JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول الخطوات المتخذة لتشريح المبايض في المياه العذبة ، Schmidtea mediterranea. المبيضان المقطعان متوافقان مع التلوين المناعي للأجسام المضادة والتحليل الفائق مع المجهر الإلكتروني النافذ لدراسة بيولوجيا الخلية للبويضات والخلايا الجسدية ، مما يوفر عمق وجودة تصوير لم يكن من الممكن الوصول إليها من قبل.

Abstract

تسمح إمكانية الوصول إلى الخلايا الجرثومية بدراسة تطور الخلايا الجرثومية والانقسام الاختزالي وإعادة التركيب. النمط الحيوي الجنسي لمستوي المياه العذبة ، Schmidtea mediterranea ، هو نموذج لافقاري قوي لدراسة المواصفات اللاجينية للخلايا الجرثومية. على عكس العدد الكبير من الخصية والخلايا الجرثومية الذكرية ، يصعب نسبيا تحديد موقع البويضات المستوية وفحصها ، حيث لا يوجد سوى مبيضين ، يحتوي كل منهما على 5-20 بويضة. كما أن التوطين الأعمق داخل الجسم المستوي ونقص الأنسجة الظهارية الواقية يجعل من الصعب تشريح المبايض المستوية مباشرة.

يستخدم هذا البروتوكول خطوة تثبيت قصيرة لتسهيل توطين وتشريح المبايض المستوية لتحليل المصب للتغلب على هذه الصعوبات. المبيض التشريحي متوافق مع الفحص الفائق عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) والمناعة للأجسام المضادة. تسمح تقنية التشريح الموضحة في هذا البروتوكول أيضا بإجراء تجارب اضطراب الجينات ، حيث يتم فحص المبايض في ظل ظروف تداخل الحمض النووي الريبي المختلفة (RNAi). سيؤدي الوصول المباشر إلى الخلايا الجرثومية السليمة في المبيض التي حققها هذا البروتوكول إلى تحسين عمق التصوير وجودته بشكل كبير والسماح بالاستجواب الخلوي ودون الخلوي لبيولوجيا البويضة.

Introduction

تم فحص التشريح المستوي باستخدام TEM في العديد من الأنسجة1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فقد تم إيلاء القليل من الاهتمام للمبيض أو البويضات. ترجع ندرة أدبيات البويضات جزئيا إلى صعوبة الوصول إلى هذه الخلايا ، مما يترك بيولوجيا البويضات المستوية غير مستكشفة إلى حد كبير. كشفت الأدوات الجزيئية عن العديد من الآليات التنظيمية لتطور المبيض في المستويات باستخدام المجهر الضوئي أو الفلوري7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. تم إجراء كل هذه التجارب على ديدان كاملة أو أقسام نسيجية من الديدان الكاملة. تتضمن بروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة والتهجين في الموقع على الديدان الكاملة خطوات تبييض وغسيل وتنظيف الأنسجة على نطاق واسع ، والتي تستغرق وقتا طويلا وستستغرق عدة أيام.

الهدف العام من الطريقة الموصوفة هنا هو توفير إمكانية الوصول إلى المبايض والبويضات المستوية السليمة والتشريح ، والتي ستزيل ضرورة التبييض أو التقسيم النسيجي وتقصير وقت الغسيل وتنظيف الأنسجة في تلطيخ الأجسام المضادة والتهجين في الموقع. ستعمل المبايض المشرحة أيضا على تحسين اختراق المسبار أو الأجسام المضادة وزيادة عمق التصوير وجودته للمجاهر الضوئية والإلكترونية. تسمح إمكانية الوصول إلى المبيضين والبويضات المشرحة بإجراء أبحاث بيولوجيا الخلية بدقة خلوية وتحت خلوية مع بويضات سليمة كاملة. وصفت دراسة حديثة على المبايض المستوية المشرحة الانقسام الاختزالي البويضي المستوي لأول مرة باستخدام TEM والفحص المجهري متحد البؤر21. قدم العمل وصفا شاملا لظاهرة جديدة أثناء الانقسام الاختزالي تسمى حويصلة الغلاف النووي.

هنا ، نقدم الإجراءات التفصيلية في تشريح المبايض المستوية. كانت خطوة التثبيت كافية للحفاظ على بنية خلية المبيض للتشريح والمعالجة النهائية (أي المعالجة لتحليل TEM والمجهر الضوئي). نظرا لتشابهها في خطط الجسم وبنية الأنسجة ، يجب أن يكون هذا البروتوكول مفيدا على نطاق واسع لدراسة البويضات ونواتها في العديد من أنواع Platyhelminthes الأخرى (على سبيل المثال ، جنس Dugesia أو Polycelis). من المحتمل أن يكون هذا البروتوكول غير ذي صلة ب Macrostomum lignano لأحجامها الصغيرة وبنية جسمها شبه الشفافة ، مما سيسمح بالمراقبة المباشرة للمبيض والبويضات22،23،24. يمكن تمييز منطقة الجسم التي تحتوي على المبايض بصريا (على سبيل المثال ، مصطبغة داكنة أو مصطبغة أفتح) في بعض الأنواع (على سبيل المثال ، Dugesia ryukyuensis9،25) من S. mediterranea. يمكن أن تعتمد الدراسات في هذه الأنواع بشكل أقل على المبادئ التوجيهية لتحديد موقع المبايض في S. mediterranea المعروضة هنا ولكنها تستفيد من ظروف التثبيت والتشريح.

Protocol

1. التحضير

  1. تحضير الديدان: إطعام المستويات الجنسية مرتين في الأسبوع مع معجون الكبد العضوي لتحقيق النضج الجنسي.
    ملاحظة: بشكل عام ، هذه الديدان أكبر من 1 سم في الطول ولها فتحة البنوبور الخلفية لفتحة البلعوم.
  2. إعداد الحلول.
    1. تحضير الكواشف التالية: 16 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) ؛ 50 ٪ غلوتارالدهيد (GA) محلول مائي ؛ N-أسيتيل-L-السيستين (NAC); 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.7 مللي مول KCl ، 8 مللي مول Na2HPO4 ، و 2 مللي مول KH2PO4.
    2. تمييع 50٪ GA و 16٪ PFA مع PBS إلى خليط نهائي من 2.5٪ GA و 2٪ PFA. تمييع 16٪ PFA مع PBS إلى تركيز نهائي قدره 4٪ PFA.
    3. قم بإذابة 5 جم من NAC في 100 مل من PBS لعمل محلول عمل بنسبة 5٪.

2. جمع المبايض

  1. عالج الديدان الناضجة جنسيا بنسبة 5٪ NAC في طبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: قد تتجعد الديدان الكبيرة. يمكن استخدام الفرش أو أطراف الماصة لتسطيح الديدان. كمية 5٪ NAC المستخدمة ضئيلة ، كافية لتغطية سطح طبق بتري.
  2. استبدل NAC ب 10 مل من بارافورمالدهيد 4٪ طازجة وثبت الديدان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز العرضي. ابدأ التشريح بعد 10 دقائق من إضافة 4٪ PFA ، وقم بإجراء التشريح في 4٪ PFA حيث يتم إصلاح الديدان.
  3. راقب التصبغ الظهاري لتحديد موقع الحبال العصبية البطنية ، والتي تظهر على شكل خطين مع تصبغ أخف يمتد من العقد الرأسية الأمامية باتجاه الذيل.
  4. حدد موقع المبايض.
    ملاحظة: يقع المبيض بجوار الحبل العصبي على الجانب الإنسي (الشكل 1 أ). اعتمد على تصبغ الظهارة لتحديد موضع المبيض في الاتجاه الأمامي الخلفي. من الناحية المثالية ، يكون تصبغ الظهارة البطنية في منطقة المبيض أخف من المناطق المحيطة. في بعض الديدان ، لا يوفر تصبغ الظهارة البطنية ثقة كافية. يمكن التخلص من هذه الديدان لأن بعضها قد لا يحتوي على مبايض متطورة.
  5. تحقق من صحة مواضع المبايض بمجرد تحديد موقع المبايض المفترضة عن طريق التصبغ.
    ملاحظة: أولا ، المبيضان خلفيان للعقد الرأسية. ثانيا ، تكون الخصيتان الداكنتان اللون جانبيتين للسطح الظهري فوق المبيض. يقع المبيضان أمام الخصية الأمامية (الشكل 1 ب). في بعض الأحيان ، يتم وضع فصوص الخصية على مستوى المبيضين أو أمامهما قليلا.
  6. استخدم سكاكين جراحية لقطع المبيضين الخلفي والأمامي (الشكل 1C) لإزالة شظايا الدودة الأمامية والخلفية تماما. استخدم سكينا واحدا لتثبيت الدودة وتنظيف السكين الآخر المستخدم في إجراء الجروح.
  7. قطع في الخط الأوسط من جزء المبيض لفصل المبيضين. اقلب الجزء ليكون الجانب البطني لأسفل.
  8. انزع الأنسجة الظهرية لكشف القناة الهضمية (الشكل 1 د) بزوجين من الملقط المدبب (النوع 5-SA).
    ملاحظة: يقع المبيض على شكل قبة تحت فروع الأمعاء.
  9. قم بإزالة فروع الأمعاء الموجودة فوق الأنسجة البطنية برفق باستخدام طرف الملقط أو فرشاة ناعمة لكشف المبيض (الشكل 1E).
  10. قم بإزالة الأنسجة المحيطة لإخراج المبيض (الشكل 1F ، G).
  11. أخرجي المبيضين وانقليهما إلى أنبوب سعة 1.5 مل لغسلهما ب 1 مل من برنامج تلفزيوني.

3. التثبيت ل TEM

  1. اغسل المبايض في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق مع هز لطيف. حافظ على الأنابيب في وضع مستقيم ، واترك المبايض تغرق في القاع بفعل الجاذبية. كرر الغسيل مرة واحدة.
    ملاحظة: إذا لم يغرق المبيضان ، فقم بتطبيق دوران لطيف لمدة 15 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (السرعة القصوى 2000 × جم).
  2. استبدل PBS ب 2٪ PFA / 2.5٪ GA / PBS.
  3. إصلاح العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر عند 40 دورة في الدقيقة.
  4. احتفظ بالعينات في وضع مثبت عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر عند 40 دورة في الدقيقة.

4. معالجة العينات ل TEM

  1. اغسل المبيضين في برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  2. اغسل المبيضين في ماء مقطر مزدوج (ddH2O) 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  3. بعد تثبيت المبايض في 2٪ مائي OsO4 لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب إغلاق حاويات العينات ببارافيلم خلال هذه الخطوة. تحضير 2٪ OsO4 بالماء المعالج بالتناضح العكسي (انظر جدول المواد).
  4. شطف العينات مع ddH2O 3 مرات ، 10 دقائق لكل منهما.
  5. قم بصبغ المبيضين مسبقا في 2٪ من أسيتات اليورانيل المائية (UA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب تصفية محلول UA قبل الاستخدام ؛ تجنب الضوء أثناء تلطيخ الكتلة الداخلية . تحضير 2٪ OsO4 بالماء المعالج بالتناضح العكسي (انظر جدول المواد).
  6. شطف العينات في ddH2O 4 مرات مع تحريض لطيف ، 10 دقائق لكل منهما.
  7. قم بتجفيف المبيضين في سلسلة إيثانول متدرجة (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 95٪ ، ومرتين 100٪ ، 10 دقائق لكل محلول) ثم قم بموازنتها في حضانتين (10 دقائق) في أكسيد البروبيلين.
  8. للتسلل بالراتنج ، احتضان العينات في خليط 50٪ أكسيد البروبيلين / 50٪ راتنجات الايبوكسي السائل طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تسلل العينات براتنجات الايبوكسي 100٪ مع 3 تغييرات (1 ساعة لكل تغيير) مع تحريض لطيف.
  9. قم بتضمين المبايض في راتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ وقم ببلمرة الراتنج عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

5. بضع الميكروبات

  1. تقليم الكتلة وفحص العينة باستخدام المجهر الضوئي
    1. قم بقص كتل العينة إلى شكل هرمي باستخدام شفرة حلاقة.
    2. قطع أقسام بسمك 1-2 ميكرومتر بسكين زجاجي أو ماسي.
    3. انقل المقاطع إلى شريحة بها قطرة ماء ، ثم سخن الشريحة على طبق ساخن حتى تتسطح الأقسام وتلتصق بسطح الشريحة أثناء تبخر الماء.
    4. قم بتغطية الأقسام بقطرة 1٪ من التولويدين الأزرق O وقم بتسخينها على طبق ساخن لمدة ~ 10 ثوان. اشطف الشريحة بالماء الجاري ، ثم اتركها تجف. تحقق من الأقسام تحت المجهر الضوئي العادي.
  2. قطع المقاطع فائقة النحافة وجمعها وما بعد تلطيخها.
    1. قطع مقاطع رقيقة جدا بسمك 50-70 نانومتر بسكين الماس. انقل الأجزاء من قارب الماء السكين إلى شبكات شبكية أو نحاسية ذات فتحة واحدة.
    2. تلطيخ الأقسام في 2٪ UA لمدة 8 دقائق. اغسل الشبكات في تشغيل ddH2O لمدة 30 ثانية.
    3. تلطيخ الأقسام بمحلول رصاص 1٪ لمدة 6 دقائق. اغسل الأقسام في تشغيل ddH2O لمدة 1 دقيقة وجففها في الهواء.

6. جمع البيانات وتحليلها

  1. جمع بيانات TEM باستخدام البرامج المناسبة ، على سبيل المثال ، التصوير المجهري الرقمي (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل).
  2. تشغيل النطاق عند 80 كيلو فولت. أدخل شبكة العينة في النطاق عندما يكون الفراغ جاهزا.
  3. قم بتشغيل الشعاع بالنقر فوق Light في القائمة. أدر مقبض الشدة على لوحة التحكم اليسرى حتى يصبح وقت التعرض التلقائي ~ 1 ثانية. انقر فوق بدء الحصول للحصول على الصورة النهائية.
  4. إنشاء نماذج EM ثلاثية الأبعاد باستخدام حزمة معالجة الصور والنمذجة والعرض مفتوحة المصدر (IMOD).

7. تلطيخ الأجسام المضادة

  1. اغسل المبايض المشرحة (الخطوة 2.16) في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل مع 1 مل من 1x PBS مكمل ب 0.5٪ Triton X-100 (PBST). ضع الأنابيب على شاكر للتحريك عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. دع الأنابيب تقف في رف وتغرق المبايض بالجاذبية. استبدل الغسيل ب PBST الطازج ، وكرر مرتين.
  2. هضم الأنسجة مع 2 ميكروغرام / مل من Proteinase K و 0.1٪ دوديسيل سلفات الصوديوم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في PBST.
  3. اغسل المبايض المهضومة في PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
  4. احتضان المبايض مع مصل الحصان 10 ٪ في PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية من 1 إلى 100 في محلول الحجب (10٪ مصل الحصان في PBS مع 0.5٪ Triton X-100). احتضان المبايض بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  6. اغسل المبيضين في PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
  7. احتضان المبايض بالأجسام المضادة الثانوية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف. تمييع جميع الأجسام المضادة الثانوية 1: 300 في محلول حجب.
  8. اغسل المبيضين في PBST ثلاث مرات ، مع التأكد من أن الغسلتين الأولى والثالثة تدوم لمدة 10 دقائق. قم بتلطيخ نوى المبيض باستخدام Hoechst 33342 عند تخفيف 1: 300 في PBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الغسلة الثانية.
  9. جبل المبايض على الشرائح.
    ملاحظة: يمكن استخدام الحامل المضاد للبهتان لإطالة إشارات التألق.

النتائج

تم وصف الطريقة المعروضة هنا بواسطة Guo et al.21. مفتاح التشريح الناجح هو تحديد تصبغ المبيض وأدلة الموضع بشكل صحيح. تتمثل استراتيجية الطريقة في الانتقال من المواقف الواسعة إلى موقع معين. أولا ، لتحقيق ذلك ، اعتمد على أنماط التصبغ الظهرية والبطنية (الشك?...

Discussion

هذه الإجراءات القائمة على التثبيت لتشريح المبايض المستوية ستسهل فهم الانقسام الاختزالي للبويضات وكذلك تطور المبيض وتجديده. يمكن أن تتراوح أحجام البويضات وخلاياها الجسدية الداعمة من 20 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر. ستوفر الطرق القائمة على التشريح إمكانية الوصول إلى خلايا ال...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (LK و ASA) ومؤسسة هيلين هاي ويتني (LHG).

يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تقوم عليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710EM grade
2% aqueous OsO4Electron Microscopy Sciences19152
50% glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16320EM grade
Digital MicrographGatan Inc.Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resinElectron Microscopy Sciences14120Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
EthanolTed Pella19207Denatured
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Horse serumSigmaH1138
Lead AcetateElectron Microscopy Sciences6080564
MilliQ waterreverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Propylene oxideElectron Microscopy Sciences75569EM grade
 Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
Toluidine blue OElectron Microscopy Sciences92319
Transmission Electron MicroscopeFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences541093

References

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550 (1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69 (2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175 (2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364 (2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457 (2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030 (2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609 (2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607 (2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5 (2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120 (2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K., Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. . Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. , 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved