Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает, как генерировать полисомный профиль без использования автоматизированных градиентных изготовителей или систем фракционирования градиентов.
Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным инструментом, который можно использовать для создания профилей рибосом, идентификации конкретных мРНК, транслируемых рибосомами, и анализа факторов, связанных с полисомами. В то время как автоматизированные производители градиентов и системы фракционирования градиентов обычно используются с этим методом, эти системы, как правило, дороги и могут быть непомерно дорогими для лабораторий, которые имеют ограниченные ресурсы или не могут оправдать расходы из-за их нечастой или случайной необходимости выполнять этот метод для своих исследований. Здесь представлен протокол для воспроизводимого создания полисомных профилей с использованием стандартного оборудования, доступного в большинстве лабораторий молекулярной биологии без специализированных инструментов фракционирования. Кроме того, приведено сравнение полисомных профилей, полученных с градиентной системой фракционирования и без нее. Обсуждаются стратегии оптимизации и получения воспроизводимых полисомных профилей. Saccharomyces cerevisiae используется в качестве модельного организма в этом протоколе. Однако этот протокол может быть легко модифицирован и адаптирован для создания профилей рибосом для многих различных организмов и типов клеток.
Рибосомы представляют собой мега-Дальтонные рибонуклеопротеиновые комплексы, которые выполняют фундаментальный процесс трансляции мРНК в белки. Рибосомы отвечают за осуществление синтеза всех белков внутри клетки. Эукариотические рибосомы состоят из двух субъединиц, обозначенных как малая рибосомная субъединица (40S) и большая рибосомная субъединица (60S) в соответствии с их коэффициентами седиментации. Полностью собранная рибосома обозначается как моносома 80S. Полисомы представляют собой группы рибосом, занимающихся трансляцией одной молекулы мРНК. Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным методом, используемым для....
1. Препарат 7% - 47% градиентов сахарозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Линейный диапазон градиента сахарозы может быть модифицирован для достижения лучшего разделения в зависимости от типа используемой клетки. Этот протокол оптимизирован для полисомных профилей для S. cerevisiae.
Три репрезентативных полисомных профиля показаны на рисунке 3. Все профили из одного и того же штамма дрожжей. Типичный полисомный профиль будет иметь хорошо разрешенные пики для рибосомных субъединиц 40S, 60S и 80S, а также полисом. Гребень каждой рибосомной субъединицы и п?.......
Здесь описан способ создания полисомных профилей без использования дорогостоящих автоматизированных систем фракционирования. Преимущество этого метода заключается в том, что он делает полисомное профилирование доступным для лабораторий, которые не имеют автоматизированных систем .......
Авторам нечего раскрывать.
Авторы благодарят доктора Перси Тумбале и доктора Мелиссу Уэллс за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук о гигиене окружающей среды США (NIEHS; ZIA ES103247 к R.E.S).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Automatic Fractionator | Brandel | ||
Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены