Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает, как генерировать полисомный профиль без использования автоматизированных градиентных изготовителей или систем фракционирования градиентов.

Аннотация

Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным инструментом, который можно использовать для создания профилей рибосом, идентификации конкретных мРНК, транслируемых рибосомами, и анализа факторов, связанных с полисомами. В то время как автоматизированные производители градиентов и системы фракционирования градиентов обычно используются с этим методом, эти системы, как правило, дороги и могут быть непомерно дорогими для лабораторий, которые имеют ограниченные ресурсы или не могут оправдать расходы из-за их нечастой или случайной необходимости выполнять этот метод для своих исследований. Здесь представлен протокол для воспроизводимого создания полисомных профилей с использованием стандартного оборудования, доступного в большинстве лабораторий молекулярной биологии без специализированных инструментов фракционирования. Кроме того, приведено сравнение полисомных профилей, полученных с градиентной системой фракционирования и без нее. Обсуждаются стратегии оптимизации и получения воспроизводимых полисомных профилей. Saccharomyces cerevisiae используется в качестве модельного организма в этом протоколе. Однако этот протокол может быть легко модифицирован и адаптирован для создания профилей рибосом для многих различных организмов и типов клеток.

Введение

Рибосомы представляют собой мега-Дальтонные рибонуклеопротеиновые комплексы, которые выполняют фундаментальный процесс трансляции мРНК в белки. Рибосомы отвечают за осуществление синтеза всех белков внутри клетки. Эукариотические рибосомы состоят из двух субъединиц, обозначенных как малая рибосомная субъединица (40S) и большая рибосомная субъединица (60S) в соответствии с их коэффициентами седиментации. Полностью собранная рибосома обозначается как моносома 80S. Полисомы представляют собой группы рибосом, занимающихся трансляцией одной молекулы мРНК. Фракционирование полисом путем центрифугирования градиента плотности сахарозы является мощным методом, используемым для....

протокол

1. Препарат 7% - 47% градиентов сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Линейный диапазон градиента сахарозы может быть модифицирован для достижения лучшего разделения в зависимости от типа используемой клетки. Этот протокол оптимизирован для полисомных профилей для S. cerevisiae.

  1. Готовят стоковые растворы 7% и 47% сахарозы в буфере градиента сахарозы (20 мМ Tris-HCl pH 7,4, 60 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT). Фильтр стерилизует растворы сахарозы через фильтр 0,22 мкм и хранит при 4 °C.
  2. Готовят 14 мл 17%, 27% и 37% растворов сахарозы путем дозирования и смешивания 7% и 47% растворов сахарозы способом, описанным в

Результаты

Три репрезентативных полисомных профиля показаны на рисунке 3. Все профили из одного и того же штамма дрожжей. Типичный полисомный профиль будет иметь хорошо разрешенные пики для рибосомных субъединиц 40S, 60S и 80S, а также полисом. Гребень каждой рибосомной субъединицы и п?.......

Обсуждение

Здесь описан способ создания полисомных профилей без использования дорогостоящих автоматизированных систем фракционирования. Преимущество этого метода заключается в том, что он делает полисомное профилирование доступным для лабораторий, которые не имеют автоматизированных систем .......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Перси Тумбале и доктора Мелиссу Уэллс за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой внутренних исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук о гигиене окружающей среды США (NIEHS; ZIA ES103247 к R.E.S).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Automatic FractionatorBrandel
Clariostar Multimode Plate ReaderBMG Labtech
CycloheximideSigma AldrichC7698
DithiothreitolInvitrogen15508-013
Glass Beads, acid washedSigma AldrichG8772425–600 μm
HeparinSigma AldrichH4784
Magnesium Chloride, 1 MKD MedicalCAC-5290
Needle, 22 G, Metal HubHamilton Company7748-08custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K UltracentrifugeBeckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubesBeckman Coulter331372
Polypropylene Test Tube Peg RackFisher Scientific14-810-54A
Potassium ChlorideSigma AldrichP9541
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33228
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32855
RNAse InhibitorApplied BiosystemsN8080119
SucroseSigma AldrichS0389
SW41 Swinging Bucket Rotor PkgBeckman Coulter331336
Syringe, 3 mLCoviden888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4KD MedicalRGF-3340
Triton X-100Sigma AldrichX100
UV-Star Microplate, 96 wellsGreiner Bio-One655801

Ссылки

  1. Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
  2. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены