنبوب تدرج السكروز. ثم يخضع أنبوب التدرج المحمل للطرد المركزي ، والذي يفصل المكونات الخلوية حسب الحجم داخل تدرج السكروز بقوة الجاذبية. تنتقل المكونات الأكبر حجما إلى التدرج أكثر من المكونات الأصغر. يضم الجزء العلوي من التدرج المكونات الخلوية الأصغر والأبطأ ، في حين توجد المكونات الخلوية الأكبر والأسرع في الأسفل. بعد الطرد المركزي ، يتم جمع محتويات الأنبوب ككسور. تفصل هذه الطريقة بشكل فعال الوحدات الفرعية الريبوسومية والأحادية والبوليسومات. ثم يتم تحديد الكثافة البصرية لكل جزء عن طريق قياس الامتصاص الطيفي عند طول موجي يبلغ 254 نانومتر. رسم الامتصاص مقابل عدد الكسر ينتج عنه ملف تعريف متعدد الشكل.

يمكن إنشاء تدرجات كثافة السكروز الخطية باستخدام صانع التدرج. بعد الطرد المركزي ، غالبا ما يتم تجزئة التدرجات ، ويتم قياس الامتصاص باستخدام نظام تجزئة الكثافة الآلي³،⁷،^13،24،25. في حين أن هذه الأنظمة تعمل بشكل جيد للغاية لإنتاج ملفات تعريف متعددة ، إلا أنها باهظة الثمن ويمكن أن تكون باهظة التكلفة لبعض المختبرات. هنا يتم تقديم بروتوكول لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام هذه الأدوات. بدلا من ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول المعدات المتوفرة عادة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.

Protocol

1. إعداد 7 ٪ - 47 ٪ تدرجات السكروز

ملاحظة: يمكن تعديل النطاق الخطي لتدرج السكروز لتحقيق فصل أفضل اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. تم تحسين هذا البروتوكول لملفات تعريف polysome ل S. cerevisiae.

1. قم بإعداد محاليل مخزون من 7٪ و 47٪ من السكروز في مخزن مؤقت متدرج السكروز (20 mM Tris-HCl pH 7.4 و 60 mM KCl و 10 mM MgCl₂ و 1 mM DTT). مرشح تعقيم حلول مخزون السكروز من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. تحضير 14 مل من 17٪ و 27٪ و 37٪ من محاليل السكروز عن طريق توزيع وخلط محاليل مخزون السكروز 7٪ و 47٪ بالطريقة الموضحة في الجدول 1.
3. ضع ستة أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين (14 × 89 مم) في رف أنبوب اختبار الرؤية الكاملة. تأكد من وجود مساحة كافية بين الأنابيب بحيث لا تزعج الإجراءات مع أنبوب واحد الآخرين.
4. نعلق إبرة طويلة على حقنة 3 مل. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم إبرة 9 بوصة ، 22 جم مع طرف حاد (الشكل 1) ، ولكن أي إبرة طويلة بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ستكون كافية.
   ملاحظة: قم بإجراء اختبار التعبئة والاستغناء للتأكد من أن المحقنة يمكنها الاحتفاظ بمحلول السكروز دون أي تنقيط قبل إعداد التدرجات.
5. أضف 2 مل من السكروز 7٪ إلى الجزء السفلي من كل أنبوب طرد مركزي.
6. أضف 2 مل من السكروز 17٪ تحت محلول 7٪ عن طريق وضع طرف الإبرة داخل المنطقة المجاورة مباشرة لقاع الأنبوب وتوزيع المحلول ببطء وبعناية.
7. كرر مع 2 مل كل من 27 ٪ ، 37 ٪ ، و 47 ٪ من حلول السكروز. تأكد من أن كل طبقة يمكن تمييزها عن بعضها البعض بواسطة خط يشير إلى فصل الكثافات (الشكل 2).
   ملاحظة: إذا لم يتم استخدام التدرجات في غضون 48 ساعة ، فعندئذ في هذه المرحلة ، قبل استقرارها في تدرج مستمر ، قم بتجميد الأنابيب بمحاليل السكروز ذات الطبقات في النيتروجين السائل وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
8. قم بتخزين التدرجات عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها للسماح للتدرجات بالاستقرار في نسبة مستمرة ومتزايدة من السكروز. يستغرق الأمر من 8 إلى 12 ساعة حتى تستقر محاليل السكروز ذات الطبقات في تدرج سكروز خطي. التدرجات الخطية مستقرة لمدة تصل إلى 48 ساعة. يوفر التخزين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية وقتا كافيا للذوبان والتسوية في تدرج خطي لاستخدام محاليل السكروز المجمدة ذات الطبقات. استخدم مقياس كثافة لتقييم جودة التدرج.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان تخزين التدرجات في مكان مستقر حيث لن يتم إزعاجها ، لأن أي حركات أو اهتزازات ستعطل التدرج.

2. تحضير مستخلصات خلايا الخميرة

1. قم بتلقيح سلالة الخميرة ذات الأهمية إلى 50 مل من مستخلص الخميرة من مستخلص سكر العنب الببتون (YPD) وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز إلى مرحلة ثابتة.
   ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة اعتمادا على متطلبات سلالة الخميرة.
2. انقل 10 مل من ثقافة الطور الثابت إلى 1 لتر من وسائط YPD الطازجة. احتضن الخلايا مع اهتزاز قوي عند 30 درجة مئوية (أو درجة حرارة مناسبة أخرى) حتى تصل الثقافة إلى مرحلة النمو الأسية المتوسطة (OD₆₀₀ = 0.4-0.6).
3. في مرحلة النمو الأسي المتوسط، أضف السيكلوهيكسيميد إلى المستزرعة بتركيز نهائي قدره 0.1 ملغم/مل. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تجميد الخلايا وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
5. أعد تعليق الخلايا في 700 ميكرولتر مبردة من المخزن المؤقت لاستخراج البوليسومات (20 ملليمتر Tris-HCl pH 7.4 ، 60 mM KCl ، 10 mM MgCl2 ، 1 mM DTT ، 1٪ Triton X-100 ، 0.1 mg / mL من cycloheximide ، 0.2 mg / mL من الهيبارين). أضف 100 وحدة من مثبط RNase وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
6. أضف ~ 400 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المبرد مسبقا مع نطاق حجم يتراوح بين 425-600 ميكرومتر إلى أنبوب الطرد المركزي. تعطيل خلايا الخميرة عن طريق التحريض القوي في مضرب الخرز لمدة 5 دقائق.
7. قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي عند 8000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. حدد تركيز الحمض النووي الريبي في الليزات الواضحة عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو باستخدام نظام الكشف عن الحمض النووي الريبي القائم على التألق.
   ملاحظة: للحصول على قياسات دقيقة جدا لتركيز الحمض النووي الريبي، استخدم مجموعات الكشف عن الحمض النووي الريبي القائمة على التألق.
9. تأكد من أن تركيز الحمض النووي الريبي هو 0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفضا جدا ، فقم بتقليل حجم مخزن استخراج polysome المخزن المؤقت المستخدم لإعادة تعليق الخلايا في التجارب المستقبلية.
   ملاحظة: قم بتحميل التحلل على التدرجات مباشرة بعد التحلل وكمية الحمض النووي الريبي. إذا لزم الأمر ، قم بتجميد الليزات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام.

3. الطرد المركزي للتدرجات

1. قم بتحميل الليزات بعناية على الجزء العلوي من التدرجات. ضع طرف الماصة على الجدار الداخلي ، في الجزء العلوي من أنبوب البولي بروبلين. قم بزاوية الأنبوب بلطف وقم بتوزيع الليزات ببطء على الجزء العلوي من التدرج عن طريق المراوغة على الحائط. احرص بشدة على عدم تعطيل أو إزعاج التدرج عند تحميل المحللات.
   ملاحظة: ستختلف كمية الليزات المحملة حسب نوع الخلية. سيختلف محتوى الحمض النووي الريبي أيضا. قد يكون من الضروري إجراء عدد من التجارب لتحديد كمية الليزات اللازمة لإنشاء ملف تعريف متعدد الأمثل. بالنسبة للخميرة ، يعد 300 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي نقطة انطلاق جيدة للتحسين.
2. ضع الأنابيب برفق في الجرافات المبردة مسبقا لدوار الدلو المتأرجح.
   ملاحظة: يجب أن يكون لكل أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين أحجام متساوية من التدرج وكمية الليزات المحملة. هذا يمكن أن يختلف من أنبوب إلى آخر. تأكد من أن التباين لا يسبب خطأ في التوازن أثناء الطرد المركزي الفائق.
3. الطرد المركزي للتدرجات عند 260,110 × g لمدة 150 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

4. جمع الكسور والبيانات

1. قم بإزالة أنابيب أجهزة الطرد المركزي بعناية من دوار الدلو المتأرجح وضعها في حامل الأنبوب.
2. قم بتسمية الألواح المكونة من 96 بئرا لتخزين الكسور وتبريدها مسبقا على الجليد.
   ملاحظة: استخدم صفيحة 96 بئرا مناسبة لمقياس الطيف الضوئي الذي يحتوي على نافذة بصرية تصل إلى 230 نانومتر لتحديد الحمض النووي عند 260 نانومتر/280 نانومتر.
3. اجمع كسور 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر بدءا من أعلى التدرج عن طريق إدخال طرف ماصة بعناية في الجزء العلوي من التدرج. اجمع الكسور حتى يتم اقتباس التدرج بأكمله. يعتمد عدد الكسور على إجمالي حجم التدرج.
   ملاحظة: جمع الكسور بطريقة لا تعطل بقية التدرج. تأكد من أن جميع الكسور لها حجم متساو. بالإضافة إلى التجزئة اليدوية ، هناك طريقة أخرى منخفضة التكلفة للتجزئة وهي استخدام مضخة تمعجية صغيرة.
4. انقل كل جزء إلى صفيحة 96 بئرا للوصول إلى قاع أنبوب جهاز الطرد المركزي. احتفظ بالكسور المجمعة على الجليد في جميع الأوقات.
5. قياس امتصاص كل كسر عند 254 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. استخدم محاليل السكروز 7٪ و 47٪ كفراغات.
   ملاحظة: عند قياس امتصاص الكسور ، ضع في اعتبارك أنه بالنسبة لمعظم مقاييس الطيف ومقاييس الألوان ، فإن نطاق الامتصاص الأكثر فعالية هو 0.1-1. إذا كانت قياسات الامتصاص خارج النطاق (≥1.0) ، فإن الكسور تحتوي على الكثير من المواد. قم بتخفيف العينة وجمع البيانات ثم حساب عامل التخفيف عند رسم ملف التعريف.
6. قم بإنشاء ملف تعريف متعدد الأضلاع عن طريق رسم رقم الكسر مقابل الامتصاص.

النتائج

ويرد في الشكل 3 ثلاثة ملامح تمثيلية متعددة الخصائص. جميع الملفات الشخصية هي من نفس سلالة الخميرة. سيكون للملف الجانبي متعدد الأشكال النموذجي قمم جيدة الحل للوحدات الفرعية الريبوسومية 40S و 60S و 80S بالإضافة إلى polysomes. ستكون قمة كل وحدة فرعية ريبوسومية وقمة متعددة الأضلاع واضحة...

Discussion

هنا تم وصف طريقة لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام أنظمة تجزئة آلية باهظة الثمن. ميزة هذه الطريقة هي أنها تجعل التنميط متعدد الوسائط في متناول المختبرات التي ليس لديها أنظمة تجزئة آلية. العيوب الرئيسية لهذا البروتوكول هي تجزئة اليد المملة وانخفاض الحساسية مقارنة بنظام تجزئة الكثافة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801