JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе представлены шаги, предпринятые для вскрытия яичников у пресноводных планарий, Schmidtea mediterranea. Препарированные яичники совместимы для иммуноокрашивания антителами и ультраструктурного анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии для изучения клеточной биологии ооцитов и соматических клеток, обеспечивая глубину и качество визуализации, которые ранее были недоступны.

Аннотация

Доступность половых клеток позволяет изучать развитие зародышевых клеток, мейоз и рекомбинацию. Половой биотип пресноводной планарии, Schmidtea mediterranea, является мощной моделью беспозвоночных для изучения эпигенетической спецификации половых клеток. В отличие от большого количества яичек и мужских половых клеток, ооциты планарий относительно трудно обнаружить и исследовать, так как существует только два яичника, каждый из которых содержит 5-20 ооцитов. Более глубокая локализация в теле планарий и отсутствие защитных эпителиальных тканей также затрудняют непосредственное вскрытие яичников планарий.

В этом протоколе используется короткий этап фиксации для облегчения локализации и препарирования планарных яичников для последующего анализа для преодоления этих трудностей. Рассеченный яичник совместим для ультраструктурного исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и иммуноокрашивания антителами. Метод препарирования, описанный в этом протоколе, также позволяет проводить эксперименты по возмущению генов, в которых яичники исследуются в различных условиях РНК-интерференции (РНК-интерференции). Прямой доступ к интактным половым клеткам в яичнике, достигаемый с помощью этого протокола, значительно улучшит глубину и качество визуализации и позволит проводить клеточные и субклеточные исследования биологии ооцитов.

Введение

Анатомия планарий была изучена с использованием ПЭМ во многих тканях 1,2,3,4,5,6. Тем не менее, мало внимания уделялось яичникам или ооцитам. Скудность литературы по ооцитам отчасти связана с трудностями доступа к этим клеткам, что оставляет биологию планарических ооцитов в значительной степени неизученной. Молекулярные инструменты раскрыли многие регуляторные механизмы развития яичников у планарий с помощью световой или флуоресцентной микроскопии 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Все эти эксперименты проводились на цельных червях или гистологических срезах цельных червей. Протоколы окрашивания антител и гибридизации in situ на цельных червях включают в себя обширные этапы отбеливания, промывания и очистки тканей, которые занимают много времени и занимают несколько дней.

Общая цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы обеспечить доступность интактных, рассеченных планарных яичников и ооцитов, что устранит необходимость в отбеливании или гистологическом срезе и сократит время промывания и очистки тканей при окрашивании антителами и гибридизации in situ. Рассеченные яичники также улучшают проникновение зонда или антитела и увеличивают глубину и качество визуализации для световых и электронных микроскопов. Доступность рассеченных яичников и ооцитов позволяет проводить исследования клеточной биологии с клеточным и субклеточным разрешением с целыми интактными ооцитами. Недавнее исследование рассеченных планарийных яичников впервые охарактеризовало мейоз ооцитов планарий с помощью ПЭМ и конфокальной микроскопии21. В работе было дано всестороннее описание нового явления во время мейоза, называемого везикуляцией ядерной оболочки.

Здесь мы подробно представляем процедуры вскрытия планарных яичников. Этап фиксации был достаточным для сохранения структуры клеток яичника для диссекции и последующих манипуляций (т.е. обработки для ПЭМ и анализа с помощью светового микроскопа). Учитывая их сходство в плане тела и архитектуре тканей, этот протокол также должен быть широко информативным для изучения ооцитов и их ядер у нескольких других видов Platyhelminthes (например, рода Dugesia или Polycelis). Этот протокол, вероятно, неактуален для Macrostomum lignano из-за их небольших размеров и почти прозрачной архитектуры тела, что позволит проводить прямое наблюдение за яичниками и ооцитами 22,23,24. Область тела, содержащая яичники, более оптически различима (например, более темная пигментация или более светлая пигментация) у некоторых видов (например, Dugesia ryukyuensis 9,25), чем у S. mediterranea. Исследования этих видов могут в меньшей степени полагаться на представленные здесь рекомендации по размещению яичников у S. mediterranea, но используют условия фиксации и препарирования.

протокол

1. Подготовка

  1. Подготовьте червей: кормите половых планарий два раза в неделю органической пастой из печени для достижения половой зрелости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, такие черви имеют длину более 1 см и гонопору позади отверстия глотки.
  2. Приготовьте растворы.
    1. Приготовьте следующие реагенты: 16% параформальдегид (PFA); 50% водный раствор глутаральдегида (ГА); N-ацетил-L-цистеин (NAC); 1x фосфатно-солевой буфер (PBS): 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4 и 2 мМ KH2PO4.
    2. Разбавьте 50% GA и 16% PFA с PBS до конечной смеси 2,5% GA и 2% PFA. Разбавьте 16% PFA с PBS до конечной концентрации 4% PFA.
    3. Растворите 5 г NAC в 100 мл PBS до получения 5% рабочего раствора.

