Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Résumé

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Résumé

Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est un outil puissant qui peut être utilisé pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques traduits par les ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes. Bien que les fabricants de gradient automatisés et les systèmes de fractionnement de gradient soient couramment utilisés avec cette technique, ces systèmes sont généralement coûteux et peuvent être prohibitifs pour les laboratoires qui ont des ressources limitées ou qui ne peuvent pas justifier la dépense en raison de leur besoin peu fréquent ou occasionnel d’effectuer cette méthode pour leurs recherches. Ici, un protocole est présenté pour générer de manière reproductible des profils de polysomes en utilisant l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sans instruments de fractionnement spécialisés. De plus, une comparaison des profils de polysomes générés avec et sans système de fractionnement par gradient est fournie. Les stratégies visant à optimiser et à produire des profils polysomiques reproductibles sont discutées. Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme organisme modèle dans ce protocole. Cependant, ce protocole peut être facilement modifié et adapté pour générer des profils de ribosomes pour de nombreux organismes et types de cellules différents.

Introduction

Les ribosomes sont des complexes de ribonucléoprotéines méga-Dalton qui effectuent le processus fondamental de traduction de l’ARNm en protéines. Les ribosomes sont responsables de la synthèse de toutes les protéines d’une cellule. Les ribosomes eucaryotes comprennent deux sous-unités désignées comme la petite sous-unité ribosomique (40S) et la grande sous-unité ribosomique (60S) en fonction de leurs coefficients de sédimentation. Le ribosome entièrement assemblé est désigné comme le monosome 80S. Les polysomes sont des groupes de ribosomes engagés dans la traduction d’une seule molécule d’ARNm. Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est une méthode puissante utilisée pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques associés à la traduction des ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Cette technique est souvent utilisée pour séparer les polysomes des ribosomes simples, des sous-unités ribosomales et des particules de ribonucléoprotéine messagère. Les profils obtenus par fractionnement peuvent fournir des informations précieuses concernant l’activité de traduction des polysomes¹⁴ et l’état d’assemblage des ribosomes^15,16,17.

L’assemblage des ribosomes est un processus très complexe facilité par un groupe de protéines connues sous le nom de facteurs d’assemblage des ribosomes 18,19,20,21. Ces facteurs remplissent un large éventail de fonctions au cours de la biogenèse des ribosomes grâce à des interactions avec de nombreuses autres protéines, notamment les ATPases, les endonucléases et exonucléases, les GTPases, les hélicases d’ARN et les protéines de liaison à l’ARN²². Le fractionnement des polysomes a été un outil puissant utilisé pour étudier le rôle de ces facteurs dans l’assemblage des ribosomes. Par exemple, cette méthode a été utilisée pour démontrer comment des mutations dans la kinase polynucléotidique Grc3, un facteur de traitement pré-ARNr, peuvent affecter négativement le processus d’assemblage des ribosomes^17,23. Le profilage des polysomes a également mis en évidence et montré comment les motifs conservés dans l’ATPase Rix7 sont essentiels à la production de ribosomes¹⁶.

La procédure de fractionnement des polysomes commence par la fabrication de lysats cellulaires solubles à partir de cellules d’intérêt. Le lysat contient de l’ARN, des sous-unités ribosomales et des polysomes, ainsi que d’autres composants cellulaires solubles. Un gradient de saccharose continu et linéaire est réalisé dans un tube à ultracentrifugation. La fraction soluble du lysat cellulaire est délicatement chargée sur le dessus du tube de gradient de saccharose. Le tube de gradient chargé est ensuite soumis à une centrifugation, qui sépare les composants cellulaires par taille dans le gradient de saccharose par la force de gravité. Les composants les plus grands se déplacent plus loin dans le gradient que les composants plus petits. Le haut du gradient abrite les composants cellulaires plus petits et plus lents, tandis que les composants cellulaires plus grands et plus rapides se trouvent en bas. Après centrifugation, le contenu du tube est recueilli sous forme de fractions. Cette méthode sépare efficacement les sous-unités ribosomiques, les monosomes et les polysomes. La densité optique de chaque fraction est ensuite déterminée en mesurant l’absorbance spectrale à une longueur d’onde de 254 nm. Le tracé de l’absorbance par rapport au nombre de fractions donne un profil polysomique.

Des gradients linéaires de densité de saccharose peuvent être générés à l’aide d’un générateur de gradient. Après centrifugation, les gradients sont souvent fractionnés et les absorbances mesurées à l’aide d’un système automatisé de fractionnement de densité 3,7,13,24,25. Bien que ces systèmes fonctionnent très bien pour produire des profils de polysomes, ils sont coûteux et peuvent être prohibitifs pour certains laboratoires. Ici, un protocole pour générer des profils polysomiques sans l’utilisation de ces instruments est présenté. Au lieu de cela, ce protocole utilise l’équipement généralement disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.

Protocole

1. Préparation de gradients de saccharose de 7% à 47%

REMARQUE: La plage linéaire du gradient de saccharose peut être modifiée pour obtenir une meilleure séparation en fonction du type de cellule utilisé. Ce protocole est optimisé pour les profils polysomiques de S. cerevisiae.

1. Préparer des solutions mères de saccharose à 7 % et 47 % dans un tampon gradient de saccharose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 et 1 mM DTT). Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
2. Préparer 14 mL de solutions de saccharose à 17 %, 27 % et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions de saccharose à 7 % et à 47 % de la manière décrite au tableau 1.
3. Placez six tubes centrifuges en polypropylène (14 x 89 mm) dans un support de tube à essai à vue intégrale. Assurez-vous d’un espace suffisant entre les tubes pour que les actions avec un tube ne perturbent pas les autres.
4. Fixez une longue aiguille à une seringue de 3 mL. Pour ce protocole, utilisez une aiguille de 9 po et 22 G munie d’une pointe émoussée (Figure 1), mais toute aiguille suffisamment longue pour atteindre le fond du tube de centrifugation suffira.
   NOTE: Effectuer un test de remplissage et de dispense pour s’assurer que la seringue peut contenir la solution de saccharose sans goutte avant de mettre en place les gradients.
5. Ajouter 2 mL du saccharose à 7 % au fond de chaque tube de centrifugation.
6. Ajouter 2 mL du saccharose à 17 % sous la solution à 7 % en positionnant l’extrémité de l’aiguille à proximité immédiate du fond du tube et en distribuant la solution lentement et soigneusement.
7. Répéter avec 2 mL chacune des solutions de saccharose à 27 %, 37 % et 47 %. S’assurer que chaque couche se distingue les unes des autres par une ligne marquant la séparation des densités (figure 2).
   NOTE: Si les gradients ne doivent pas être utilisés dans les 48 heures, à ce stade, avant leur décantation dans un gradient continu, congeler les tubes avec des solutions de saccharose en couches dans de l’azote liquide et les stocker dans un congélateur à -80 ° C pour un stockage à long terme.
8. Conserver les gradients à 4 °C pendant la nuit pour permettre aux gradients de se déposer dans un pourcentage continu et croissant de saccharose. Il faut 8 à 12 h pour que les solutions de saccharose stratifiées se déposent dans un gradient linéaire de saccharose. Les gradients linéaires sont stables jusqu’à 48 h. Le stockage de nuit à 4 °C offre suffisamment de temps pour la décongélation et le tassement dans un gradient linéaire pour l’utilisation de solutions de saccharose congelées et stratifiées. Utilisez un densitomètre pour évaluer la qualité du gradient.
   REMARQUE: Il est essentiel de stocker les gradients dans un endroit stable où ils ne seront pas dérangés, car tout mouvement ou vibration perturbera le gradient.

2. Préparation d’extraits de cellules de levure

1. Inoculer la souche de levure d’intérêt dans 50 mL de milieu dextrose peptonique extrait de levure (YPD) et cultiver pendant la nuit à 30 °C dans un incubateur à agitation jusqu’à la phase stationnaire.
   REMARQUE: La température peut varier en fonction des exigences de la souche de levure.
2. Transférer 10 mL de culture en phase stationnaire dans 1 L de milieu frais YPD. Incuber les cellules en agitant vigoureusement à 30 °C (ou à une autre température appropriée) jusqu’à ce que la culture atteigne la phase de croissance exponentielle moyenne (DO₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. À la phase de croissance exponentielle moyenne, ajouter du cycloheximide à la culture à une concentration finale de 0,1 mg/mL. Incuber sur la glace pendant 5 min.
4. Récolter les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE: À ce stade, les cellules peuvent être congelées et stockées à -80 ° C.
5. Resuspendre les cellules dans 700 μL réfrigérés de tampon d’extraction de polysomes (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/mL de cycloheximide, 0,2 mg/mL d’héparine). Ajouter 100 unités d’inhibiteur de RNase et transférer-le dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
6. Ajouter ~400 μL de billes de verre pré-refroidies avec une gamme de taille de 425-600 μm dans le tube de centrifugation. Perturber les cellules de levure par une agitation vigoureuse dans un batteur à billes pendant 5 min.
7. Clarifier le lysat par centrifugation à 8 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
8. Déterminer la concentration de l’ARN dans le lysat clarifié en mesurant l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre ou en utilisant un système de détection d’ARN basé sur la fluorescence.
   REMARQUE: Pour des mesures très précises de la concentration d’ARN, utilisez des kits de détection d’ARN basés sur la fluorescence.
9. S’assurer que la concentration d’ARN est de 0,5 à 1 μg/μL. Si la concentration d’ARN est trop faible, réduire le volume de tampon d’extraction de polysomes utilisé pour remettre les cellules en suspension dans de futures expériences.
   REMARQUE: Chargez le lysat sur les gradients immédiatement après la lyse et la quantification de l’ARN. Si nécessaire, congeler les lysats dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C pendant quelques jours.

3. Centrifugation des gradients

1. Chargez soigneusement le lysat sur le dessus des dégradés. Placez l’embout de la pipette contre la paroi intérieure, en haut du tube en polypropylène. Inclinez doucement le tube et distribuez lentement le lysat sur le dessus de la pente en dribblant contre le mur. Prenez grand soin de ne pas perturber ou perturber le gradient lors du chargement du lysat.
   REMARQUE: La quantité de lysat chargée varie selon le type de cellule. Le contenu de l’ARN variera également. Il peut être nécessaire d’effectuer un certain nombre d’expériences pour déterminer la quantité de lysat nécessaire pour générer un profil polysomique optimal. Pour la levure, 300 μg d’ARN est un bon point de départ pour l’optimisation.
2. Placez délicatement les tubes dans les godets pré-refroidis d’un rotor de godet oscillant.
   NOTE: Chaque tube centrifuge en polypropylène doit avoir des volumes égaux de gradient et la quantité de lysat chargée. Cela peut varier d’un tube à l’autre. Assurez-vous que la variation ne provoque pas d’erreur de déséquilibre lors de l’ultracentrifugation.
3. Centrifuger les gradients à 260,110 x g pendant 150 min à 4 °C.

4. Fraction et collecte de données

1. Retirez délicatement les tubes de centrifugation du rotor du godet oscillant et placez-les dans un porte-tube.
2. Étiqueter les plaques de 96 puits pour stocker les fractions et prérefroidir sur de la glace.
   NOTE: Utilisez une plaque de 96 puits adaptée à un spectrophotomètre doté d’une fenêtre optique allant jusqu’à 230 nm pour les déterminations d’acides nucléiques à 260 nm/280 nm.
3. Recueillir des fractions de 100 μL ou 200 μL en partant du haut du gradient en insérant soigneusement une pointe de pipette dans le haut du gradient. Recueillir les fractions jusqu’à ce que tout le gradient soit aliquote. Le nombre de fractions dépendra du volume total du gradient.
   Remarque : Collectez les fractions d’une manière qui ne perturbe pas le reste du gradient. Assurez-vous que toutes les fractions ont le même volume. En plus du fractionnement manuel, une autre méthode de fractionnement peu coûteuse consiste à utiliser une petite pompe péristaltique.
4. Transférer chaque fraction dans la plaque de 96 puits pour atteindre le fond du tube à centrifuger. Conservez les fractions recueillies sur la glace en tout temps.
5. Mesurer l’absorbance de chaque fraction à 254 nm avec un spectrophotomètre. Utilisez les solutions de saccharose à 7 % et à 47 % comme blancs.
   REMARQUE: Lors de la mesure de l’absorbance des fractions, gardez à l’esprit que pour la plupart des spectromètres et colorimètres, la plage d’absorbance la plus efficace est de 0,1-1. Si les mesures d’absorbance sont hors de la plage (≥1,0), les fractions ont trop de matière. Diluer l’échantillon, prélever les données, puis tenir compte du facteur de dilution lors du tracé du profil.
6. Créez le profil polysomique en traçant le nombre de fractions en fonction de l’absorbance.

Résultats

Trois profils de polysomes représentatifs sont présentés à la figure 3. Tous les profils proviennent de la même souche de levure. Un profil polysomique typique aura des pics bien résolus pour les sous-unités ribosomales 40S, 60S et 80S ainsi que pour les polysomes. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic de polysome sera apparente sur chaque profil (Figure 3). Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité es...

Discussion

Ici, une méthode pour créer des profils polysomiques sans utiliser de systèmes de fractionnement automatisés coûteux a été décrite. L’avantage de cette méthode est qu’elle rend le profilage des polysomes accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de systèmes de fractionnement automatisés. Les principaux inconvénients de ce protocole sont le fractionnement manuel fastidieux et la sensibilité réduite par rapport au système de fractionnement de densité dédié.

Ce protoc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801