JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, tatlı su planaryaları Schmidtea mediterranea'daki yumurtalıkları incelemek için atılan adımları sunar.Diseke edilen yumurtalıklar, oositlerin ve somatik hücrelerin hücre biyolojisini incelemek için transmisyon elektron mikroskobu ile antikor immün boyama ve ultrastrüktürel analiz için uyumludur ve daha önce erişilemeyen bir görüntüleme derinliği ve kalitesi sağlar.

Özet

Germ hücrelerine erişilebilirlik, germ hücresi gelişimi, mayoz bölünme ve rekombinasyon çalışmalarına izin verir. Tatlı su planaryasının cinsel biyotipi olan Schmidtea mediterranea, germ hücrelerinin epigenetik özelliklerini incelemek için güçlü bir omurgasız modelidir. Çok sayıda testis ve erkek germ hücresinin aksine, düzlemsel oositlerin bulunması ve incelenmesi nispeten zordur, çünkü her biri 5-20 oosit içeren sadece iki yumurtalık vardır. Planarian cisim içinde daha derin lokalizasyon ve koruyucu epitel dokularının eksikliği de planarian overlerin doğrudan diseksiyonunu zorlaştırır.

Bu protokol, bu zorlukların üstesinden gelmek için aşağı akış analizi için planaryal yumurtalıkların lokalizasyonunu ve diseksiyonunu kolaylaştırmak için kısa bir fiksasyon adımı kullanır. Diseke edilen yumurtalık, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve antikor immün boyaması ile ultrastrüktürel inceleme için uyumludur. Bu protokolde özetlenen diseksiyon tekniği, yumurtalıkların farklı RNA girişim (RNAi) koşulları altında incelendiği gen pertürbasyon deneylerine de izin verir. Bu protokol ile elde edilen yumurtalıktaki sağlam germ hücrelerine doğrudan erişim, görüntüleme derinliğini ve kalitesini büyük ölçüde artıracak ve oosit biyolojisinin hücresel ve hücre altı sorgulamasına izin verecektir.

Giriş

Düzlemsel anatomi birçok dokuda TEM kullanılarak incelenmiştir 1,2,3,4,5,6. Bununla birlikte, yumurtalıklara veya oositlere çok az dikkat edilmiştir. Oosit literatürünün azlığı, kısmen bu hücrelere erişimin zorluğundan kaynaklanmaktadır ve düzlemsel oositlerin biyolojisini büyük ölçüde keşfedilmemiş bırakmaktadır. Moleküler araçlar, ışık veya floresan mikroskobu 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 kullanarak planaryalarda yumurtalık gelişiminin birçok düzenleyici mekanizmasını ortaya çıkarmıştır.. Tüm bu deneyler bütün solucanlar veya bütün solucanların histolojik bölümleri üzerinde gerçekleştirildi. Bütün solucanlar üzerindeki antikor boyama ve in situ hibridizasyon protokolleri, zaman alıcı ve birkaç gün sürecek olan kapsamlı ağartma, yıkama ve doku temizleme adımlarını içerir.

Burada tarif edilen yöntemin genel amacı, antikor boyama ve in situ hibridizasyonda ağartma veya histolojik kesit alma gerekliliğini ortadan kaldıracak ve yıkama ve doku temizleme süresini kısaltacak sağlam, diseke planarian yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik sağlamaktır.Diseke edilen yumurtalıklar ayrıca prob veya antikor penetrasyonunu iyileştirecek ve ışık ve elektron mikroskopları için görüntüleme derinliğini ve kalitesini artıracaktır. Diseke edilmiş yumurtalıklara ve oositlere erişilebilirlik, bütün sağlam oositlerle hücresel ve subselüler çözünürlükte hücre biyolojisi araştırmalarına izin verir. Diseke planarian yumurtalıklar üzerinde yakın zamanda yapılan bir çalışmada, TEM ve konfokal mikroskopi ile ilk kez planaryal oosit mayozu karakterize edilmiştir21. Çalışma, mayoz bölünme sırasında nükleer zarf vezikülasyonu adı verilen yeni bir fenomenin kapsamlı bir tanımını sağladı.