2. Сбор яичников

  1. Половозрелых червей обработать 5% NAC в посуде комнатной температуры в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крупные черви могут сворачиваться. Для расплющивания червей можно использовать щетки или кончики пипеток. Количество используемого 5% NAC минимально, достаточно, чтобы покрыть поверхность чашки Петри.
  2. Замените NAC 10 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида и зафиксируйте червей на 1 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. Начните вскрытие через 10 минут после добавления 4% PFA, и выполняйте вскрытие при 4% PFA, поскольку черви фиксируются.
  3. Обратите внимание на пигментацию эпителия, чтобы найти вентральные нервные канатики, которые выглядят как две линии с более светлой пигментацией, идущие от передних головных ганглиев к хвосту.
  4. Располагайте яичники.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яичник расположен в непосредственной близости от нервного канатика с медиальной стороны (Рисунок 1А). Полагайтесь на пигментацию эпителия, чтобы определить положение яичника в передне-заднем направлении. В идеале пигментация вентрального эпителия в области яичников должна быть светлее, чем в окружающих областях. У некоторых червей пигментация вентрального эпителия не обеспечивает достаточной уверенности. От этих червей можно отказаться, так как у некоторых из них могут быть недостаточно развитые яичники.
  5. Проверьте положение яичников после того, как предполагаемые яичники будут расположены с помощью пигментации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, яичники находятся позади головных ганглий. Во-вторых, семенники темного цвета расположены латерально по отношению к дорсальной поверхности над яичником. Яичники расположены перед самым передним яичком (Рисунок 1B). Иногда доли яичек расположены на уровне яичников или немного впереди них.
  6. С помощью двух хирургических ножей разрежьте заднюю и переднюю части двух яичников (Рисунок 1C), чтобы полностью удалить передние и задние фрагменты червя. Используйте один нож, чтобы закрепить червя, и очистите другой нож, используемый для выполнения надрезов.
  7. Срежьте по средней линии завязи фрагмент, чтобы отделить две завязи. Переверните фрагмент так, чтобы он был брюшной стороной вниз.
  8. Снимите дорсальную ткань, чтобы обнажить кишечник (рисунок 1D) с помощью двух пар заостренных пинцетов (тип 5-SA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Куполообразная завязь расположена под ветвями кишки.
  9. Аккуратно удалите ветви кишечника, расположенные над вентральными тканями, с помощью кончика пинцета или мягкой щетки, чтобы обнажить яичник (рисунок 1E).
  10. Удалите окружающие ткани, чтобы удалить яичник (рисунок 1F, G).
  11. Извлеките яичники и перенесите их в пробирку объемом 1,5 мл и промойте 1 мл PBS.

3. Фиксация для ПЭМ

  1. Промойте яичники в PBS в течение 10 минут с легким встряхиванием. Держите трубки в вертикальном положении и позвольте яичникам опуститься на дно под действием силы тяжести. Повторите стирку один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если яичники не опускаются, примените щадящий отжим в течение 15 с с помощью мини-настольной центрифуги (максимальная скорость 2000 × г).
  2. Замените PBS на 2% PFA/2,5% GA/PBS.
  3. Зафиксируйте образцы при комнатной температуре в течение 1 ч на вибростенде при 40 об/мин.
  4. Держите образцы в фиксаторе при температуре 4 °C в течение ночи на шейкере при 40 об/мин.

4. Обработка образцов для ПЭМ

  1. Промыть яичники в PBS 3 раза по 10 мин каждый.
  2. Промойте яичники в воде двойной дистилляции (ddH2O) 3 раза по 10 мин каждый.
  3. После фиксации яичников в 2% водной среде OsO4 в течение 1-2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе контейнеры с образцами должны быть закрыты парапленкой. Приготовьте 2% OsO4 в воде, обработанной обратным осмосом (см. Таблицу материалов).
  4. Промойте образцы ddH2O 3 раза, по 10 мин каждый.
  5. Предварительно окрашивайте яичники в 2% водный раствор уранилацетата (UA) на ночь при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение UA необходимо отфильтровать перед использованием; Избегайте попадания света во время окрашивания En Bloc . Приготовьте 2% OsO4 в воде, обработанной обратным осмосом (см. Таблицу материалов).
  6. Промойте образцы в ddH2O 4 раза с легким перемешиванием, по 10 мин каждый.
  7. Обезвоживайте яичники в дозированном этаноле (30%, 50%, 70%, 95% и дважды по 100%, по 10 мин в каждом растворе), а затем уравновешивайте их в двух инкубациях (10 мин) в пропиленоксиде.
  8. Для инфильтрации смолой образцы инкубируют в смеси 50% оксида пропилена / 50% жидкой эпоксидной смолы в течение ночи при 4 °C. Пропитайте образцы 100% эпоксидной смолой с 3 сменами (по 1 часу каждая) с легким перемешиванием.
  9. Засыпьте яичники в 100% эпоксидную смолу и полимеризуйте смолу при 60 °C в течение 48 часов.

5. Ультрамикротомия

  1. Обрезка блоков и проверка образцов с помощью светового микроскопа
    1. Обрежьте блоки образцов в форме пирамиды с помощью лезвия бритвы.
    2. Вырежьте участки толщиной 1-2 мкм стеклянным или алмазным ножом.
    3. Перенесите секции на предметное скольжение с каплей воды, затем нагрейте предметное стекло на горячей плите до тех пор, пока секции не станут плоскими и не прилипнут к поверхности слайда во время испарения воды.
    4. Накройте секции каплей 1% толуидина синего O и нагревайте их на горячей плите в течение ~10 секунд. Промойте предметное стекло проточной водой, затем дайте ему высохнуть. Проверьте срезы под обычным световым микроскопом.
  2. Резка, сбор и последующее окрашивание ультратонких срезов.
    1. Вырежьте ультратонкие участки толщиной 50-70 нм алмазным ножом. Переложите секции из ножевой лодки на сетку или медную сетку с одним щелью.
    2. Окрашивать срезы в 2% UA в течение 8 мин. Промойте решетки в рабочем ddH2O в течение 30 с.
    3. Окрашивайте срезы 1% раствором свинца в течение 6 минут. Промойте секции в проточной среде ддН2О в течение 1 минуты и высушите на воздухе.

6. Сбор и анализ данных

  1. Сбор данных ПЭМ осуществляется с помощью соответствующего программного обеспечения, например, цифровой микрофотографии (подробнее см. Таблицу материалов ).
  2. Эксплуатация осциллографа при напряжении 80 кВ. Вставьте сетку для образцов в эндоскоп, когда вакуум будет готов.
  3. Включите луч, нажав в меню «Свет». Поворачивайте ручку интенсивности на левой панели управления, пока время автоматической экспозиции не станет ~1 с. Нажмите « Начать приобретение », чтобы получить окончательное изображение.
  4. Создавайте трехмерные электромагнитные модели с помощью пакета IMOD с открытым исходным кодом.

7. Окрашивание антителами

  1. Промыть рассеченные яичники (шаг 2.16) в микропробирке объемом 1,5 мл с 1 мл 1x PBS с добавлением 0,5% Triton X-100 (PBST). Поместите трубки на шейкер для перемешивания при 40 об/мин на 10 минут. Дайте трубам постоять в стойке, а яичники опустятся под действием силы тяжести. Замените средство для стирки свежим PBST и повторите дважды.
  2. Расщепляют ткани с 2 мкг/мл протеинады К и 0,1% додецилсульфата натрия в течение 10 мин при комнатной температуре в ПБСТ.
  3. Переваренные яичники промыть в PBST три раза по 10 мин каждое мытье.
  4. Инкубировать яичники с 10% лошадиной сывороткой в PBST в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Разведите первичные антитела от 1 до 100 в блокирующем растворе (10% лошадиной сыворотки в PBS с 0,5% Triton X-100). Инкубируйте яичники с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 °C с легким встряхиванием.
  6. Промойте яичники в PBST три раза по 10 минут каждое мытье.
  7. Инкубировать яичники со вторичными антителами в течение ночи при температуре 4 °C с легким встряхиванием. Разведите все вторичные антитела в соотношении 1:300 в блокирующем растворе.
  8. Промойте яичники в PBST три раза, следя за тем, чтобы первое и третье промывки длились 10 минут. Окрашивайте ядра яичников препаратом Hoechst 33342 в разведении 1:300 в PBST в течение 30 минут при комнатной температуре во время второго промывки.
  9. Установите завязи на предметные стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для продления сигналов флуоресценции можно использовать монтажник с защитой от выцветания.

Результаты

Представленный здесь метод был описан Guo et al.21. Ключом к успешному рассечению является правильное определение пигментации яичников и направляющих положения. Стратегия метода заключается в переходе от широких позиций к определенному месту. Во-первых, что?...

Обсуждение

Эти основанные на фиксации процедуры рассечения планарных яичников облегчат понимание мейоза ооцитов, а также развития и регенерации яичников. Размеры ооцитов и их соматических поддерживающих клеток могут варьироваться от 20 мкм до 50 мкм. Методы, основанные на диссек...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа была поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза (LK и ASA) и Фондом Хелен Хэй Уитни (LHG).

С оригинальными данными, лежащими в основе этой рукописи, можно ознакомиться в репозитории оригинальных данных Stowers по адресу http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710EM grade
2% aqueous OsO4Electron Microscopy Sciences19152
50% glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16320EM grade
Digital MicrographGatan Inc.Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resinElectron Microscopy Sciences14120Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
EthanolTed Pella19207Denatured
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Horse serumSigmaH1138
Lead AcetateElectron Microscopy Sciences6080564
MilliQ waterreverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Propylene oxideElectron Microscopy Sciences75569EM grade
 Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
Toluidine blue OElectron Microscopy Sciences92319
Transmission Electron MicroscopeFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences541093

Ссылки

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550 (1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69 (2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175 (2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364 (2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457 (2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030 (2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609 (2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607 (2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5 (2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120 (2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K., Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. . Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. , 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены