Полисомное профилирование без градиентных строителей или систем фракционирования

Резюме

Этот протокол описывает, как генерировать полисомный профиль без использования автоматизированных градиентных изготовителей или систем фракционирования градиентов.

Аннотация

Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным инструментом, который можно использовать для создания профилей рибосом, идентификации конкретных мРНК, транслируемых рибосомами, и анализа факторов, связанных с полисомами. В то время как автоматизированные производители градиентов и системы фракционирования градиентов обычно используются с этим методом, эти системы, как правило, дороги и могут быть непомерно дорогими для лабораторий, которые имеют ограниченные ресурсы или не могут оправдать расходы из-за их нечастой или случайной необходимости выполнять этот метод для своих исследований. Здесь представлен протокол для воспроизводимого создания полисомных профилей с использованием стандартного оборудования, доступного в большинстве лабораторий молекулярной биологии без специализированных инструментов фракционирования. Кроме того, приведено сравнение полисомных профилей, полученных с градиентной системой фракционирования и без нее. Обсуждаются стратегии оптимизации и получения воспроизводимых полисомных профилей. Saccharomyces cerevisiae используется в качестве модельного организма в этом протоколе. Однако этот протокол может быть легко модифицирован и адаптирован для создания профилей рибосом для многих различных организмов и типов клеток.

Введение

Рибосомы представляют собой мега-Дальтонные рибонуклеопротеиновые комплексы, которые выполняют фундаментальный процесс трансляции мРНК в белки. Рибосомы отвечают за осуществление синтеза всех белков внутри клетки. Эукариотические рибосомы состоят из двух субъединиц, обозначенных как малая рибосомная субъединица (40S) и большая рибосомная субъединица (60S) в соответствии с их коэффициентами седиментации. Полностью собранная рибосома обозначается как моносома 80S. Полисомы представляют собой группы рибосом, занимающихся трансляцией одной молекулы мРНК. Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным методом, используемым для создания профилей рибосом, идентификации специфических мРНК, связанных с трансляцией рибосом, и анализа полисомных ассоциированных факторов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Этот метод часто используется для отделения полисом от одиночных рибосом, рибосомных субъединиц и частиц рибонуклеопротеинов. Профили, полученные в результате фракционирования, могут дать ценную информацию относительно трансляционной активности полисом¹⁴ и состояния сборки рибосом 15,16,17.

Сборка рибосом представляет собой очень сложный процесс, облегчаемый группой белков, известных как коэффициенты сборки рибосом 18,19,20,21. Эти факторы выполняют широкий спектр функций во время биогенеза рибосом посредством взаимодействия со многими другими белками, включая АТФазы, эндо- и экзонуклеазы, ГТФазы, РНК-геликазы и РНК-связывающие белки²². Фракционирование полисом было мощным инструментом, используемым для исследования роли этих факторов в сборке рибосом. Например, этот метод был использован для демонстрации того, как мутации в полинуклеотид-киназе Grc3, факторе обработки пре-рРНК, могут негативно повлиять на процесс сборки рибосом^17,23. Полисомное профилирование также выявило и показало, как сохраненные мотивы в АТФазе Rix7 имеют важное значение для производства рибосом¹⁶.

Процедура фракционирования полисом начинается с получения растворимых клеточных лизатов из интересующих клеток. Лизат содержит РНК, рибосомные субъединицы и полисомы, а также другие растворимые клеточные компоненты. Непрерывный линейный градиент сахарозы создается в ультрацентрифужной трубке. Растворимая фракция лизата клеток осторожно загружается на верхнюю часть трубки градиента сахарозы. Затем нагруженная градиентная трубка подвергается центрифугированию, которое разделяет клеточные компоненты по размеру в пределах градиента сахарозы силой тяжести. Более крупные компоненты перемещаются дальше в градиент, чем меньшие компоненты. В верхней части градиента находятся меньшие, более медленные движущиеся клеточные компоненты, тогда как более крупные и быстро движущиеся клеточные компоненты находятся внизу. После центрифугирования содержимое трубки собирают в виде фракций. Этот метод эффективно разделяет рибосомные субъединицы, моносомы и полисомы. Затем оптическая плотность каждой фракции определяется путем измерения спектрального поглощения на длине волны 254 нм. Построение поглощающей способности по отношению к числу фракций дает полисомный профиль.

Линейные градиенты плотности сахарозы могут быть сгенерированы с использованием создателя градиентов. После центрифугирования градиенты часто фракционируются, а поглощения измеряются с помощью автоматизированной системы фракционирования плотности 3,7,13,24,25. Хотя эти системы очень хорошо работают для производства полисомных профилей, они дороги и могут быть непомерно дорогими для некоторых лабораторий. Здесь представлен протокол генерации полисомных профилей без использования этих инструментов. Вместо этого этот протокол использует оборудование, обычно доступное в большинстве лабораторий молекулярной биологии.

протокол

1. Препарат 7% - 47% градиентов сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Линейный диапазон градиента сахарозы может быть модифицирован для достижения лучшего разделения в зависимости от типа используемой клетки. Этот протокол оптимизирован для полисомных профилей для S. cerevisiae.

1. Готовят стоковые растворы 7% и 47% сахарозы в буфере градиента сахарозы (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ DTT). Фильтр стерилизует растворы сахарозы через фильтр 0,22 мкм и хранит при 4 °C.
2. Готовят 14 мл 17%, 27% и 37% растворов сахарозы путем дозирования и смешивания 7% и 47% растворов сахарозы способом, описанным в таблице 1.
3. Поместите шесть полипропиленовых центрифужных трубок (14 x 89 мм) в стойку для пробирок с полным обзором. Обеспечьте достаточное пространство между трубками, чтобы действия с одной трубкой не мешали другим.
4. Прикрепите длинную иглу к шприцу объемом 3 мл. Для этого протокола используйте иглу 9 дюймов, 22 г с тупым наконечником (рисунок 1), но достаточно любой иглы, достаточно длинной, чтобы достичь дна трубки центрифуги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните тестовое заполнение и дозирование, чтобы убедиться, что шприц может удерживать раствор сахарозы без каких-либо капель перед установкой градиентов.
5. Добавьте 2 мл 7% сахарозы на дно каждой трубки центрифуги.
6. Добавьте 2 мл 17% сахарозы под 7% раствор, расположив кончик иглы в непосредственной близости от дна трубки и дозируя раствор медленно и осторожно.
7. Повторить с 2 мл каждого из 27%, 37% и 47% растворов сахарозы. Убедитесь, что каждый слой отличается друг от друга линией, обозначающей разделение плотностей (рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если градиенты не будут использоваться в течение 48 часов, то на этом этапе, до их осаждения в непрерывный градиент, во вспышке замораживают трубки со слоистыми растворами сахарозы в жидком азоте и хранят в морозильной камере -80 °C для длительного хранения.
8. Храните градиенты при 4 °C в течение ночи, чтобы позволить градиентам оседать в непрерывный, увеличивающийся процент сахарозы. Требуется 8-12 ч, чтобы слоистые растворы сахарозы осели в линейный градиент сахарозы. Линейные градиенты стабильны до 48 ч. Ночное хранение при 4 °C обеспечивает достаточное время для размораживания и осаждения в линейный градиент для использования замороженных, слоистых растворов сахарозы. Используйте денситометр для оценки качества градиента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно хранить градиенты в стабильном месте, где они не будут нарушены, так как любые движения или вибрации нарушат градиент.

2. Приготовление экстрактов дрожжевых клеток

1. Инокулируют интересующий штамм дрожжей в 50 мл среды дрожжевого экстракта пептона декстрозы (YPD) и растут в течение ночи при 30 °C в встряхивающем инкубаторе до стационарной фазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура может варьироваться в зависимости от требований к штамму дрожжей.
2. Переведите 10 мл стационарной фазовой культуры в 1 л свежей среды СЛД. Инкубируют клетки с сильным встряхиванием при 30 °C (или другой подходящей температуре) до тех пор, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. В середине экспоненциальной фазы роста добавляют циклогексимид в культуру в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
4. Собирайте клетки путем центрифугирования при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть заморожены и сохранены при -80 °C.
5. Повторно суспендируют клетки в охлажденном 700 мкл буфера экстракции полисом (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1% Тритон X-100, 0,1 мг/мл циклогексимида, 0,2 мг/мл гепарина). Добавьте 100 единиц ингибитора РНКАЗЫ и переложите его в центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
6. Добавьте в трубку центрифуги ~400 мкл предварительно охлажденных стеклянных шариков с диапазоном размеров 425-600 мкм. Разрушают дрожжевые клетки путем энергичного перемешивания в бусине-битере в течение 5 мин.
7. Осветляют лизат центрифугированием при 8 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
8. Определить концентрацию РНК в осветленном лизате путем измерения абсорбции при 260 нм с помощью спектрофотометра или с помощью системы обнаружения РНК на основе флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для очень точных измерений концентрации РНК используйте наборы для обнаружения РНК на основе флуоресценции.
9. Убедитесь, что концентрация РНК составляет 0,5-1 мкг/мкл. Если концентрация РНК слишком низкая, уменьшите объем буфера экстракции полисом, используемого для повторного суспендирования клеток в будущих экспериментах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите лизат на градиенты сразу после лизиса и количественного определения РНК. При необходимости во вспышке заморозьте лизаты в жидком азоте и храните при -80 °C в течение нескольких дней.

3. Центрифугирование градиентов

1. Осторожно загрузите лизат на верхнюю часть градиентов. Поместите наконечник пипетки к внутренней стенке, в верхней части полипропиленовой трубки. Осторожно наклоните трубку и медленно распределите лизат на верхнюю часть градиента, прижимаясь к стене. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить или не нарушить градиент при загрузке лизата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество загруженного лизата будет варьироваться в зависимости от типа ячейки. Содержание РНК также будет варьироваться. Может потребоваться провести ряд экспериментов для определения количества лизата, необходимого для создания оптимального полисомного профиля. Для дрожжей 300 мкг РНК является хорошей отправной точкой для оптимизации.
2. Осторожно поместите трубки в предварительно охлажденные ведра качающегося ротора ковша.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая полипропиленовая центрифужная трубка должна иметь равные объемы градиента и количество загруженного лизата. Это может варьироваться от трубки к трубке. Убедитесь, что изменение не вызывает ошибку дисбаланса во время ультрацентрифугирования.
3. Центрифугирование градиентов при 260,110 x g в течение 150 мин при 4 °C.

4. Сбор фракций и данных

1. Осторожно извлеките трубки центрифуги из качающегося ротора ковша и поместите их в держатель трубки.
2. Нанесите маркировку на 96-луночных пластинах для хранения фракций и предварительного охлаждения на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96-луночную пластину, подходящую для спектрофотометра, который имеет оптическое окно до 230 нм для определения нуклеиновых кислот при 260 нм / 280 нм.
3. Соберите фракции объемом 100 мкл или 200 мкл, начиная с верхней части градиента, осторожно вставив наконечник пипетки в верхнюю часть градиента. Собирайте дроби до тех пор, пока весь градиент не будет аликвотирован. Количество фракций будет зависеть от общего объема градиента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте дроби таким образом, чтобы не нарушать остальную часть градиента. Убедитесь, что все фракции имеют равный объем. В дополнение к ручному фракционированию, еще одним недорогим методом фракционирования является использование небольшого перистальтического насоса.
4. Переложите каждую фракцию на 96-луночную пластину, чтобы добраться до дна трубы центрифуги. Держите собранные фракции на льду все время.
5. Измерьте поглощение каждой фракции при 254 нм с помощью спектрофотометра. Используйте 7% и 47% растворы сахарозы в качестве заготовок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При измерении поглощения фракций имейте в виду, что для большинства спектрометров и колориметров наиболее эффективный диапазон поглощения составляет 0,1-1. Если измерения поглощения выходят за пределы диапазона (≥1,0), фракции имеют слишком много материала. Разбавьте образец, вспомните данные, а затем учитывайте коэффициент разбавления при построении профиля.
6. Создайте полисомный профиль, построив число фракций в сравнении с поглощением.

Результаты

Три репрезентативных полисомных профиля показаны на рисунке 3. Все профили из одного и того же штамма дрожжей. Типичный полисомный профиль будет иметь хорошо разрешенные пики для рибосомных субъединиц 40S, 60S и 80S, а также полисом. Гребень каждой рибосомной субъединицы и п?...

Обсуждение

Здесь описан способ создания полисомных профилей без использования дорогостоящих автоматизированных систем фракционирования. Преимущество этого метода заключается в том, что он делает полисомное профилирование доступным для лабораторий, которые не имеют автоматизированных систем ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801