Burada, planarian overlerin diseksiyonunda ayrıntılı prosedürleri sunuyoruz. Diseksiyon ve aşağı akış manipülasyonu için yumurtalık hücre yapısını korumak için bir fiksasyon aşaması yeterliydi (yani, TEM ve ışık mikroskobu analizi için işleme). Vücut planları ve doku mimarisindeki benzerlikleri göz önüne alındığında, bu protokol aynı zamanda diğer bazı Platyhelminthes türlerinde (örneğin, Dugesia veya Polycelis cinsi) oositleri ve çekirdeklerini incelemek için geniş ölçüde bilgilendirici olmalıdır. Bu protokol, yumurtalık ve oositlerin 22,23,24 doğrudan gözlemlenmesine izin verecek olan küçük boyutları ve neredeyse şeffaf vücut mimarisi nedeniyle Macrostomum lignano için muhtemelen ilgisizdir. Yumurtalıkları içeren vücut bölgesi, bazı türlerde (örneğin, Dugesia ryukyuensis 9,25) S. mediterranea'dan daha optik olarak ayırt edilebilir (örneğin, daha koyu pigmentli veya daha açık pigmentli). Bu türlerdeki çalışmalar, burada sunulan S. mediterranea'daki yumurtalıkların yerini belirleme kılavuzlarına daha az güvenebilir, ancak fiksasyon ve diseksiyon koşullarından yararlanır.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Solucanlar hazırlayın: Cinsel olgunluğa ulaşmak için cinsel planaryaları haftada iki kez organik karaciğer macunu ile besleyin.
    NOT: Genel olarak, bu tür solucanların uzunluğu 1 cm'den büyüktür ve farenks açıklığının arkasında bir gonopore bulunur.
  2. Çözümler hazırlayın.
    1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: %16 paraformaldehit (PFA); % 50 glutaraldehit (GA) sulu çözelti; N-asetil-L-sistein (NAC); 1x fosfat tamponlu salin (PBS): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 ve 2 mM KH2PO4.
    2. % 50 GA ve% 16 PFA'yı PBS ile% 2.5 GA ve% 2 PFA'dan oluşan bir nihai karışıma seyreltin. % 16 PFA'yı PBS ile% 4'lük bir nihai PFA konsantrasyonuna seyreltin.
    3. % 5'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için 5 g NAC'yi 100 mL PBS'de çözün.

2. Yumurtalıkların toplanması

  1. Cinsel olarak olgun solucanları oda sıcaklığında bir tabakta% 5 NAC ile 5 dakika tedavi edin.
    NOT: Büyük solucanlar kıvrılabilir. Solucanları düzleştirmek için fırçalar veya pipet uçları kullanılabilir. Kullanılan %5 NAC miktarı, Petri kabının yüzeyini kaplayacak kadar minimumdur.
  2. NAC'yi 10 mL taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile değiştirin ve solucanları ara sıra çalkalayarak oda sıcaklığında 1 saat sabitleyin. %4 PFA ilavesinden 10 dakika sonra diseksiyona başlayın ve solucanlar sabitlenirken diseksiyonu %4 PFA'da gerçekleştirin.
  3. Anterior sefalik gangliyonlardan kuyruğa doğru uzanan daha hafif pigmentasyona sahip iki çizgi halinde görünen ventral sinir kordonlarını bulmak için epitel pigmentasyonunu gözlemleyin.
  4. Yumurtalıkları bulun.
    NOT: Yumurtalık, medial tarafta sinir kordonunun hemen yanında bulunur (Şekil 1A). Yumurtalığın ön-arka yöndeki konumunu bulmak için epitel pigmentasyonuna güvenin. İdeal olarak, yumurtalık bölgesindeki ventral epitelin pigmentasyonu çevre bölgelere göre daha hafiftir. Bazı solucanlarda, ventral epitelin pigmentasyonu yeterli güven sağlamaz. Bu solucanlar, bazılarının iyi gelişmiş yumurtalıkları olmayabileceğinden atılabilir.
  5. Varsayılan yumurtalıklar pigmentasyon ile yerleştirildikten sonra yumurtalıkların pozisyonlarını doğrulayın.
    NOT: İlk olarak, yumurtalıklar sefalik gangliyonların arkasındadır. İkincisi, koyu renkli testisler yumurtalığın üzerindeki sırt yüzeyinin yanalıdır. Yumurtalıklar en ön testisin önünde yerleşir (Şekil 1B). Bazen, testis lobları yumurtalıklar seviyesinde veya yumurtalıkların hemen önünde konumlanır.
  6. Ön ve arka solucan parçalarını tamamen çıkarmak için iki yumurtalığın arkasını ve önünü kesmek için iki cerrahi bıçak kullanın (Şekil 1C). Solucanı sabitlemek için bir bıçak kullanın ve kesimleri yapmak için kullanılan diğer bıçağı temizleyin.
  7. İki yumurtalığı ayırmak için yumurtalık parçasının orta çizgisinde kesin. Ventral tarafı aşağı bakacak şekilde parçayı çevirin.
  8. İki çift sivri cımbızla (tip 5-SA) bağırsağı (Şekil 1D) açığa çıkarmak için sırt dokusunu soyun.
    NOT: Kubbe şeklindeki yumurtalık, bağırsak dallarının altında bulunur.
  9. Yumurtalığı ortaya çıkarmak için cımbızın ucuyla veya yumuşak bir fırça ile ventral dokuların üzerinde oturan bağırsak dallarını nazikçe çıkarın (Şekil 1E).
  10. Yumurtalığı çıkarmak için çevredeki dokuları çıkarın (Şekil 1F,G).
  11. Yumurtalıkları çıkarın ve 1 mL PBS ile yıkamak için 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.

