Disección de ovario planario para análisis ultraestructural y tinción de anticuerpos

Resumen

Este protocolo presenta los pasos tomados para diseccionar los ovarios en las planarias de agua dulce, Schmidtea mediterranea. Los ovarios disecados son compatibles para la inmunotinción de anticuerpos y el análisis ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión para estudiar la biología celular de los ovocitos y las células somáticas, proporcionando una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles.

Resumen

El acceso a las células germinales permite el estudio del desarrollo, la meiosis y la recombinación de las células germinales. El biotipo sexual de la planaria de agua dulce, Schmidtea mediterranea, es un potente modelo de invertebrado para estudiar la especificación epigenética de las células germinales. A diferencia del gran número de testículos y células germinales masculinas, los ovocitos planarios son relativamente difíciles de localizar y examinar, ya que solo hay dos ovarios, cada uno con 5-20 ovocitos. La localización más profunda dentro del cuerpo planario y la falta de tejidos epiteliales protectores también dificultan la disección directa de los ovarios planarios.

Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios para el análisis posterior para superar estas dificultades. El ovario disecado es compatible para el examen ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e inmunotinción de anticuerpos. La técnica de disección descrita en este protocolo también permite experimentos de perturbación génica, en los que se examinan los ovarios en diferentes condiciones de ARN de interferencia (ARNi). El acceso directo a las células germinales intactas en el ovario logrado por este protocolo mejorará en gran medida la profundidad y la calidad de las imágenes y permitirá la interrogación celular y subcelular de la biología de los ovocitos.

Introducción

La anatomía de las planarias se ha examinado mediante el uso de TEM en muchos tejidos 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los ovarios o los ovocitos. La escasez de literatura sobre ovocitos se debe en parte a la dificultad de acceder a estas células, lo que deja la biología de los ovocitos planarios en gran medida inexplorada. Las herramientas moleculares han descubierto muchos mecanismos reguladores del desarrollo de los ovarios en las planarias utilizando microscopía de luz o fluorescencia 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Todos estos experimentos se realizaron en gusanos enteros o en secciones histológicas de gusanos enteros. Los protocolos de tinción de anticuerpos e hibridación in situ en gusanos enteros implican extensos pasos de blanqueo, lavado y limpieza de tejidos, que requieren mucho tiempo y llevarán varios días.

El objetivo general del método descrito aquí es proporcionar acceso a ovarios y ovocitos planarios intactos y disecados, lo que eliminará la necesidad de blanqueamiento o corte histológico y acortará el tiempo para el lavado y la limpieza del tejido en la tinción de anticuerpos y la hibridación in situ. Los ovarios disecados también mejorarán la penetración de la sonda o los anticuerpos y aumentarán la profundidad y la calidad de las imágenes para los microscopios ópticos y electrónicos. La accesibilidad a los ovarios y ovocitos disecados permite la investigación en biología celular a resolución celular y subcelular con ovocitos enteros intactos. Un estudio reciente sobre ovarios planarios disecados caracterizó por primera vez la meiosis de ovocitos planarios con TEM y microscopía confocal²¹. El trabajo proporcionó una descripción completa de un nuevo fenómeno durante la meiosis llamado vesiculación de la envoltura nuclear.

Aquí, presentamos los procedimientos detallados en la disección de ovarios planarios. Un paso de fijación fue suficiente para preservar la estructura de las células del ovario para la disección y la manipulación posterior (es decir, el procesamiento para el análisis de TEM y microscopio óptico). Dada su similitud en los planes corporales y la arquitectura de los tejidos, este protocolo también debería ser ampliamente informativo para el estudio de los ovocitos y sus núcleos en varias otras especies de Platyhelminthes (por ejemplo, el género Dugesia o Polycelis). Este protocolo es probablemente irrelevante para Macrostomum lignano por su pequeño tamaño y su arquitectura corporal casi transparente, lo que permitirá la observación directa del ovario y los ovocitos 22,23,24. El área del cuerpo que contiene los ovarios es más distinguible ópticamente (p. ej., pigmentación más oscura o pigmentación más clara) en algunas especies (p. ej., Dugesia ryukyuensis ^9,25) que en S. mediterranea. Los estudios en estas especies pueden basarse menos en las pautas para la localización de los ovarios en S. mediterranea presentadas aquí, sino aprovechar las condiciones de fijación y disección.

Protocolo

1. Preparación

1. Prepara lombrices: alimenta a las planarias sexuales dos veces por semana con pasta de hígado orgánica para lograr la madurez sexual.
   NOTA: Generalmente, estos gusanos miden más de 1 cm de largo y tienen un gonoporo posterior a la abertura de la faringe.
2. Preparar soluciones.
   1. Prepare los siguientes reactivos: 16% de paraformaldehído (PFA); solución acuosa de glutaraldehído (GA) al 50%; N-acetil-L-cisteína (NAC); 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de_Na2HPO4 y 2 mM de KH2PO4.
   2. Diluya 50% GA y 16% PFA con PBS hasta obtener una mezcla final de 2,5% GA y 2% PFA. Diluya el 16% de PFA con PBS hasta una concentración final de 4% de PFA.
   3. Disuelva 5 g de NAC en 100 ml de PBS para hacer una solución de trabajo al 5%.

2. Recolección de ovarios

1. Trate los gusanos sexualmente maduros con 5% de NAC en un plato a temperatura ambiente durante 5 min.
   NOTA: Los gusanos grandes pueden enroscarse. Se pueden usar cepillos o puntas de pipeta para aplanar los gusanos. La cantidad de 5% de NAC utilizada es mínima, suficiente para cubrir la superficie de la placa de Petri.
2. Sustituya el NAC por 10 ml de paraformaldehído al 4% recién preparado y fije las lombrices durante 1 h a temperatura ambiente con agitaciones ocasionales. Comience la disección 10 minutos después de la adición de PFA al 4% y realice la disección en PFA al 4% a medida que se fijan los gusanos.
3. Observar la pigmentación epitelial para localizar los cordones nerviosos ventrales, que aparecen como dos líneas con una pigmentación más clara que van desde los ganglios cefálicos anteriores hacia la cola.
4. Localiza los ovarios.
   NOTA: El ovario se encuentra justo al lado del cordón nervioso en el lado medial (Figura 1A). Confíe en la pigmentación de los epitelios para localizar la posición del ovario en la dirección antero-posterior. Idealmente, la pigmentación de los epitelios ventrales en la región ovárica es más clara que la de las regiones circundantes. En algunos gusanos, la pigmentación de los epitelios ventrales no proporciona suficiente confianza. Estos gusanos se pueden descartar ya que algunos pueden no tener ovarios bien desarrollados.
5. Validar las posiciones de los ovarios una vez localizados los ovarios putativos por pigmentación.
   NOTA: En primer lugar, los ovarios son posteriores a los ganglios cefálicos. En segundo lugar, los testículos de color oscuro son laterales a la superficie dorsal por encima del ovario. Los ovarios se ubican delante del testículo más anterior (Figura 1B). A veces, los lóbulos de los testículos se colocan al nivel de los ovarios o ligeramente antes de ellos.
6. Utilice dos bisturíes quirúrgicos para cortar la parte posterior y anterior de los dos ovarios (Figura 1C) para eliminar completamente los fragmentos de gusano anterior y posterior. Use un cuchillo para anclar el gusano y limpie el otro cuchillo que usó para hacer los cortes.
7. Corta en la línea media del fragmento de ovario para separar los dos ovarios. Dale la vuelta al fragmento para que quede con el lado ventral hacia abajo.
8. Despegue el tejido dorsal para exponer el intestino (Figura 1D) con dos pares de pinzas puntiagudas (tipo 5-SA).
   NOTA: El ovario en forma de cúpula se encuentra debajo de las ramas intestinales.
9. Retire suavemente las ramas intestinales que se encuentran sobre los tejidos ventrales con la punta de las pinzas o con un cepillo suave para exponer el ovario (Figura 1E).
10. Extraer los tejidos circundantes para extraer el ovario (Figura 1F,G).
11. Retire los ovarios y transfiéralos a un tubo de 1,5 ml para lavarlos con 1 ml de PBS.

3. Fijación para TEM

1. Lave los ovarios en PBS durante 10 minutos agitando suavemente. Mantenga las trompas en posición vertical y deje que los ovarios se hundan hasta el fondo por gravedad. Repite el lavado una vez.
   NOTA: Si los ovarios no se hunden, aplicar un centrifugado suave durante 15 s con una minicentrífuga de sobremesa (velocidad máxima de 2000 × g).
2. Reemplace el PBS con 2% de PFA/2.5% GA/PBS.
3. Fije las muestras a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador a 40 rpm.
4. Mantenga las muestras en fijador a 4 °C durante la noche en un agitador a 40 rpm.

4. Procesamiento de muestras para TEM

1. Lave los ovarios en PBS 3 veces durante 10 minutos cada uno.
2. Lave los ovarios en agua destilada doble (ddH₂O) 3 veces durante 10 minutos cada uno.
3. Fijar los ovarios en OsO₄ acuoso al 2% durante 1-2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
   NOTA: Los recipientes de muestra deben sellarse con parafilm durante este paso. Prepare 2% de OsO₄ con agua tratada con ósmosis inversa (ver la Tabla de Materiales).
4. Enjuague las muestras con ddH₂O 3 veces, 10 min cada una.
5. Teñir previamente los ovarios con acetato de uranilo (UA) acuoso al 2% durante la noche a 4 °C.
   NOTA: La solución UA debe filtrarse antes de su uso; Evite la luz durante la tinción en bloque . Prepare 2% de OsO₄ con agua tratada con ósmosis inversa (ver la Tabla de Materiales).
6. Enjuague las muestras en ddH₂O 4 veces con agitación suave, de 10 min cada una.
7. Deshidratar los ovarios en una serie graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 95% y dos veces 100%, 10 min cada solución) y luego equilibrarlos en dos incubaciones (10 min) en óxido de propileno.
8. Para la infiltración con resina, incubar las muestras en una mezcla de 50% de óxido de propileno/50% de resina epoxi líquida durante la noche a 4 °C. Infiltrar las muestras con resina epoxi 100% con 3 cambios (1 h cada cambio) con una suave agitación.
9. Incrustar los ovarios en resina epoxi 100% y polimerizar la resina a 60 °C durante 48 h.

5. Ultramicrotomía

1. Recorte de bloques y control de muestras con microscopio óptico
   1. Recorta los bloques de muestra en forma de pirámide con una cuchilla de afeitar.
   2. Corte secciones de 1-2 μm de espesor con un cuchillo de vidrio o diamante.
   3. Transfiera las secciones a un portaobjetos con una gota de agua, luego caliente el portaobjetos en una placa caliente hasta que las secciones se aplanen y se adhieran a la superficie del portaobjetos durante la evaporación del agua.
   4. Cubrir las secciones con una gota de azul de toluidina O al 1% y calentarlas en una placa caliente durante ~10 s. Enjuague el portaobjetos con agua corriente y luego déjelo secar. Revise las secciones bajo un microscopio óptico regular.
2. Corte, recolección y post-tinción de secciones ultrafinas.
   1. Corte secciones ultrafinas de 50-70 nm de grosor con un cuchillo de diamante. Transfiera las secciones del bote de agua de cuchilla a rejillas de cobre de malla o de una sola ranura.
   2. Tiñe las secciones con UA al 2% durante 8 min. Lave las rejillas en funcionamiento ddH₂O durante 30 s.
   3. Tiñe las secciones con una solución de plomo al 1% durante 6 min. Lave las secciones en funcionamiento ddH₂O durante 1 minuto y séquelas al aire.

6. Recopilación y análisis de datos

1. Recopile datos de TEM utilizando el software adecuado, por ejemplo, micrografía digital (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
2. Opere el visor a 80 kV. Inserte la rejilla de muestra en el osciloscopio cuando el vacío esté listo.
3. Encienda el haz haciendo clic en Luz en el menú. Gire la perilla de intensidad en el panel de control izquierdo hasta que el tiempo de exposición automática sea de ~ 1 s. Haga clic en Iniciar adquisición para obtener una imagen final.
4. Construya modelos EM tridimensionales utilizando el paquete de procesamiento, modelado y visualización de imágenes (IMOD) de código abierto.

7. Tinción de anticuerpos

1. Lave los ovarios disecados (paso 2.16) en un tubo de microfuga de 1,5 mL con 1 mL de PBS 1x suplementado con Triton X-100 (PBST) al 0,5%. Coloque los tubos en un agitador para agitar a 40 rpm durante 10 min. Deje que las trompas permanezcan en una rejilla y los ovarios se hundan por gravedad. Reemplace el lavado con PBST nuevo y repita dos veces.
2. Digiera los tejidos con 2 μg/mL de proteinasa K y dodecilsulfato de sodio al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente en PBST.
3. Lave los ovarios digeridos en PBST tres veces durante 10 minutos en cada lavado.
4. Incubar los ovarios con un 10% de suero de caballo en PBST durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Diluir los anticuerpos primarios de 1 a 100 en la solución de bloqueo (10% de suero de caballo en PBS con 0,5% de Triton X-100). Incubar los ovarios con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
6. Lave los ovarios en PBST tres veces durante 10 minutos cada lavado.
7. Incubar los ovarios con anticuerpos secundarios durante la noche a 4 °C con una suave agitación. Diluir todos los anticuerpos secundarios 1:300 en la solución de bloqueo.
8. Lave los ovarios en PBST tres veces, asegurándose de que el primer y tercer lavado duren 10 minutos. Teñir los núcleos ováricos con Hoechst 33342 a una dilución de 1:300 en PBST durante 30 min a temperatura ambiente en el segundo lavado.
9. Monta los ovarios en portaobjetos.
   NOTA: Se puede utilizar un montante anti-desvanecimiento para prolongar las señales de fluorescencia.

Resultados

El método aquí presentado ha sido descrito por Guo et ^al.21. La clave para una disección exitosa es identificar la pigmentación del ovario y colocar las guías correctamente. La estrategia del método es pasar de posiciones amplias a una ubicación específica. En primer lugar, para lograr esto, confíe en los patrones de pigmentación dorsal y ventral (Figura 1A,B). La pigmentación ventral, donde residen los ova...

Discusión

Estos procedimientos basados en la fijación para la disección de ovarios planarios facilitarán la comprensión de la meiosis de los ovocitos, así como el desarrollo y la regeneración de los ovarios. El tamaño de los ovocitos y sus células somáticas de soporte puede oscilar entre 20 μm y 50 μm. Los métodos basados en la disección proporcionarán accesibilidad a las células intactas de un solo ovario que los métodos basados en el corte o en la montura completa no pueden logra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM grade
2% aqueous OsO4	Electron Microscopy Sciences	19152
50% glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	EM grade
Digital Micrograph	Gatan Inc.		Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol	Ted Pella	19207	Denatured
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Horse serum	Sigma	H1138
Lead Acetate	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ water			reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	75569	EM grade
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Toluidine blue O	Electron Microscopy Sciences	92319
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	541093