Disección de ovario planario para análisis ultraestructural y tinción de anticuerpos

Resumen

Este protocolo presenta los pasos tomados para diseccionar los ovarios en las planarias de agua dulce, Schmidtea mediterranea. Los ovarios disecados son compatibles para la inmunotinción de anticuerpos y el análisis ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión para estudiar la biología celular de los ovocitos y las células somáticas, proporcionando una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles.

Resumen

El acceso a las células germinales permite el estudio del desarrollo, la meiosis y la recombinación de las células germinales. El biotipo sexual de la planaria de agua dulce, Schmidtea mediterranea, es un potente modelo de invertebrado para estudiar la especificación epigenética de las células germinales. A diferencia del gran número de testículos y células germinales masculinas, los ovocitos planarios son relativamente difíciles de localizar y examinar, ya que solo hay dos ovarios, cada uno con 5-20 ovocitos. La localización más profunda dentro del cuerpo planario y la falta de tejidos epiteliales protectores también dificultan la disección directa de los ovarios planarios.

Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios para el análisis posterior para superar estas dificultades. El ovario disecado es compatible para el examen ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e inmunotinción de anticuerpos. La técnica de disección descrita en este protocolo también permite experimentos de perturbación génica, en los que se examinan los ovarios en diferentes condiciones de ARN de interferencia (ARNi). El acceso directo a las células germinales intactas en el ovario logrado por este protocolo mejorará en gran medida la profundidad y la calidad de las imágenes y permitirá la interrogación celular y subcelular de la biología de los ovocitos.

Introducción

La anatomía de las planarias se ha examinado mediante el uso de TEM en muchos tejidos 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los ovarios o los ovocitos. La escasez de literatura sobre ovocitos se debe en parte a la dificultad de acceder a estas células, lo que deja la biología de los ovocitos planarios en gran medida inexplorada. Las herramientas moleculares han descubierto muchos mecanismos reguladores del desarrollo de ....

Protocolo

1. Preparación

1. Prepara lombrices: alimenta a las planarias sexuales dos veces por semana con pasta de hígado orgánica para lograr la madurez sexual.
   NOTA: Generalmente, estos gusanos miden más de 1 cm de largo y tienen un gonoporo posterior a la abertura de la faringe.
2. Preparar soluciones.
   1. Prepare los siguientes reactivos: 16% de paraformaldehído (PFA); solución acuosa de glutaraldehído (GA) al 50%; N-acetil-L-cisteína (NAC); 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de_Na2HPO4 y 2 mM de KH2PO4.
   2. Diluya 50% GA y 16% PFA con PBS hasta obtener un....

Resultados

El método aquí presentado ha sido descrito por Guo et ^al.21. La clave para una disección exitosa es identificar la pigmentación del ovario y colocar las guías correctamente. La estrategia del método es pasar de posiciones amplias a una ubicación específica. En primer lugar, para lograr esto, confíe en los patrones de pigmentación dorsal y ventral (Figura 1A,B). La pigmentación ventral, donde residen los ova.......

Discusión

Estos procedimientos basados en la fijación para la disección de ovarios planarios facilitarán la comprensión de la meiosis de los ovocitos, así como el desarrollo y la regeneración de los ovarios. El tamaño de los ovocitos y sus células somáticas de soporte puede oscilar entre 20 μm y 50 μm. Los métodos basados en la disección proporcionarán accesibilidad a las células intactas de un solo ovario que los métodos basados en el corte o en la montura completa no pueden logra.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM grade
2% aqueous OsO4	Electron Microscopy Sciences	19152
50% glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	EM grade
Digital Micrograph	Gatan Inc.		Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol	Ted Pella	19207	Denatured
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Horse serum	Sigma	H1138
Lead Acetate	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ water			reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	75569	EM grade
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Toluidine blue O	Electron Microscopy Sciences	92319
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	541093