Planarien-Ovarialdissektion für die Ultrastrukturanalyse und Antikörperfärbung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Schritte vor, die unternommen wurden, um die Eierstöcke der Süßwasserplanarien (Schmidtea mediterranea) zu sezieren.Die präparierten Eierstöcke sind für die Antikörper-Immunfärbung und die Ultrastrukturanalyse mit der Transmissionselektronenmikroskopie kompatibel, um die Zellbiologie der Eizellen und Körperzellen zu untersuchen, und bieten eine Bildgebungstiefe und -qualität, die bisher unzugänglich waren.

Zusammenfassung

Der Zugang zu Keimzellen ermöglicht die Untersuchung der Keimzellentwicklung, Meiose und Rekombination. Der sexuelle Biotyp des Süßwasserplanarien, Schmidtea mediterranea, ist ein leistungsfähiges Wirbellosenmodell, um die epigenetische Spezifizierung von Keimzellen zu untersuchen. Im Gegensatz zu der großen Anzahl an Hoden und männlichen Keimzellen sind Planarien-Eizellen relativ schwer zu lokalisieren und zu untersuchen, da es nur zwei Eierstöcke mit jeweils 5-20 Eizellen gibt. Die tiefere Lokalisation innerhalb des Planarienkörpers und das Fehlen von schützendem Epithelgewebe machen es auch schwierig, Planarien-Eierstöcke direkt zu präparieren.

Dieses Protokoll verwendet einen kurzen Fixierungsschritt, um die Lokalisierung und Dissektion von Planarien-Eierstöcken für die nachgelagerte Analyse zu erleichtern und diese Schwierigkeiten zu überwinden. Der präparierte Eierstock ist für die ultrastrukturelle Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Antikörper-Immunfärbung geeignet. Die in diesem Protokoll beschriebene Dissektionstechnik ermöglicht auch Genstörungsexperimente, bei denen die Eierstöcke unter verschiedenen RNA-Interferenzbedingungen (RNAi) untersucht werden. Der direkte Zugang zu den intakten Keimzellen im Eierstock, der durch dieses Protokoll erreicht wird, wird die Bildgebungstiefe und -qualität erheblich verbessern und eine zelluläre und subzelluläre Befragung der Eizellbiologie ermöglichen.

Einleitung

Die Anatomie der Planarien wurde mit Hilfe von TEM in vielen Geweben untersucht 1,2,3,4,5,6. Eierstöcken oder Eizellen wurde jedoch wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Der Mangel an Eizellliteratur ist zum Teil auf den schwierigen Zugang zu diesen Zellen zurückzuführen, so dass die Biologie der Planarien-Eizellen weitgehend unerforscht bleibt. Molekulare Werkzeuge haben mit Hilfe der Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie viele Regulationsmechanismen der Eierstockentwicklung bei den Planarien aufgedeckt 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Alle diese Experimente wurden an ganzen Würmern oder histologischen Schnitten von ganzen Würmern durchgeführt. Die Antikörperfärbung und die In-situ-Hybridisierungsprotokolle an ganzen Würmern umfassen umfangreiche Bleich-, Wasch- und Gewebereinigungsschritte, die zeitaufwändig sind und mehrere Tage in Anspruch nehmen werden.

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, den Zugang zu intakten, präparierten Planarien-Eierstöcken und -Eizellen zu ermöglichen, wodurch das Bleichen oder histologische Schnitt überflüssig wird und die Zeit für das Waschen und die Gewebereinigung bei der Antikörperfärbung und der In-situ-Hybridisierung verkürzt wird.Die präparierten Eierstöcke verbessern auch die Penetration von Sonden oder Antikörpern und erhöhen die Abbildungstiefe und -qualität für Licht- und Elektronenmikroskope. Der Zugang zu den präparierten Eierstöcken und Eizellen ermöglicht die zellbiologische Forschung mit zellulärer und subzellulärer Auflösung mit ganzen intakten Eizellen. Eine kürzlich durchgeführte Studie an präparierten Planarien-Ovarien charakterisierte die Meiose der Planarien-Eizellen zum ersten Mal mit TEM und konfokaler Mikroskopie²¹. Die Arbeit lieferte eine umfassende Beschreibung eines neuen Phänomens während der Meiose, das als Vesikulation der Kernhülle bezeichnet wird.

Im Folgenden stellen wir Ihnen die detaillierten Vorgehensweisen bei der Dissektion von Planarien-Eierstöcken vor. Ein Fixationsschritt war ausreichend, um die Zellstruktur der Eierstöcke für die Dissektion und nachgelagerte Manipulation (d. h. die Verarbeitung für die TEM- und Lichtmikroskopanalyse) zu erhalten. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit in den Körperbauplänen und der Gewebearchitektur sollte dieses Protokoll auch für die Untersuchung von Eizellen und ihren Zellkernen bei mehreren anderen Platyhelminthes-Arten (z. B. der Gattung Dugesia oder Polycelis) umfassend informativ sein. Dieses Protokoll ist für Macrostomum lignano wahrscheinlich irrelevant, da sie klein sind und eine fast transparente Körperarchitektur aufweisen, die eine direkte Beobachtung des Eierstocks und der Eizellen ermöglicht 22,23,24. Der Körperbereich, in dem sich die Eierstöcke befinden, ist bei einigen Arten (z. B. Dugesia ryukyuensis ^9,25) optisch besser unterscheidbar (z. B. dunkler pigmentiert oder heller pigmentiert) als bei S. mediterranea. Studien an diesen Arten können sich weniger auf die hier vorgestellten Richtlinien für die Lokalisierung der Eierstöcke in S. mediterranea stützen, sondern nutzen die Fixations- und Dissektionsbedingungen.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Würmer vorbereiten: Füttern Sie Geschlechtsplanarien zweimal pro Woche mit Bio-Leberpaste, um die Geschlechtsreife zu erreichen.
   HINWEIS: Im Allgemeinen sind solche Würmer größer als 1 cm lang und haben einen Gonopor hinter der Rachenöffnung.
2. Bereiten Sie Lösungen vor.
   1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor: 16% Paraformaldehyd (PFA); 50% ige wässrige Lösung aus Glutaraldehyd (GA); N-Acetyl-L-Cystein (NAC); 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO4 und 2 mM KH2PO4.
   2. 50 % GA und 16 % PFA mit PBS zu einer endgültigen Mischung aus 2,5 % GA und 2 % PFA verdünnen. 16 % PFA mit PBS auf eine Endkonzentration von 4 % PFA verdünnen.
   3. Lösen Sie 5 g NAC in 100 mL PBS auf, um eine 5%ige Arbeitslösung herzustellen.

2. Sammeln von Eierstöcken

1. Behandeln Sie geschlechtsreife Würmer mit 5% NAC in einer Schüssel bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
   HINWEIS: Große Würmer können sich zusammenrollen. Mit Bürsten oder Pipettenspitzen können die Würmer plattgedrückt werden. Die Menge von 5 % NAC ist minimal und reicht aus, um die Oberfläche der Petrischale zu bedecken.
2. Ersetzen Sie NAC durch 10 mL frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd und fixieren Sie die Würmer 1 h lang bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln. Beginnen Sie die Dissektion 10 Minuten nach der Zugabe von 4% PFA und führen Sie die Dissektion in 4% PFA durch, während die Würmer fixiert werden.
3. Beobachten Sie die epitheliale Pigmentierung, um die ventralen Nervenstränge zu lokalisieren, die als zwei Linien mit hellerer Pigmentierung erscheinen, die von den vorderen Kopfganglien zum Schwanz verlaufen.
4. Lokalisieren Sie die Eierstöcke.
   HINWEIS: Der Eierstock befindet sich direkt neben dem Nervenstrang auf der medialen Seite (Abbildung 1A). Verlassen Sie sich auf die Epithelienpigmentierung, um die Position des Eierstocks in anterior-hinterer Richtung zu lokalisieren. Im Idealfall ist die Pigmentierung der ventralen Epithelien im Eierstockbereich heller als in den umliegenden Regionen. Bei einigen Würmern bietet die Pigmentierung der ventralen Epithelien nicht genügend Sicherheit. Diese Würmer können verworfen werden, da einige möglicherweise keine gut entwickelten Eierstöcke haben.
5. Validieren Sie die Positionen der Eierstöcke, sobald die mutmaßlichen Eierstöcke durch Pigmentierung lokalisiert wurden.
   HINWEIS: Erstens befinden sich die Eierstöcke hinter den Kopfganglien. Zweitens befinden sich dunkel gefärbte Hoden lateral der dorsalen Oberfläche über dem Eierstock. Die Eierstöcke befinden sich vor dem vordersten Hoden (Abbildung 1B). Manchmal werden Hodenlappen auf Höhe der Eierstöcke oder etwas vor den Eierstöcken positioniert.
6. Schneiden Sie mit zwei chirurgischen Messern den hinteren und vorderen Teil der beiden Eierstöcke ab (Abbildung 1C), um die vorderen und hinteren Wurmfragmente vollständig zu entfernen. Verankere den Wurm mit einem Messer und reinige das andere Messer, mit dem du die Schnitte gemacht hast.
7. Schneiden Sie in die Mittellinie des Eierstockfragments, um die beiden Eierstöcke zu trennen. Drehen Sie das Fragment um, um die Bauchseite nach unten zu haben.
8. Ziehen Sie das Rückengewebe ab, um den Darm freizulegen (Abbildung 1D) mit zwei Paar spitzer Pinzetten (Typ 5-SA).
   HINWEIS: Der kuppelförmige Fruchtknoten befindet sich unter den Darmästen.
9. Entfernen Sie vorsichtig die Darmäste, die über dem Bauchgewebe sitzen, mit der Spitze der Pinzette oder einer weichen Bürste, um den Eierstock freizulegen (Abbildung 1E).
10. Entfernen Sie das umgebende Gewebe, um den Eierstock herauszunehmen (Abbildung 1F,G).
11. Nehmen Sie die Eierstöcke heraus und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen, um sie mit 1 ml PBS zu waschen.

3. Fixierung für TEM

1. Waschen Sie die Eierstöcke 10 Minuten lang in PBS unter leichtem Schütteln. Halten Sie die Eileiter aufrecht und lassen Sie die Eierstöcke durch die Schwerkraft auf den Boden sinken. Wiederholen Sie den Waschgang einmal.
   HINWEIS: Wenn die Eierstöcke nicht einsinken, drehen Sie sich 15 s lang sanft mit einer Mini-Tischzentrifuge (maximale Geschwindigkeit 2000 × g).
2. Ersetzen Sie die PBS durch 2 % PFA/2,5 % GA/PBS.
3. Die Proben werden 1 h lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker bei 40 U/min fixiert.
4. Bewahren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker bei 40 U/min in einem Fixiermittel auf.

4. Probenverarbeitung für TEM

1. Waschen Sie die Eierstöcke 3 Mal für jeweils 10 Minuten in PBS.
2. Waschen Sie die Eierstöcke 3 Mal für jeweils 10 min in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O).
3. Die Eierstöcke in 2 % wässrigem_{OsO 4} für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C postfixieren.
   HINWEIS: Die Probenbehälter müssen während dieses Schritts mit Parafilm versiegelt werden. 2%_{OsO 4} mit Umkehrosmose-behandeltem Wasser zubereiten (siehe Materialtabelle).
4. Spülen Sie die Proben 3 Mal à 10 min mit ddH₂Ø.
5. Die Eierstöcke mit 2 % wässrigem Uranylacetat (UA) über Nacht bei 4 °C vorfärben.
   HINWEIS: Die UA-Lösung muss vor der Verwendung gefiltert werden. Vermeiden Sie Licht während der En-bloc-Färbung . 2%_{OsO 4} mit Umkehrosmose-behandeltem Wasser zubereiten (siehe Materialtabelle).
6. Die Proben werden in ddH₂O 4 mal unter leichtem Rühren gespült, jeweils 10 min.
7. Dehydrieren Sie die Eierstöcke in einer abgestuften Ethanolserie (30 %, 50 %, 70 %, 95 % und zweimal 100 %, jeweils 10 Minuten) und äquilibrieren Sie sie dann in zwei Inkubationen (10 Minuten) in Propylenoxid.
8. Für die Infiltration mit Harz werden die Proben über Nacht bei 4 °C in einem Gemisch aus 50 % Propylenoxid und 50 % flüssigem Epoxidharz inkubiert. Infiltrieren Sie die Proben mit 100% Epoxidharz mit 3 Wechseln (je 1 h Wechsel) unter sanftem Rühren.
9. Betten Sie die Eierstöcke in 100% Epoxidharz ein und polymerisieren Sie das Harz bei 60 °C für 48 h.

5. Ultramikrotomie

1. Blocktrimmen und Probenkontrolle mit einem Lichtmikroskop
   1. Schneiden Sie die Probenblöcke mit einer Rasierklinge in eine Pyramidenform.
   2. Schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 1-2 μm mit einem Glas- oder Diamantmesser.
   3. Übertragen Sie die Abschnitte mit einem Tropfen Wasser auf einen Objektträger und erhitzen Sie dann den Objektträger auf einer heißen Platte, bis die Abschnitte flach werden und während der Wasserverdunstung an der Objektträgeroberfläche haften.
   4. Bedecken Sie die Abschnitte mit einem Tropfen 1% Toluidinblau O und erhitzen Sie sie auf einer heißen Platte für ~10 s. Spülen Sie die Rutsche mit fließendem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen. Überprüfen Sie die Schnitte unter einem normalen Lichtmikroskop.
2. Ultradünne Schnitte zum Schneiden, Sammeln und Nachfärben.
   1. Schneiden Sie ultradünne Abschnitte mit einer Dicke von 50-70 nm mit einem Diamantmesser. Übertragen Sie die Abschnitte vom Messerwasserboot auf Gitter- oder Einschlitz-Kupfergitter.
   2. Färben Sie die Abschnitte 8 min lang in 2% UA. Die Gitter in laufendem Stand ddH₂T� 30 s waschen.
   3. Die Abschnitte 6 min lang mit 1%iger Bleilösung einfärben. Die Partien in laufendem ddH₂O 1 min waschen und an der Luft trocknen lassen.

6. Datenerhebung und -analyse

1. Sammeln Sie TEM-Daten mit geeigneter Software, z. B. digitaler Mikroskopaufnahme (weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle ).
2. Betreiben Sie das Oszilloskop bei 80 kV. Setzen Sie das Probengitter in das Oszilloskop ein, wenn das Vakuum bereit ist.
3. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie im Menü auf Licht klicken. Drehen Sie den Intensitätsregler auf dem linken Steuerkreuz, bis die automatische Belichtungszeit ~1 s beträgt. Klicken Sie auf Start Acquire , um ein endgültiges Bild zu erhalten.
4. Erstellen Sie dreidimensionale EM-Modelle mit dem Open-Source-IMOD-Paket (Image Processing, Modeling, and Display).

7. Färbung von Antikörpern

1. Waschen Sie die präparierten Eierstöcke (Schritt 2.16) in einem 1,5 mL Mikrofugenröhrchen mit 1 mL 1x PBS, ergänzt mit 0,5% Triton X-100 (PBST). Legen Sie die Röhrchen auf einen Schüttler und rühren Sie sie 10 Minuten lang bei 40 U/min. Lassen Sie die Eileiter in einem Gestell stehen und die Eierstöcke sinken durch die Schwerkraft. Ersetzen Sie die Wäsche durch frisches PBST und wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
2. Verdauen Sie das Gewebe mit 2 μg/ml Proteinase K und 0,1 % Natriumdodecylsulfat für 10 min bei Raumtemperatur in PBST.
3. Waschen Sie die verdauten Eierstöcke dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST.
4. Inkubieren Sie die Eierstöcke mit 10% Pferdeserum in PBST für 1 h bei Raumtemperatur.
5. Verdünnen Sie die Primärantikörper 1 bis 100 in der Blockierungslösung (10 % Pferdeserum in PBS mit 0,5 % Triton X-100). Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht bei 4 °C bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
6. Waschen Sie die Eierstöcke dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST.
7. Inkubieren Sie die Eierstöcke mit Sekundärantikörpern über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln. Verdünnen Sie alle Sekundärantikörper 1:300 in der Blockierungslösung.
8. Waschen Sie die Eierstöcke dreimal in PBST und achten Sie darauf, dass die erste und dritte Wäsche 10 Minuten dauern. Färben Sie die Eierstockkerne mit Hoechst 33342 bei 1:300 Verdünnung in PBST für 30 min bei Raumtemperatur in der zweiten Wäsche.
9. Montieren Sie die Eierstöcke auf Objektträger.
   HINWEIS: Anti-Fading-Eindeckmittel kann verwendet werden, um die Fluoreszenzsignale zu verlängern.

Ergebnisse

Die hier vorgestellte Methode wurde von Guo et ^al.21 beschrieben. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Dissektion liegt in der korrekten Identifizierung der Pigmentierung und Position der Eierstöcke. Die Strategie der Methode besteht darin, sich von breiten Positionen zu einem bestimmten Ort zu bewegen. Um dies zu erreichen, verlassen Sie sich zunächst auf dorsale und ventrale Pigmentmuster (Abbildung 1A,B). Die ve...

Diskussion

Diese fixationsbasierten Verfahren zur Präparierung von Planarien-Eierstöcken werden das Verständnis der Eizellmeiose sowie der Entwicklung und Regeneration der Eierstöcke erleichtern. Die Größen der Eizellen und ihrer somatischen Stützzellen können zwischen 20 μm und 50 μm liegen. Dissektionsbasierte Methoden ermöglichen einen Zugang zu intakten Zellen eines einzelnen Eierstocks, den Schnitte oder Whole-Mount-basierte Methoden nicht erreichen können. Dieses Protokoll wird di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM grade
2% aqueous OsO4	Electron Microscopy Sciences	19152
50% glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	EM grade
Digital Micrograph	Gatan Inc.		Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol	Ted Pella	19207	Denatured
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Horse serum	Sigma	H1138
Lead Acetate	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ water			reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	75569	EM grade
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Toluidine blue O	Electron Microscopy Sciences	92319
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	541093