Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Zusammenfassung

Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem Ribosomenprofile erstellt, spezifische mRNAs identifiziert werden können, die von Ribosomen übersetzt werden, und Polysomen-assoziierte Faktoren analysiert werden können. Während automatisierte Gradientenhersteller und Gradientenfraktionierungssysteme häufig mit dieser Technik verwendet werden, sind diese Systeme im Allgemeinen teuer und können für Laboratorien, die über begrenzte Ressourcen verfügen oder die Kosten aufgrund ihrer seltenen oder gelegentlichen Notwendigkeit, diese Methode für ihre Forschung durchzuführen, unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Polysomenprofilen mit Standardgeräten vorgestellt, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien ohne spezielle Fraktionierungsinstrumente verfügbar sind. Darüber hinaus wird ein Vergleich von Polysomenprofilen bereitgestellt, die mit und ohne Gradientenfraktionierungssystem erzeugt wurden. Strategien zur Optimierung und Herstellung reproduzierbarer Polysomenprofile werden diskutiert. Saccharomyces cerevisiae wird in diesem Protokoll als Modellorganismus verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch leicht modifiziert und angepasst werden, um Ribosomenprofile für viele verschiedene Organismen und Zelltypen zu erstellen.

Einleitung

Ribosomen sind Mega-Dalton-Ribonukleoproteinkomplexe, die den grundlegenden Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine durchführen. Ribosomen sind für die Synthese aller Proteine innerhalb einer Zelle verantwortlich. Eukaryotische Ribosomen umfassen zwei Untereinheiten, die entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten als kleine ribosomale Untereinheit (40S) und große ribosomale Untereinheit (60S) bezeichnet werden. Das vollständig zusammengesetzte Ribosom wird als 80S-Monosom bezeichnet. Polysomen sind Gruppen von Ribosomen, die an der Übersetzung eines einzelnen mRNA-Moleküls beteiligt sind. Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist eine leistungsstarke Methode, um Ribosomenprofile zu erstellen, spezifische mRNAs zu identifizieren, die mit der Translation von Ribosomen assoziiert sind, und Polysomen-assoziierte Faktoren^{zu analysieren} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^,13. Diese Technik wird häufig verwendet, um Polysomen von einzelnen Ribosomen, ribosomalen Untereinheiten und Boten-Ribonukleoproteinpartikeln zu trennen. Die durch Fraktionierung erhaltenen Profile können wertvolle Informationen über die Translationsaktivität der Polysomen¹⁴ und den Assemblierungsstatus der Ribosomen^15,16,17 liefern.

Ribosomenanordnung ist ein sehr komplexer Prozess^, der durch eine Gruppe von Proteinen erleichtert wird, die als Ribosomen-Assemblierungsfaktoren 18,19,20,21 bekannt sind. Diese Faktoren erfüllen eine breite Palette von Funktionen während der Ribosomenbiogenese durch Wechselwirkungen mit vielen anderen Proteinen, einschließlich ATPasen, Endo- und Exonukleasen, GTPasen, RNA-Helikasen und RNA-bindenden Proteinen²². Die Polysomenfraktionierung war ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle dieser Faktoren bei der Ribosomenanordnung zu untersuchen. Zum Beispiel wurde diese Methode verwendet, um zu zeigen, wie Mutationen in der Polynukleotidkinase Grc3, einem prä-rRNA-Verarbeitungsfaktor, den Ribosomenzusammenbauprozess negativ beeinflussen können^17,23. Die Polysomenprofilierung hat auch hervorgehoben und gezeigt, dass die konservierten Motive in der ATPase Rix7 für die Ribosomenproduktion¹⁶ unerlässlich sind.

Das Verfahren zur Polysomenfraktionierung beginnt mit der Herstellung löslicher Zelllysate aus Zellen von Interesse. Das Lysat enthält RNA, ribosomale Untereinheiten und Polysomen sowie andere lösliche zelluläre Komponenten. In einem Ultrazentrifugenröhrchen wird ein kontinuierlicher, linearer Saccharosegradient erzeugt. Die lösliche Fraktion des Zelllysats wird sanft auf die Oberseite des Saccharosegradientenröhrchens geladen. Das beladene Gradientenrohr wird dann einer Zentrifugation unterzogen, die die zellulären Komponenten innerhalb des Saccharosegradienten durch die Schwerkraft nach Größe trennt. Die größeren Komponenten fahren weiter in den Gradienten hinein als die kleineren Komponenten. Die Oberseite des Gradienten beherbergt die kleineren, langsamer reisenden Zellkomponenten, während sich die größeren, schneller reisenden Zellkomponenten unten befinden. Nach der Zentrifugation wird der Inhalt des Röhrchens als Fraktionen gesammelt. Diese Methode trennt effektiv ribosomale Untereinheiten, Monosomen und Polysomen. Die optische Dichte jeder Fraktion wird dann durch Messung der spektralen Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm bestimmt. Die Darstellung von Absorption vs. Fraktionszahl ergibt ein Polysomenprofil.

Lineare Saccharosedichtegradienten können mit einem Gradientenmacher erzeugt werden. Nach der Zentrifugation werden die Gradienten oft fraktioniert und die Absorptionen mit einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem 3,7,13,24,25 gemessen. Während diese Systeme sehr gut funktionieren, um Polysomenprofile herzustellen, sind sie teuer und können für einige Labore unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von Polysomenprofilen ohne den Einsatz dieser Instrumente vorgestellt. Stattdessen verwendet dieses Protokoll Geräte, die normalerweise in den meisten molekularbiologischen Laboratorien verfügbar sind.

Protokoll

1. Herstellung von 7% - 47% Saccharosegradienten

HINWEIS: Der lineare Bereich des Saccharosegradienten kann je nach verwendetem Zelltyp modifiziert werden, um eine bessere Trennung zu erreichen. Dieses Protokoll ist für Polysomenprofile für S. cerevisiae optimiert.

1. Stammlösungen von 7% und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM_MgCl2 und 1 mM DTT) herzustellen. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durch einen 0,22 μm Filter und lagern bei 4 °C.
2. Bereiten Sie 14 ml 17%, 27% und 37% Saccharoselösungen durch Dosieren und Mischen der 7%igen und 47%igen Saccharose-Stammlösungen in der in Tabelle 1 beschriebenen Weise her.
3. Legen Sie sechs Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (14 x 89 mm) in ein Vollsicht-Reagenzglas-Rack. Sorgen Sie für genügend Platz zwischen den Rohren, damit Aktionen mit einem Schlauch die anderen nicht stören.
4. Befestigen Sie eine lange Nadel an einer 3-ml-Spritze. Verwenden Sie für dieses Protokoll eine 9-Zoll-Nadel mit 22 G und einer stumpfen Spitze (Abbildung 1), aber jede Nadel, die lang genug ist, um den Boden des Zentrifugenröhrchens zu erreichen, reicht aus.
   HINWEIS: Führen Sie eine Testfüllung und Dispensation durch, um sicherzustellen, dass die Spritze die Saccharoselösung ohne Tropfen halten kann, bevor Sie die Farbverläufe einrichten.
5. Geben Sie 2 ml der 7% igen Saccharose auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens.
6. Fügen Sie 2 ml der 17% igen Saccharose unter die 7% ige Lösung hinzu, indem Sie die Nadelspitze in unmittelbarer Nähe des Röhrchenbodens positionieren und die Lösung langsam und vorsichtig dosieren.
7. Wiederholen Sie dies mit je 2 ml der 27%, 37% und 47% igen Saccharoselösungen. Stellen Sie sicher, dass jede Schicht durch eine Linie voneinander unterscheidbar ist, die den Abstand der Dichten markiert (Abbildung 2).
   HINWEIS: Wenn die Gradienten nicht innerhalb von 48 Stunden verwendet werden, frieren Sie die Röhrchen zu diesem Zeitpunkt vor ihrer Setzung in einen kontinuierlichen Gradienten mit geschichteten Saccharoselösungen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.
8. Lagern Sie die Steigungen über Nacht bei 4 °C, damit sich die Steigungen zu einem kontinuierlichen, steigenden Saccharoseanteil absetzen können. Es dauert 8-12 Stunden, bis sich die geschichteten Saccharoselösungen zu einem linearen Saccharosegradienten absetzen. Lineare Gradienten sind bis zu 48 h stabil. Die Lagerung über Nacht bei 4 °C bietet ausreichend Zeit zum Auftauen und Absetzen in einem linearen Gradienten für die Verwendung von gefrorenen, geschichteten Saccharoselösungen. Verwenden Sie ein Densitometer, um die Gradientenqualität zu beurteilen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Gradienten an einem stabilen Ort zu lagern, an dem sie nicht gestört werden, da Bewegungen oder Vibrationen den Gradienten stören.

2. Herstellung von Hefezellextrakten

1. Impfen Sie den interessierenden Hefestamm in 50 ml Hefeextrakt-Peptondextrose-Medien (YPD) und wachsen Sie über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator in die stationäre Phase.
   HINWEIS: Die Temperatur kann je nach Hefestammanforderungen variieren.
2. 10 mL stationäre Phasenkultur in 1 L frisches YPD-Medium überführen. Inkubieren Sie die Zellen mit kräftigem Schütteln bei 30 °C (oder einer anderen geeigneten Temperatur), bis die Kultur die mittlere exponentielle Wachstumsphase erreicht (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. In der mittleren exponentiellen Wachstumsphase wird der Kultur Cycloheximid in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml zugesetzt. Auf Eis 5 min inkubieren.
4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können Zellen eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.
5. Resuspendieren Sie die Zellen in gekühltem 700 μL Polysomenextraktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml Cycloheximid, 0,2 mg/ml Heparin). Fügen Sie 100 Einheiten RNase Inhibitor hinzu und geben Sie es in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
6. Fügen Sie ~400 μL vorgekühlte Glasperlen mit einem Größenbereich von 425-600 μm in das Zentrifugenröhrchen hinzu. Die Hefezellen durch kräftiges Rühren in einem Perlenschläger für 5 min aufbrechen.
7. Das Lysat wird durch Zentrifugieren bei 8.000 x g für 5 min bei 4 °C geklärt.
8. Bestimmen Sie die Konzentration der RNA im geklärten Lysat, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer oder mit einem fluoreszenzbasierten RNA-Detektionssystem messen.
   HINWEIS: Für sehr genaue RNA-Konzentrationsmessungen verwenden Sie fluoreszenzbasierte RNA-Detektionskits.
9. Stellen Sie sicher, dass die RNA-Konzentration 0,5-1 μg/μL beträgt. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, reduzieren Sie das Volumen des Polysomenextraktionspuffers, der zur Resuspendierung der Zellen in zukünftigen Experimenten verwendet wird.
   HINWEIS: Laden Sie das Lysat unmittelbar nach der Lyse und RNA-Quantifizierung auf die Gradienten. Bei Bedarf die Lysate in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und einige Tage bei -80 °C lagern.

3. Zentrifugation von Gradienten

1. Laden Sie das Lysat vorsichtig auf die Oberseite der Farbverläufe. Platzieren Sie die Pipettenspitze an der Innenwand an der Oberseite des Polypropylenrohrs. Winkeln Sie das Röhrchen vorsichtig an und dosieren Sie das Lysat langsam auf die Oberseite des Gefälles, indem Sie gegen die Wand tropfen. Achten Sie sehr darauf, den Farbverlauf beim Laden des Lysats nicht zu stören oder zu stören.
   HINWEIS: Die Menge an geladenem Lysat variiert je nach Zelltyp. Der Inhalt der RNA variiert ebenfalls. Es kann notwendig sein, eine Reihe von Experimenten durchzuführen, um die Menge an Lysat zu bestimmen, die benötigt wird, um ein optimales Polysomenprofil zu erzeugen. Für Hefe sind 300 μg RNA ein guter Ausgangspunkt für die Optimierung.
2. Legen Sie die Rohre vorsichtig in die vorgekühlten Eimer eines schwingenden Schaufelrotors.
   HINWEIS: Jedes Polypropylen-Zentrifugenröhrchen sollte gleiche Gradientenvolumina und die Menge des beladenen Lysats aufweisen. Dies kann von Röhre zu Röhre variieren. Stellen Sie sicher, dass die Variation während der Ultrazentrifugation keinen Unwuchtfehler verursacht.
3. Zentrifugieren Sie die Gradienten bei 260.110 x g für 150 min bei 4 °C.

4. Fraktion und Datenerhebung

1. Nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen vorsichtig aus dem schwingenden Schaufelrotor und legen Sie sie in einen Tubenhalter.
2. Beschriften Sie die 96-Well-Platten, um die Fraktionen zu lagern und auf Eis vorzukühlen.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die für ein Spektralphotometer mit einem optischen Fenster bis hinunter zu 230 nm für Nukleinsäurebestimmungen bei 260 nm/280 nm geeignet ist.
3. Sammeln Sie 100 μL oder 200 μL Fraktionen ausgehend von der Oberseite des Gradienten, indem Sie vorsichtig eine Pipettenspitze in die Oberseite des Gradienten einführen. Sammeln Sie Brüche, bis der gesamte Farbverlauf aliquotiert ist. Die Anzahl der Fraktionen hängt vom Gesamtgradientenvolumen ab.
   HINWEIS: Sammeln Sie die Brüche so, dass der Rest des Farbverlaufs nicht unterbrochen wird. Stellen Sie sicher, dass alle Fraktionen das gleiche Volumen haben. Neben der manuellen Fraktionierung ist eine weitere kostengünstige Methode zur Fraktionierung die Verwendung einer kleinen Schlauchpumpe.
4. Übertragen Sie jede Fraktion auf die 96-Well-Platte, um den Boden des Zentrifugenröhrchens zu erreichen. Bewahren Sie die gesammelten Fraktionen immer auf dem Eis auf.
5. Messen Sie die Absorption jeder Fraktion bei 254 nm mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie die 7% und 47% Saccharoselösungen als Leerzeichen.
   HINWEIS: Beachten Sie bei der Messung der Absorption von Fraktionen, dass für die meisten Spektrometer und Kolorimeter der effektivste Absorptionsbereich 0,1-1 beträgt. Wenn die Absorptionsmessungen außerhalb des Bereichs liegen (≥1,0), haben die Fraktionen zu viel Material. Verdünnen Sie die Probe, sammeln Sie die Daten erneut und berücksichtigen Sie dann den Verdünnungsfaktor beim Zeichnen des Profils.
6. Erstellen Sie das Polysomenprofil, indem Sie die Fraktionszahl im Vergleich zur Absorption aufzeichnen.

Ergebnisse

In Abbildung 3 sind drei repräsentative Polysomenprofile dargestellt. Alle Profile stammen vom gleichen Hefestamm. Ein typisches Polysomenprofil hat gut aufgelöste Peaks für die ribosomalen Untereinheiten 40S, 60S und 80S sowie Polysomen. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar (Abbildung 3). Ein repräsentatives Profil eines automatisierten Dichtefraktionierungssystems ist in Abbildu...

Diskussion

Hier wurde eine Methode beschrieben, um Polysomenprofile ohne den Einsatz teurer automatisierter Fraktionierungssysteme zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Polysomenprofilierung für Labore zugänglich macht, die nicht über automatisierte Fraktionierungssysteme verfügen. Die Hauptnachteile dieses Protokolls sind die langwierige Handfraktionierung und die reduzierte Empfindlichkeit im Vergleich zum dedizierten Dichtefraktionierungssystem.

Dieses Protokoll bein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801