3. TEM için Fiksasyon

  1. Yumurtalıkları PBS'de 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Tüpleri dik tutun ve yumurtalıkların yerçekimi ile dibe batmasına izin verin. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.
    NOT: Yumurtalıklar batmazsa, mini tezgah üstü santrifüj ile 15 saniye boyunca hafif bir sıkma uygulayın (maksimum hız 2000 × g).
  2. PBS'yi %2 PFA/%2.5 GA/PBS ile değiştirin.
  3. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 40 rpm'de bir çalkalayıcıda sabitleyin.
  4. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de 40 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde sabitleyici halde tutun.

4. TEM için numune işleme

  1. Yumurtalıkları PBS'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  2. Yumurtalıkları çift damıtılmış suda (ddH2O) her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  3. Yumurtalıkları %2 sulu OsO4'te oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin.
    NOT: Bu adımda numune kaplarının parafilm ile kapatılması gerekir. Ters ozmoz ile arıtılmış su ile %2 OsO4 hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  4. Numuneleri ddH2O ile her biri 10 dakika olmak üzere 3 kez durulayın.
  5. Yumurtalıkları gece boyunca 4 °C'de %2 sulu uranil asetat (UA) içinde önceden boyayın.
    NOT: UA çözümünün kullanımdan önce filtrelenmesi gerekir; En blok boyama sırasında ışıktan kaçının. Ters ozmoz ile arıtılmış su ile %2 OsO4 hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Numuneleri ddH2O'da 4 kez, her biri 10 dakika olacak şekilde hafif çalkalayarak durulayın.
  7. Yumurtalıkları kademeli bir etanol serisinde (% 30,% 50,% 70,% 95 ve% iki kez% 100, her çözelti 10 dakika) kurutun ve daha sonra propilen oksit içinde iki inkübasyonda (10 dakika) dengeleyin.
  8. Reçine ile sızma için, numuneleri %50 propilen oksit / %50 sıvı epoksi reçine karışımı içinde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Numuneleri %100 epoksi reçine ile 3 değişiklikle (her değişiklikte 1 saat) hafif çalkalama ile sızdırın.
  9. Yumurtalıkları %100 epoksi reçineye gömün ve reçineyi 60 °C'de 48 saat polimerize edin.

5. Ultramikrotomi

  1. Işık mikroskobu ile blok kırpma ve numune kontrolü
    1. Numune bloklarını bir tıraş bıçağıyla piramit şeklinde kesin.
    2. Cam veya elmas bıçakla 1-2 μm kalınlığında kesitler kesin.
    3. Bölümleri bir damla su ile bir slayt üzerine aktarın, ardından slaytı sıcak bir plaka üzerinde bölümler düzleşene ve su buharlaşması sırasında slayt yüzeyine yapışana kadar ısıtın.
    4. Bölümleri %1 damla toluidin mavisi O ile örtün ve sıcak bir plakada ~ 10 s ısıtın. Slaytı akan su ile durulayın, ardından kurumasını bekleyin. Bölümleri normal bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.
  2. Ultra ince kesitler kesme, toplama ve boyama sonrası.
    1. Elmas bıçakla 50-70 nm kalınlığında ultra ince kesitler kesin. Bıçaklı su teknesindeki bölümleri ağ veya tek yuvalı bakır ızgaralara aktarın.
    2. Bölümleri 8 dakika boyunca %2 UA'da boyayın. Izgaraları ddH2O'da 30 saniye boyunca yıkayın.
    3. Bölümleri 6 dakika boyunca% 1 kurşun çözeltisi ile boyayın. Bölümleri ddH2O'da 1 dakika boyunca yıkayın ve havayla kurutun.

6. Veri toplama ve analizi

  1. Dijital Mikrograf gibi uygun bir yazılım kullanarak TEM verilerini toplayın (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Kapsamı 80 kV'da çalıştırın. Vakum hazır olduğunda numune ızgarasını dürbüne yerleştirin.
  3. Menüdeki Işık'a tıklayarak ışını açın. Otomatik Pozlama süresi ~1 s olana kadar sol kontrol panelindeki Yoğunluk düğmesini çevirin. Son bir görüntü elde etmek için Edinmeye Başla'ya tıklayın.
  4. Açık kaynaklı görüntü işleme, modelleme ve görüntüleme (IMOD) paketini kullanarak üç boyutlu EM modelleri oluşturun.

7. Antikor boyama

  1. Disseke yumurtalıkları (adım 2.16), %0.5 Triton X-100 (PBST) ile desteklenmiş 1 mL 1x PBS ile 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde yıkayın. Tüpleri 10 dakika boyunca 40 rpm'de çalkalamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Tüplerin bir rafta durmasına izin verin ve yumurtalıklar yerçekimi ile batar. Yıkamayı taze PBST ile değiştirin ve iki kez tekrarlayın.
  2. Dokuları 2 μg/mL Proteinaz K ve %0.1 sodyum dodesilsülfat ile PBST'de oda sıcaklığında 10 dakika sindirin.
  3. Sindirilmiş yumurtalıkları PBST'de her yıkamada 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. Yumurtalıkları PBST'de% 10 at serumu ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  5. Bloke edici çözeltide 1 ila 100 arasında birincil antikorları seyreltin (PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile% 10 at serumu). Yumurtalıkları birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
  6. Yumurtalıkları PBST'de her yıkamada 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  7. Yumurtalıkları ikincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Tüm ikincil antikorları bloke edici solüsyonda 1:300 oranında seyreltin.
  8. Yumurtalıkları PBST'de üç kez yıkayın, birinci ve üçüncü yıkamaların 10 dakika sürmesini sağlayın. Yumurtalık çekirdeklerini Hoechst 33342 ile 1:300'de boyayın, ikinci yıkamada oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST'de seyreltin.
  9. Yumurtalıkları slaytlara monte edin.
    NOT: Floresan sinyallerini uzatmak için solma önleyici montaj aparatı kullanılabilir.

Sonuçlar

Burada sunulan yöntem Guo ve ark.21 tarafından tanımlanmıştır. Başarılı diseksiyonun anahtarı, yumurtalık pigmentasyonunu ve pozisyon kılavuzlarını doğru bir şekilde tanımlamaktır. Yöntemin stratejisi, geniş pozisyonlardan belirli bir konuma geçmektir. İlk olarak, bunu başarmak için dorsal ve ventral pigmentasyon modellerine güvenin (Şekil 1A,B). Yumurtalıkların bulunduğu ventral pigmentas...

Tartışmalar

Planaryal yumurtalıkların diseksiyonu için bu fiksasyona dayalı prosedürler, oosit mayozunun yanı sıra yumurtalık gelişimi ve rejenerasyonunun anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Oositlerin ve somatik destek hücrelerinin boyutları 20 μm ila 50 μm arasında değişebilir. Diseksiyon tabanlı yöntemler, kesit alma veya tam montaj tabanlı yöntemlerin elde edemediği sağlam tek yumurtalık hücrelerine erişilebilirlik sağlayacaktır. Bu protokol, hücresel ve subsell?...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (LK ve ASA) ve Helen Hay Whitney Vakfı (LHG) tarafından desteklendi.

Bu el yazmasının temelini oluşturan orijinal verilere, http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628 adresindeki Stowers Orijinal Veri Deposundan erişilebilir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710EM grade
2% aqueous OsO4Electron Microscopy Sciences19152
50% glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16320EM grade
Digital MicrographGatan Inc.Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resinElectron Microscopy Sciences14120Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
EthanolTed Pella19207Denatured
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Horse serumSigmaH1138
Lead AcetateElectron Microscopy Sciences6080564
MilliQ waterreverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Propylene oxideElectron Microscopy Sciences75569EM grade
 Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
Toluidine blue OElectron Microscopy Sciences92319
Transmission Electron MicroscopeFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences541093

Referanslar

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550 (1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69 (2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175 (2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364 (2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457 (2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030 (2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609 (2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607 (2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5 (2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120 (2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K., Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. . Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. , 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler PlanaryOverDiseksiyonUltrastr kt rel AnalizAntikor BoyamaGerm H creleriOositlerTransmisyon Elektron Mikroskobumm n BoyamaRNA nterneti

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır