그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

요약

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜에 의해 번역되는 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자를 분석하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 자동화된 그래디언트 메이커와 그래디언트 분획 시스템이 일반적으로 이 기술과 함께 사용되지만 이러한 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 자원이 제한되어 있거나 연구를 위해 이 방법을 드물게 또는 가끔 수행해야 하기 때문에 비용을 정당화할 수 없는 실험실의 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 특수 분획 기기 없이 대부분의 분자 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비를 사용하여 폴리솜 프로파일을 재현 가능하게 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 더욱이, 그래디언트 분별 시스템의 유무에 관계없이 생성된 폴리솜 프로파일의 비교가 제공된다. 재현 가능한 폴리솜 프로파일을 최적화하고 생산하기 위한 전략이 논의됩니다. 사카로미세스 세레비시아는 이 프로토콜에서 모델 유기체로 활용됩니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 유기체 및 세포 유형에 대한 리보솜 프로파일을 생성하도록 쉽게 수정 및 조정할 수 있습니다.

서문

리보솜은 mRNA를 단백질로 번역하는 기본 과정을 수행하는 메가 달튼 리보 핵 단백질 복합체입니다. 리보솜은 세포 내의 모든 단백질 합성을 수행하는 역할을합니다. 진핵 생물 리보솜은 침강 계수에 따라 작은 리보솜 소단위 (40S)와 큰 리보솜 소단위 (60S)로 지정된 두 개의 하위 단위로 구성됩니다. 완전히 조립 된 리보솜은 80S 모노 솜으로 지정됩니다. 폴리솜은 단일 mRNA 분자를 번역하는 데 관여하는 리보솜 그룹입니다. 자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜 번역과 관련된 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 분석하는 데 사용되는 강력한 방법입니다. ^,13. 이 기술은 종종 단일 리보솜, 리보솜 서브 유닛 및 메신저 리보 핵 단백질 입자에서 폴리 솜을 분리하는 데 사용됩니다. 분획으로부터 수득된 프로파일은 폴리솜(¹⁴)의 번역 활성 및 리보솜(^15,16,17)의 조립 상태에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.

리보솜 조립은 리보솜 조립 인자^18,19,20,21로 알려진 단백질 그룹에 의해 촉진되는 매우 복잡한 과정입니다. 이들 인자는 ATPases, endo- 및 exo-뉴클레아제, GTPases, RNA 헬리카제 및 RNA 결합 단백질(²²)을 포함하는 많은 다른 단백질과의 상호작용을 통해 리보솜 생물발생 동안 광범위한 기능을 수행한다. 폴리솜 분획은 리보솜 조립에서 이러한 요인의 역할을 조사하는 데 사용되는 강력한 도구였습니다. 예를 들어, 이 방법은 프리-rRNA 프로세싱 인자인 폴리뉴클레오티드 키나아제 Grc3에서의 돌연변이가 리보솜 조립 공정(^17,23)에 어떻게 부정적인 영향을 미칠 수 있는지를 입증하기 위해 활용되었다. 폴리솜 프로파일링은 또한 ATPase Rix7 내의 보존된 모티프가 리보솜 생산에 어떻게 필수적인지를 강조하고 보여주었다(¹⁶).

폴리솜 분획 절차는 관심 세포로부터 용해성 세포 용해물을 만드는 것으로 시작됩니다. 용해물은 RNA, 리보솜 서브 유닛 및 폴리 솜뿐만 아니라 다른 가용성 세포 성분을 포함합니다. 연속적인 선형 자당 구배는 초원심분리기 튜브 내에서 만들어집니다. 세포 용해물의 가용성 분획은 자당 구배 튜브의 상부에 부드럽게 적재된다. 그런 다음 로드된 그래디언트 튜브는 원심분리를 거쳐 중력에 의해 자당 그래디언트 내에서 크기에 따라 세포 구성 요소를 분리합니다. 큰 구성 요소는 작은 구성 요소보다 기울기로 더 멀리 이동합니다. 그라디언트의 상단에는 더 작고 느리게 이동하는 셀룰러 구성 요소가 있는 반면, 더 크고 빠르게 이동하는 셀룰러 구성 요소는 하단에 있습니다. 원심 분리 후, 튜브의 내용물은 분획으로 수집된다. 이 방법은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 폴리 솜을 효과적으로 분리합니다. 각 분획의 광학 밀도는 254 nm의 파장에서 스펙트럼 흡광도를 측정하여 결정됩니다. 흡광도 대 분수 수를 플로팅하면 폴리솜 프로파일이 생성됩니다.

선형 자당 밀도 구배는 그래디언트 메이커를 사용하여 생성할 수 있습니다. 원심분리 후, 구배는 종종 분획되고, 흡광도는 자동 밀도 분별 시스템 3,7,13,24,25를 사용하여 측정된다. 이러한 시스템은 폴리솜 프로파일을 생성하는 데 매우 잘 작동하지만 비용이 많이 들고 일부 실험실에서는 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 이러한 기기를 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 대신, 이 프로토콜은 대부분의 분자 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 장비를 활용합니다.

프로토콜

1. 7% - 47% 자당 구배의 제조

참고: 자당 구배의 선형 범위는 사용된 세포 유형에 따라 더 나은 분리를 달성하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 S. cerevisiae의 폴리솜 프로파일에 최적화되어 있습니다.

1. 슈크로스 구배 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM_MgCl2 및 1 mM DTT) 중에서 7% 및 47% 슈크로스의 스톡 용액을 준비한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통해 슈크로스 원액을 멸균하고 4°C에서 보관한다.
2. 표 1에 기재된 방식으로 7% 및 47% 슈크로스 스톡 용액을 분주 및 혼합하여 17%, 27% 및 37% 슈크로스 용액 14mL를 준비한다.
3. 6개의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브(14 x 89mm)를 전체 보기 시험관 랙에 놓습니다. 한 튜브의 동작이 다른 튜브를 방해하지 않도록 튜브 사이에 충분한 공간을 확보하십시오.
4. 3mL 주사기에 긴 바늘을 부착합니다. 이 프로토콜의 경우 끝이 뭉툭한 9인치, 22G 바늘을 사용하되(그림 1) 원심분리 튜브의 바닥에 도달할 만큼 충분히 긴 바늘이면 충분합니다.
   알림: 그라디언트를 설정하기 전에 주사기가 물방울 없이 자당 용액을 담을 수 있는지 확인하기 위해 테스트 충전 및 분배를 수행하십시오.
5. 각 원심분리기 튜브의 바닥에 7% 자당 2mL를 추가합니다.
6. 바늘 끝을 튜브 바닥 바로 근처에 놓고 용액을 천천히 조심스럽게 분주하여 7% 용액 아래에 17% 자당 2mL를 추가합니다.
7. 27%, 37% 및 47% 자당 용액을 각각 2mL씩 반복하십시오. 각 레이어가 밀도 분리를 표시하는 선으로 서로 구별 가능한지 확인합니다(그림 2).
   알림: 그래디언트가 48시간 이내에 사용되지 않을 경우 이 시점에서 연속 그래디언트로 정착되기 전에 액체 질소에 층상 자당 용액으로 튜브를 급속 동결하고 장기 보관을 위해 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
8. 그래디언트가 연속적으로 정착되어 자당의 비율이 증가할 수 있도록 그래디언트를 4°C에서 밤새 보관하십시오. 층상 자당 용액이 선형 자당 구배로 정착하는 데 8-12시간이 걸립니다. 선형 그래디언트는 최대 48시간 동안 안정적입니다. 4°C에서 하룻밤 보관하면 동결되고 층상 수크로스 용액을 사용하기 위한 선형 구배로 해동 및 침강하기에 충분한 시간이 제공됩니다. 농도계를 사용하여 그라디언트 품질을 평가합니다.
   알림: 그라디언트는 움직임이나 진동이 그라디언트를 방해하므로 방해받지 않는 안정적인 장소에 보관하는 것이 중요합니다.

2. 효모세포 추출물의 제조

1. 관심 효모 균주를 50mL의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지에 접종하고 진탕 인큐베이터에서 30°C에서 밤새 고정상으로 성장시킵니다.
   알림: 온도는 효모 균주 요구 사항에 따라 다를 수 있습니다.
2. 10mL의 고정상 배양물을 1L의 새로운 YPD 배지로 옮깁니다. 배양이 중간 지수 성장 단계 (_OD600 = 0.4-0.6)에 도달 할 때까지 30 ° C (또는 다른 적절한 온도)에서 격렬한 진탕으로 세포를 배양합니다.
3. 중간 지수 성장 단계에서 사이클로헥시미드를 0.1mg/mL의 최종 농도로 배양물에 추가합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
4. 세포를 4°C에서 10분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 수확한다.
   참고: 이 시점에서 세포를 동결하여 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 세포를 냉각된 700μL의 폴리솜 추출 완충액(20mM 트리스-HCl pH 7.4, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 1% 트리톤 X-100, 0.1mg/mL의 사이클로헥시미드, 0.2mg/mL의 헤파린)에 재현탁시킨다. 100 단위의 RNase 억제제를 추가하고 1.5mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
6. 425-600 μm 크기 범위의 ~400 μL의 사전 냉각 유리 비드를 원심분리 튜브에 추가합니다. 5분 동안 비드 비터에서 격렬한 교반으로 효모 세포를 방해합니다.
7. 용해물을 4°C에서 5분 동안 8,000 x g 에서 원심분리하여 명확히 합니다.
8. 분광 광도계로 260nm에서 흡광도를 측정하거나 형광 기반 RNA 검출 시스템을 사용하여 정제된 용해물에서 RNA의 농도를 결정합니다.
   참고: 매우 정확한 RNA 농도 측정을 위해 형광 기반 RNA 검출 키트를 사용하십시오.
9. RNA 농도가 0.5-1 μg/μL인지 확인하십시오. RNA 농도가 너무 낮으면 향후 실험에서 세포를 재현탁하는 데 사용되는 폴리솜 추출 완충액의 부피를 줄입니다.
   참고: 용해 및 RNA 정량 직후 구배에 용해물을 로드합니다. 필요한 경우 용해물을 액체 질소에서 급속 동결하고 며칠 동안 -80°C에서 보관합니다.

3. 그래디언트의 원심분리

1. 용해물을 그라디언트 상단에 조심스럽게 로드합니다. 피펫 팁을 폴리프로필렌 튜브 상단의 내벽에 대고 놓습니다. 튜브를 부드럽게 각도를 맞추고 벽에 드리블하여 용해물을 그라디언트 상단에 천천히 분배합니다. 용해물을 적재할 때 그래디언트를 방해하거나 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오.
   참고: 로드된 용해물의 양은 세포 유형에 따라 다릅니다. RNA의 함량도 다양합니다. 최적의 폴리솜 프로파일을 생성하는데 필요한 용해물의 양을 결정하기 위해 다수의 실험을 수행하는 것이 필요할 수 있다. 효모의 경우 300μg의 RNA가 최적화를 위한 좋은 출발점입니다.
2. 스윙 버킷 로터의 사전 냉각된 버킷에 튜브를 부드럽게 놓습니다.
   알림: 각 폴리프로필렌 원심분리기 튜브는 동일한 부피의 그래디언트와 로드된 용해물의 양을 가져야 합니다. 이것은 튜브마다 다를 수 있습니다. 변동으로 인해 초원심분리 중에 불균형 오류가 발생하지 않는지 확인하십시오.
3. 그래디언트를 260,110 x g 에서 4°C에서 150분 동안 원심분리합니다.

4. 분수 및 데이터 수집

1. 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기 튜브를 조심스럽게 제거하고 튜브 홀더에 넣습니다.
2. 96웰 플레이트에 라벨을 붙여 분획을 저장하고 얼음에 미리 식힙니다.
   참고: 260nm/280nm에서 핵산 측정을 위해 230nm까지의 광학 창이 있는 분광 광도계에 적합한 96웰 플레이트를 사용하십시오.
3. 그래디언트 상단에 피펫 팁을 조심스럽게 삽입하여 그래디언트 상단에서 시작하여 100μL 또는 200μL 분획을 수집합니다. 전체 그래디언트가 부분 인용 될 때까지 분수를 수집하십시오. 분수의 수는 총 그라디언트 볼륨에 따라 달라집니다.
   참고: 그라데이션의 나머지 부분을 방해하지 않는 방식으로 분수를 수집합니다. 모든 분수의 부피가 같은지 확인하십시오. 수동 분획 외에도 분획을 위한 또 다른 저비용 방법은 소형 연동 펌프를 사용하는 것입니다.
4. 각 분획을 96웰 플레이트로 옮겨 원심분리기 튜브의 바닥에 도달합니다. 수집 된 분획을 항상 얼음 위에 보관하십시오.
5. 분광광도계로 254 nm에서 각 분획의 흡광도를 측정한다. 7 % 및 47 % 자당 용액을 블랭크로 사용하십시오.
   알림: 분획의 흡광도를 측정할 때 대부분의 분광계 및 색도계에서 가장 효과적인 흡광도 범위는 0.1-1입니다. 흡광도 측정값이 범위(≥1.0)를 벗어나면 분획에 물질이 너무 많습니다. 샘플을 희석하고 데이터를 다시 수집한 다음 프로필을 플로팅할 때 희석 계수를 고려합니다.
6. 분수 대 흡광도를 플로팅하여 폴리솜 프로파일을 만듭니다.

결과

세 가지 대표적인 폴리솜 프로파일이 그림 3에 나와 있습니다. 모든 프로파일은 동일한 효모 균주에서 추출됩니다. 일반적인 폴리솜 프로파일은 40S, 60S 및 80S 리보솜 서브유닛과 폴리솜에 대해 잘 분해된 피크를 갖습니다. 각 리보솜 서브 유닛의 마루와 폴리솜 피크는 각 프로파일에서 분명합니다 (그림 3). 자동화된 밀도 분별 시스템으로부터의 대표적...

토론

여기에서는 값비싼 자동 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법이 설명되었습니다. 이 방법의 장점은 자동화된 분획 시스템이 없는 실험실에서 폴리솜 프로파일링에 액세스할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 단점은 지루한 손 분획과 전용 밀도 분별 시스템에 비해 감도가 감소한다는 것입니다.

이 프로토콜은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801