פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

Abstract

פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי ליצור פרופילים של ריבוזומים, לזהות mRNA ספציפיים המתורגמים על ידי ריבוזומים, ולנתח גורמים הקשורים לפוליזום. בעוד שיצרני שיפועים אוטומטיים ומערכות פיצול הדרגתיות משמשים בדרך כלל בטכניקה זו, מערכות אלה הן בדרך כלל יקרות ויכולות להיות יקרות עבור מעבדות שיש להן משאבים מוגבלים או שאינן יכולות להצדיק את ההוצאה בשל הצורך הנדיר או המזדמן שלהן לבצע שיטה זו עבור המחקר שלהן. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילי פוליזום באמצעות ציוד סטנדרטי הזמין ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית ללא מכשירי פיצול מיוחדים. יתר על כן, ניתנת השוואה של פרופילי פוליזום שנוצרו עם ובלי מערכת פיצול הדרגתית. נדונו אסטרטגיות למיטוב וייצור פרופילי פוליזום הניתנים לשחזור. Saccharomyces cerevisiae משמש כאורגניזם מודל בפרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות ולהתאים ליצירת פרופילי ריבוזום עבור אורגניזמים וסוגי תאים רבים ושונים.

Introduction

ריבוזומים הם קומפלקסים מגה-דלטון ריבונוקלאופרוטאין המבצעים את התהליך הבסיסי של תרגום mRNA לחלבונים. ריבוזומים אחראים על ביצוע הסינתזה של כל החלבונים בתוך התא. ריבוזומים אאוקריוטים מורכבים משתי תת-יחידות המוגדרות כתת-יחידה ריבוזומלית קטנה (40S) ותת-יחידה ריבוזומלית גדולה (60S) על פי מקדמי המשקעים שלהן. הריבוזום המורכב במלואו מוגדר כמונוזום 80S. פוליזומים הם קבוצות של ריבוזומים העוסקים בתרגום מולקולת mRNA יחידה. פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז היא שיטה רבת עוצמה המשמשת ליצירת פרופילי ריבוזום, זיהוי mRNA ספציפיים הקשורים לתרגום ריבוזומים וניתוח גורמים הקשורים לפוליזום 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות להפרדת פוליסומים מריבוזומים בודדים, תת-יחידות ריבוזומליות וחלקיקי ריבונוקלאופרוטאין שליחים. הפרופילים המתקבלים מהפיצול יכולים לספק מידע רב ערך לגבי פעילות התרגום של פוליזומים¹⁴ ומצב ההרכבה של הריבוזומים^15,16,17.

הרכבת ריבוזום היא תהליך מורכב מאוד המתאפשר על ידי קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי הרכבה ריבוזום 18,19,20,21. גורמים אלה מבצעים מגוון רחב של פונקציות במהלך ביוגנזה של ריבוזום באמצעות אינטראקציות עם חלבונים רבים אחרים, כולל ATPases, אנדו ואקסו-נוקלזים, GTPases, RNA helicases וחלבונים קושרי RNA²². פיצול פוליזום היה כלי רב עוצמה המשמש לחקר תפקידם של גורמים אלה בהרכבת ריבוזום. לדוגמה, שיטה זו שימשה כדי להדגים כיצד מוטציות בפולינוקלאוטיד קינאז Grc3, גורם עיבוד קדם-rRNA, יכולות להשפיע לרעה על תהליך הרכבת הריבוזום^17,23. פרופיל פוליזום גם הדגיש והראה כיצד המוטיבים המשומרים בתוך ATPase Rix7 חיוניים לייצור ריבוזום¹⁶.

ההליך לפיצול פוליזום מתחיל ביצירת תאים מסיסים מתאי עניין. הליזאט מכיל RNA, תת-יחידות ריבוזומליות ופוליזומים, כמו גם רכיבים תאיים מסיסים אחרים. שיפוע סוכרוז רציף וליניארי נוצר בתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. החלק המסיס של ליזאט התא נטען בעדינות על החלק העליון של צינור גרדיאנט סוכרוז. לאחר מכן, צינור השיפוע הטעון נתון לצנטריפוגה, המפרידה בין הרכיבים התאיים לפי גודלם בתוך שיפוע הסוכרוז בכוח הכבידה. הרכיבים הגדולים יותר נעים רחוק יותר לתוך השיפוע מאשר הרכיבים הקטנים יותר. החלק העליון של השיפוע מכיל את הרכיבים התאיים הקטנים והאיטיים יותר, ואילו הרכיבים הסלולריים הגדולים והמהירים יותר נמצאים בתחתית. לאחר צנטריפוגה, התוכן של הצינור נאספים כשברים. שיטה זו מפרידה ביעילות בין תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. הצפיפות האופטית של כל שבר נקבעת לאחר מכן על ידי מדידת הבליעה הספקטרלית באורך גל של 254 ננומטר. התוויית ספיגה לעומת מספר שבר מניבה פרופיל פוליזום.

ניתן ליצור מעברי צבע ליניאריים של צפיפות סוכרוז באמצעות יצירת מעבר צבע. לאחר צנטריפוגה, שיפועים מופרדים לעתים קרובות, וסופגות נמדדות באמצעות מערכת פיצול צפיפות אוטומטית 3,7,13,24,25. בעוד שמערכות אלה פועלות היטב כדי לייצר פרופילים פוליזומיים, הן יקרות ועלולות להיות יקרות עבור מעבדות מסוימות. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש בכלים אלה. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בציוד הזמין בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.

Protocol

1. הכנת שיפועים של 7% - 47% סוכרוז

הערה: ניתן לשנות את הטווח הליניארי של מעבר הצבע סוכרוז כדי להשיג הפרדה טובה יותר בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש. פרוטוקול זה מותאם לפרופילי פוליזום עבור S. cerevisiae.

1. הכן פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ ו-1 mM DTT). המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ומאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן 14 מ"ל של 17%, 27% ו-37% פתרונות סוכרוז על-ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז באופן המתואר בטבלה 1.
3. הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן (14 x 89 מ"מ) במדף מבחנות לצפייה מלאה. ודא מספיק רווח בין הצינורות כך שפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים.
4. הצמידו מחט ארוכה למזרק 3 מ"ל. עבור פרוטוקול זה, השתמש במחט בגודל 9 אינץ', 22 G עם קצה קהה (איור 1), אך כל מחט ארוכה מספיק כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה תספיק.
   הערה: יש לבצע בדיקה של מילוי וחלוקה כדי לוודא שהמזרק יכול להכיל את תמיסת הסוכרוז ללא טפטוף לפני הגדרת מעברי הצבע.
5. הוסף 2 מ"ל של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה.
6. הוסף 2 מ"ל של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7% על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור וחלוקת התמיסה לאט ובזהירות.
7. חזרו על הפעולה עם 2 מ"ל כל אחד מתמיסות הסוכרוז של 27%, 37% ו-47%. ודאו שכל שכבה ניתנת להבחנה ביניהן באמצעות קו המסמן את הפרדת הצפיפויות (איור 2).
   הערה: אם לא מתכוונים להשתמש בשיפוע תוך 48 שעות, בשלב זה, לפני התיישבותם לשיפוע רציף, הקפיא את הצינורות עם תמיסות סוכרוז שכבתיות בחנקן נוזלי ואחסן במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
8. יש לאחסן מעברי צבע בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לאפשר למעברי צבע לשקוע באחוז רציף והולך של סוכרוז. לוקח 8-12 שעות עד שתמיסות הסוכרוז השכבתיות מתמקמות בשיפוע סוכרוז ליניארי. מעברי צבע ליניאריים יציבים עד 48 שעות. אחסון לילה בטמפרטורה של 4°C מספק מספיק זמן להפשרה והתיישבות לתוך שיפוע ליניארי לשימוש בתמיסות סוכרוז קפואות ושכבתיות. השתמש במד צפיפות כדי להעריך את איכות מעבר הצבע.
   הערה: חיוני לאחסן את מעברי הצבע במקום יציב שבו הם לא יופרעו, מכיוון שכל תנועה או רטט ישבשו את השיפוע.

2. הכנת תמציות תאי שמרים

1. לחסן את זן השמרים המעניין לתוך 50 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) מדיה ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד לשלב נייח.
   הערה: הטמפרטורה עשויה להשתנות בהתאם לדרישות זן השמרים.
2. העבר 10 מ"ל של תרבית פאזה נייחת לתוך 1 ליטר של מדיית YPD טרייה. דגירה של התאים עם רעידות נמרצות ב 30 מעלות צלזיוס (או טמפרטורה מתאימה אחרת) עד התרבית מגיעה לשלב הצמיחה האמצעי-מעריכי (OD₆₀₀ = 0.4-0.6).
3. בשלב הגדילה האמצעי-אקספוננציאלי, יש להוסיף ציקלוהקסימיד לתרבית בריכוז סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
4. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא תאים ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 °C.
5. החזירו את התאים למאגר מיצוי פוליזום מצונן של 700 μL (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0.1 mg/mL של ציקלוהקסימיד, 0.2 מ"ג/מ"ל של הפרין). הוסף 100 יחידות של מעכב RNase והעבר אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
6. הוסף ~ 400 μL של חרוזי זכוכית מקוררים מראש עם טווח גודל של 425-600 מיקרומטר לצינור הצנטריפוגה. משבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך 5 דקות.
7. להבהיר את ליזאט על ידי צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר או באמצעות מערכת גילוי RNA מבוססת פלואורסצנציה.
   הערה: למדידות מדויקות מאוד של ריכוז RNA, השתמש בערכות זיהוי RNA מבוססות פלואורסצנציה.
9. ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5-1 מיקרוגרם / μL. אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח מאגר מיצוי הפוליסום המשמש להחייאת התאים בניסויים עתידיים.
   הערה: טען את הליזאט על מעברי הצבע מיד לאחר כמות הליזיס והרנ"א. במידת הצורך, פלאש להקפיא את הליזטים בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3. צנטריפוגה של שיפועים

1. טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי, בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן. זווית עדינה את הצינור ופזרו באיטיות את הליזאט על החלק העליון של השיפוע על ידי טפטוף על הקיר. היזהר מאוד לא לשבש או להפריע לשיפוע בעת טעינת הליזאט.
   הערה: כמות הליזאט שנטען משתנה בהתאם לסוג התא. התוכן של RNA יהיה גם להשתנות. ייתכן שיהיה צורך לבצע מספר ניסויים כדי לקבוע את כמות הליזאט הדרושה ליצירת פרופיל פוליזום אופטימלי. עבור שמרים, 300 מיקרוגרם של RNA היא נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה.
2. מניחים בעדינות את הצינורות בדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד.
   הערה: כל צינור צנטריפוגה מפוליפרופילן צריך להיות בעל נפחים שווים של שיפוע וכמות הליזאט הטעונה. זה יכול להשתנות מצינור לצינור. ודא כי השונות אינה גורמת לשגיאה בחוסר איזון במהלך ultracentrifugation.
3. צנטריפוגה שיפועים ב 260,110 x גרם במשך 150 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

4. שברים ואיסוף נתונים

1. הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד והנח אותם במחזיק צינורות.
2. תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח.
   הערה: השתמש בלוח 96 בארות המתאים לספקטרופוטומטר בעל חלון אופטי עד 230 ננומטר לקביעת חומצות גרעין ב-260 ננומטר/280 ננומטר.
3. אסוף שברים של 100 μL או 200 μL החל מראש השיפוע על ידי הכנסה קפדנית של קצה פיפט לחלק העליון של מעבר הצבע. אסוף שברים עד שכל מעבר הצבע הוא aliquoted. מספר השברים יהיה תלוי בנפח ההדרגתי הכולל.
   הערה: אסוף את השברים באופן שאינו משבש את שאר מעבר הצבע. ודא שלכל השברים יש נפח שווה. בנוסף לפיצול ידני, שיטה נוספת בעלות נמוכה לפיצול היא להשתמש במשאבה פריסטלטית קטנה.
4. מעבירים כל חלק לצלחת 96 הבאר כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה. שמור את השברים שנאספו על הקרח בכל עת.
5. מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש בתמיסות 7% ו- 47% סוכרוז כריקים.
   הערה: בעת מדידת ספיגת שברים, זכור כי עבור רוב הספקטרומטרים ומדי הצבע, טווח הספיגה היעיל ביותר הוא 0.1-1. אם מדידות הספיגה נמצאות מחוץ לטווח (≥1.0), לשברים יש יותר מדי חומר. לדלל את המדגם, לזכור את הנתונים, ולאחר מכן לקחת בחשבון את גורם הדילול בעת התוויית הפרופיל.
6. צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה.

תוצאות

שלושה פרופילים פוליזום מייצגים מוצגים באיור 3. כל הפרופילים הם מאותו זן שמרים. פרופיל פוליזום טיפוסי יהיה בעל פסגות פתורות היטב עבור תת-יחידות ריבוזומליות של 40S, 60S ו-80S, כמו גם פוליזומים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגה פוליזומית תיראה בכל פרופיל (איור 3...

Discussion

כאן תוארה שיטה ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש במערכות פיצול אוטומטיות יקרות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מנגישה פרופיל פוליזום למעבדות שאין להן מערכות פיצול אוטומטיות. החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם פיצול ידיים מייגע ורגישות מופחתת בהשוואה למערכת פיצול הצפיפות הייעודית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801