초고구조 분석 및 항체 염색을 위한 Planarian 난소 절제

요약

이 프로토콜은 담수 플라나리아( Schmidtea mediterranea )에서 난소를 해부하기 위해 취한 단계를 제시합니다.절개된 난소는 난모세포와 체세포의 세포 생물학을 연구하기 위해 투과 전자 현미경을 사용한 항체 면역염색 및 초구조 분석에 적합하며, 이전에는 접근할 수 없었던 이미징 깊이와 품질을 제공합니다.

초록

생식 세포에 대한 접근성은 생식 세포 발달, 감수분열 및 재조합을 연구할 수 있도록 합니다. 담수 플라나리아의 성적 생물형인 Schmidtea mediterranea 는 생식 세포의 후성유전학적 사양을 연구하기 위한 강력한 무척추동물 모델입니다. 많은 수의 고환 및 남성 생식 세포와 달리 플라나리아 난모세포는 각각 5-20개의 난모세포가 있는 두 개의 난소만 있기 때문에 찾고 검사하기가 상대적으로 어렵습니다. 플라나리아의 몸체 내의 더 깊은 국소화와 보호 상피 조직의 부족은 또한 플라나리아의 난소를 직접 해부하는 것을 어렵게 만듭니다.

이 프로토콜은 이러한 어려움을 극복하기 위해 다운스트림 분석을 위해 플라나리아 난소의 국소화 및 절개를 용이하게 하기 위해 간단한 고정 단계를 사용합니다. 절제된 난소는 투과 전자 현미경(TEM) 및 항체 면역염색에 의한 초미세 구조 검사에 적합합니다. 이 프로토콜에 설명된 절개 기술은 또한 다양한 RNA 간섭(RNAi) 조건에서 난소를 검사하는 유전자 섭동 실험을 허용합니다. 이 프로토콜에 의해 달성된 난소의 온전한 생식 세포에 직접 접근하면 이미징 깊이와 품질이 크게 향상되고 난모세포 생물학의 세포 및 세포 내 조사가 가능합니다.

서문

플라나리아 해부학은 많은 조직 ^1,2,3,4,5,6에서 TEM을 사용하여 조사되었습니다. 그러나 난소나 난모세포에 대해서는 거의 주목을 받지 못했습니다. 난모세포에 대한 문헌이 부족한 것은 부분적으로는 이러한 세포에 접근하기 어렵기 때문이며, 이로 인해 플라나리아 난모세포의 생물학은 대부분 탐구되지 않은 채로 남아 있습니다. 분자 도구는 광학 또는 형광 현미경을 사용하여 플라나리아에서 난소 발달의 많은 조절 메커니즘을 밝혀냈습니다 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . 이 모든 실험은 전체 벌레 또는 전체 벌레의 조직학적 절편에 대해 수행되었습니다. 전체 웜에 대한 항체 염색 및 현장 교잡 프로토콜에는 광범위한 표백, 세척 및 조직 투명화 단계가 포함되며, 이는 시간이 많이 걸리고 며칠이 걸립니다.

여기에 설명된 방법의 전반적인 목표는 온전하고 절개된 플라나리아 난소 및 난모세포에 대한 접근성을 제공하는 것이며, 이를 통해 표백 또는 조직학적 절편의 필요성을 제거하고 항체 염색 및 현장 교잡에서 세척 및 조직 투명화 시간을 단축할 수 있습니다.절제된 난소는 또한 프로브 또는 항체 침투를 개선하고 광학 및 전자 현미경의 이미징 깊이와 품질을 향상시킵니다. 절개된 난소와 난모세포에 대한 접근성은 온전한 전체 난모세포를 사용하여 세포 및 세포 내 해상도에서 세포 생물학 연구를 가능하게 합니다. 절제된 플라나리아 난소에 대한 최근 연구에서는 TEM 및 컨포칼 현미경을 사용하여 처음으로 플라나리아 난자 감수분열을 특성화했습니다²¹. 이 연구는 핵 외피 소포화(nuclear envelope vesiculation)라고 불리는 감수분열(meiosis) 동안의 새로운 현상에 대한 포괄적인 설명을 제공했다.

여기에서는 플라나리아 난소 해부의 자세한 절차를 제시합니다. 고정 단계는 절개 및 다운스트림 조작(즉, TEM 및 광학 현미경 분석을 위한 처리)을 위해 난소 세포 구조를 보존하기에 충분했습니다. 신체 계획과 조직 구조의 유사성을 감안할 때, 이 프로토콜은 다른 여러 Platyhelminthes 종(예: Dugesia 또는 Polycelis 속)에서 난모세포와 난모세포의 핵을 연구하는 데에도 광범위한 정보를 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 크기가 작고 거의 투명한 신체 구조로 인해 Macrostomum lignano와 관련이 없을 가능성이 높으며, 이를 통해 난소와 난모세포를 직접 관찰할 수 있습니다 22,23,24. 난소를 포함하는 신체 부위는 일부 종(예: Dugesia ryukyuensis ^9,25)에서 S. mediterranea보다 광학적으로 더 구별할 수 있습니다(예: 더 어두운 색소 또는 더 밝은 색소). 이 종에 대한 연구는 여기에 제시된 S. mediterranea의 난소 위치 지정 지침에 덜 의존할 수 있지만 고정 및 절개 조건을 활용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비

1. 벌레 준비: 성적 성숙을 달성하기 위해 일주일에 두 번 유기농 간 페이스트를 성적 플라나리아에게 먹이십시오.
   참고 : 일반적으로 이러한 벌레는 길이가 1cm 이상이며 인두 입구 뒤쪽에 임질이 있습니다.
2. 솔루션을 준비합니다.
   1. 다음 시약을 준비하십시오 : 16 % 파라 포름 알데히드 (PFA); 50% 글루타르알데히드(GA) 수용액; N-아세틸-L-시스테인(NAC); 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) : 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na₂HPO4 및 2mM KH2PO4.
   2. 50% GA 및 16% PFA를 PBS로 희석하여 2.5% GA 및 2% PFA의 최종 혼합물로 만듭니다. 16% PFA를 PBS로 희석하여 최종 농도 4% PFA로 만듭니다.
   3. NAC 5g을 PBS 100mL에 녹여 5% 작동하는 용액을 만듭니다.

2. 난소 수집

1. 성적으로 성숙한 벌레를 5% NAC로 실온의 접시에 담아 5분 동안 처리합니다.
   알림: 큰 벌레가 말릴 수 있습니다. 브러시 또는 피펫 팁을 사용하여 웜을 평평하게 할 수 있습니다. 사용된 5% NAC의 양은 페트리 접시의 표면을 덮을 만큼 최소화되었습니다.
2. NAC를 갓 준비한 4% 파라포름알데히드 10mL로 교체하고 실온에서 가끔 흔들어 1시간 동안 웜을 고정합니다. 4% PFA를 첨가한 후 10분 후에 해부를 시작하고 웜이 고정될 때 4% PFA로 해부를 수행합니다.
3. 상피 색소 침착을 관찰하여 복부 신경 삭을 찾습니다.이 척삭은 전방 두부 신경절에서 꼬리쪽으로 더 가벼운 색소 침착으로 두 줄로 나타납니다.
4. 난소를 찾습니다.
   참고: 난소는 내측의 신경삭 바로 옆에 있습니다(그림 1A). 상피 색소 침착에 의존하여 난소의 위치를 전후 방향으로 찾습니다. 이상적으로는 난소 부위의 복부 상피의 색소 침착이 주변 부위보다 가볍습니다. 일부 벌레에서는 복부 상피의 색소 침착이 충분한 신뢰를 제공하지 않습니다. 이 벌레는 일부 난소가 잘 발달하지 않았을 수 있으므로 폐기할 수 있습니다.
5. 추정 난소가 색소 침착에 의해 배치되면 난소의 위치를 확인합니다.
   참고: 첫째, 난소는 두핵(cephalic ganglia)의 후방에 있습니다. 둘째, 어두운 색의 고환은 난소 위의 등쪽 표면에 측면에 있습니다. 난소는 가장 앞쪽에 있는 고환 앞에 위치합니다(그림 1B). 때때로, 고환엽은 난소 수준 또는 난소보다 약간 앞쪽에 위치합니다.
6. 두 개의 수술용 칼을 사용하여 두 난소의 후방과 전방을 절단하여(그림 1C) 전방 및 후방 벌레 조각을 완전히 제거합니다. 한 칼을 사용하여 웜을 고정하고 절단에 사용된 다른 칼을 청소합니다.
7. 두 개의 난소를 분리하기 위해 난소 조각의 중간 선을 자릅니다. 복부 쪽이 아래로 향하도록 조각을 뒤집습니다.
8. 두 쌍의 뾰족한 핀셋(유형 5-SA)으로 장을 노출시키기 위해 등쪽 조직을 벗겨냅니다(그림 1D).
   참고: 돔 모양의 난소는 장 가지 아래에 있습니다.
9. 핀셋 끝이나 부드러운 브러시로 복부 조직 위에 있는 장 가지를 부드럽게 제거하여 난소를 노출시킵니다(그림 1E).
10. 난소를 꺼내기 위해 주변 조직을 제거합니다(그림 1F,G).
11. 난소를 꺼내 1.5mL 튜브로 옮겨 PBS 1mL로 세척합니다.

3. TEM에 대한 고정

1. PBS에서 부드럽게 흔들어 10분 동안 난소를 씻습니다. 난관을 똑바로 세우고 난소가 중력에 의해 바닥으로 가라앉도록 합니다. 세탁을 한 번 반복하십시오.
   알림: 난소가 가라앉지 않으면 미니 탁상용 원심분리기(최대 속도 2000 × g)로 15초 동안 부드럽게 회전시킵니다.
2. PBS를 2% PFA/2.5% GA/PBS로 교체합니다.
3. 40rpm의 셰이커에서 1시간 동안 실온에서 샘플을 고정합니다.
4. 샘플을 4°C의 고정액에 담아 40rpm의 셰이커에서 밤새 유지합니다.

4. TEM을 위한 시료 처리

1. PBS에서 난소를 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
2. 난소를 이중 증류수(ddH₂O)로 각각 3분 동안 10회 세척합니다.
3. 난소를 2% 수성 OsO₄ 에 담근 후 실온에서 1-2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 고정합니다.
   참고: 이 단계에서 샘플 용기를 파라필름으로 밀봉해야 합니다. 역삼투압 처리된 물로 2% OsO₄ 를 준비합니다( 재료 표 참조).
4. 샘플을 ddH₂O로 각각 10분씩 3회 헹굽니다.
5. 4°C에서 밤새 2% 수성 우라닐 아세테이트(UA)로 난소를 사전 염색합니다.
   참고: UA 솔루션은 사용하기 전에 필터링해야 합니다. en bloc 염색 중에는 빛을 피하십시오. 역삼투압 처리된 물로 2% OsO₄ 를 준비합니다( 재료 표 참조).
6. 샘플을 ddH₂O에서 각각 10분씩 부드러운 교반으로 4회 헹굽니다.
7. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(30%, 50%, 70%, 95%, 각 용액당 10분 100% 2회)로 난소를 탈수한 다음 프로필렌 옥사이드에서 두 번의 배양(10분)으로 평형을 이룹니다.
8. 수지로 침투시키려면 4°C에서 밤새 50% 프로필렌 옥사이드/50% 액체 에폭시 수지 혼합물에 샘플을 배양합니다. 부드러운 교반으로 100% 에폭시 수지를 3회 변경(각 1시간 변경)으로 샘플에 침투시킵니다.
9. 난소를 100% 에폭시 수지에 넣고 수지를 60°C에서 48시간 동안 중합합니다.

5. 초현미경 절제술

1. 광학 현미경을 사용한 블록 트리밍 및 샘플 확인
   1. 면도날로 샘플 블록을 피라미드 모양으로 자릅니다.
   2. 유리 또는 다이아몬드 나이프로 1-2 μm 두께의 부분을 자릅니다.
   3. 물 한 방울로 섹션을 슬라이드에 옮긴 다음 물이 증발하는 동안 섹션이 평평해지고 슬라이드 표면에 부착될 때까지 핫 플레이트에서 슬라이드를 가열합니다.
   4. 1% 톨루이딘 블루 O 한 방울로 섹션을 덮고 핫플레이트에서 ~10초 동안 가열합니다. 슬라이드를 흐르는 물로 헹구고 말리십시오. 일반 광학 현미경으로 단면을 확인하십시오.
2. 초박형 절편 절단, 수집 및 사후 염색.
   1. 다이아몬드 나이프로 50-70nm 두께의 초박형 부분을 자릅니다. 나이프 워터 보트의 단면을 메쉬 또는 단일 슬롯 구리 그리드로 옮깁니다.
   2. 8분 동안 2% UA의 섹션을 염색합니다. 2초 동안 실행 중인 ddH₃₀O에서 그리드를 세척합니다.
   3. 1% 납 용액으로 섹션을 6분 동안 염색합니다. 실행 중인 ddH₂O의 부분을 1분 동안 세척하고 자연 건조합니다.

6. 데이터 수집 및 분석

1. 적절한 소프트웨어(예: 디지털 현미경 사진)를 사용하여 TEM 데이터를 수집합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
2. 80kV에서 스코프를 작동하십시오. 진공이 준비되면 샘플 그리드를 스코프에 삽입합니다.
3. 메뉴에서 Light를 클릭하여 빔을 켭니다. 자동 노출 시간이 ~1초가 될 때까지 왼쪽 컨트롤 패드의 강도 노브를 돌립니다. Start Acquire(획득 시작)를 클릭하여 최종 이미지를 얻습니다.
4. 오픈 소스 IMOD(Image Processing, Modeling, and Display) 패키지를 사용하여 3차원 EM 모델을 구성합니다.

7. 항체 염색

1. 절개된 난소(2.16단계)를 1.5mL 미세분리 튜브에서 0.5% Triton X-100(PBST)이 보충된 1x PBS 1mL로 세척합니다. 40rpm에서 10분 동안 교반하기 위해 튜브를 셰이커에 놓습니다. 튜브를 랙에 세우고 난소는 중력에 의해 가라앉습니다. 세척제를 새 PBST로 교체하고 두 번 반복합니다.
2. 2μg/mL의 Proteinase K와 0.1% 소듐 도데실설페이트로 PBST의 실온에서 10분 동안 조직을 분해합니다.
3. 소화된 난소를 PBST에서 10분 동안 3회 세척합니다.
4. PBST에 10% 말 혈청으로 난소를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 차단 용액(0.5% Triton X-100이 포함된 PBS의 10% 말 혈청)에 1차 항체 1-100을 희석합니다. 1차 항체가 있는 난소를 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
6. PBST에서 난소를 10분 동안 세 번 세척합니다.
7. 2차 항체로 난소를 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다. 모든 2차 항체를 차단 용액에 1:300으로 희석합니다.
8. PBST에서 난소를 세 번 세척하여 첫 번째와 세 번째 세척이 10분 동안 지속되도록 합니다. 두 번째 세척에서 PBST에서 1:300 희석액으로 Hoechst 33342로 난소 핵을 염색하고 실온에서 30분 동안 염색합니다.
9. 난소를 슬라이드에 장착합니다.
   알림: 페이딩 방지 마운턴트를 사용하여 형광 신호를 연장할 수 있습니다.

결과

여기에 제시된 방법은 Guo et ^al.21에 의해 설명되었습니다. 성공적인 절개의 핵심은 난소 색소 침착을 식별하고 가이드를 올바르게 배치하는 것입니다. 이 방법의 전략은 넓은 위치에서 특정 위치로 이동하는 것입니다. 첫째, 이를 달성하기 위해 등쪽 및 배쪽 색소 침착 패턴에 의존합니다(그림 1A,B). 난소가 위치한 복부 ...

토론

플라나리아 난소를 해부하기 위한 이러한 고정 기반 절차는 난자 감수분열과 난소 발달 및 재생에 대한 이해를 용이하게 합니다. 난모세포와 체세포 지지 세포의 크기는 20μm에서 50μm까지 다양합니다. 절제 기반 방법은 절편 또는 전체 마운트 기반 방법으로는 달성할 수 없는 온전한 단일 난소 세포에 대한 접근성을 제공합니다. 이 프로토콜은 세포 및 세포 내 해상도에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM grade
2% aqueous OsO4	Electron Microscopy Sciences	19152
50% glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	EM grade
Digital Micrograph	Gatan Inc.		Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol	Ted Pella	19207	Denatured
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Horse serum	Sigma	H1138
Lead Acetate	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ water			reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	75569	EM grade
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Toluidine blue O	Electron Microscopy Sciences	92319
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	541093