用于超微结构分析和抗体染色的涡虫卵巢解剖

摘要

该协议介绍了解剖淡水涡虫 Schmidtea mediterranea 卵巢的步骤。解剖的卵巢与抗体免疫染色和超微结构分析与透射电子显微镜兼容，以研究卵母细胞和体细胞的细胞生物学，提供以前无法获得的成像深度和质量。

摘要

生殖细胞的可及性允许研究生殖细胞发育、减数分裂和重组。淡水涡虫的有性生物型 Schmidtea mediterranea 是一种强大的无脊椎动物模型，用于研究生殖细胞的表观遗传规范。与大量的睾丸和雄性生殖细胞不同，涡虫卵母细胞相对难以定位和检查，因为只有两个卵巢，每个卵巢有 5-20 个卵母细胞。涡虫体内更深的定位和缺乏保护性上皮组织也使得直接解剖涡虫卵巢变得具有挑战性。

该协议使用简短的固定步骤来促进涡虫卵巢的定位和解剖，以便进行下游分析以克服这些困难。解剖的卵巢适合通过透射电子显微镜 （TEM） 和抗体免疫染色进行超微结构检查。该方案中概述的解剖技术还允许进行基因扰动实验，其中在不同的 RNA 干扰 （RNAi） 条件下检查卵巢。通过该方案实现对卵巢中完整生殖细胞的直接访问将大大提高成像深度和质量，并允许对卵母细胞生物学进行细胞和亚细胞询问。

引言

已通过在许多组织中使用 TEM 检查了涡虫解剖结构 1,2,3,4,5,6。然而，很少关注卵巢或卵母细胞。卵母细胞文献的缺乏部分是由于难以接近这些细胞，这使得涡虫卵母细胞的生物学在很大程度上未得到探索。分子工具使用光学或荧光显微镜揭示了涡虫卵巢发育的许多调节机制 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 .所有这些实验都是在整条蠕虫或整条蠕虫的组织学切片上进行的。整条蠕虫的抗体染色和原位杂交方案涉及广泛的漂白、洗涤和组织透明化步骤，这些步骤非常耗时，需要几天时间。

此处描述的方法的总体目标是提供完整的、解剖的涡虫卵巢和卵母细胞的可及性，这将消除漂白或组织切片的必要性，并缩短抗体染色和 原位杂交 中洗涤和组织透明化的时间。解剖的卵巢还将提高探针或抗体的穿透性，并增加光学和电子显微镜的成像深度和质量。可及解剖的卵巢和卵母细胞，允许以细胞和亚细胞分辨率对整个完整卵母细胞进行细胞生物学研究。最近一项关于解剖涡虫卵巢的研究首次用 TEM 和共聚焦显微镜表征了涡虫卵母细胞减数分裂²¹。这项工作全面描述了减数分裂过程中一种称为核膜囊泡的新现象。

在这里，我们介绍了涡虫卵巢解剖的详细程序。固定步骤足以保留卵巢细胞结构以进行解剖和下游操作（即，用于 TEM 和光学显微镜分析的处理）。鉴于它们在身体结构和组织结构上的相似性，该协议也应该为研究其他几种扁形动物物种（例如，Dugesia 或 Polycelis 属）中的卵母细胞及其细胞核提供广泛的信息。该协议可能与 Macrostomum lignano 无关，因为它们体积小且身体结构几乎透明，这将允许直接观察卵巢和卵母细胞 22,23,24。在某些物种（例如，Dugesia ryukyuensis ^9,25）中，包含卵巢的体区比地中海链球菌在视觉上更容易区分（例如，深色或浅色）。对这些物种的研究可以较少地依赖于此处介绍的在 S. mediterranea 中定位卵巢的指南，但利用固定和解剖条件。

研究方案

1. 准备工作

1. 准备蠕虫:每周两次用有机肝膏喂养有性涡虫，以达到性成熟。
   注意:通常，这种蠕虫的长度大于 1 厘米，并且在咽口后方有一个 gonopo。
2. 准备解决方案。
   1. 准备以下试剂:16% 多聚甲醛 （PFA）;50% 戊二醛 （GA） 水溶液;N-乙酰基-L-半胱氨酸 （NAC）;1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO 4 和 2 mM KH 2 PO 4 。
   2. 用 PBS 稀释 50% GA 和 16% PFA 至最终 2.5% GA 和 2% PFA 的混合物。用 PBS 将 16% PFA 稀释至终浓度为 4% PFA。
   3. 将 5 g NAC 溶解在 100 mL PBS 中，制成 5% 的工作溶液。

2. 收集卵巢

1. 在室温下用 5% NAC 在培养皿中处理性成熟蠕虫 5 分钟。
   注意:大蠕虫可能会蜷缩起来。可以使用刷子或移液器吸头将蠕虫压平。使用的 5% NAC 的量是最小的，足以覆盖培养皿的表面。
2. 用 10 mL 新鲜制备的 4% 多聚甲醛替换 NAC，并在室温下将蠕虫固定 1 小时，偶尔摇晃。加入 4% PFA 后 10 分钟开始解剖，并在固定蠕虫时在 4% PFA 中进行解剖。
3. 观察上皮色素沉着以定位腹侧神经索，腹侧神经索显示为两条色素沉着较浅的线，从头前神经节向尾部延伸。
4. 找到卵巢。
   注意:卵巢位于内侧神经索的正旁边（图 1A）。依靠上皮色素沉着来定位卵巢在前后方向的位置。理想情况下，卵巢区域腹侧上皮细胞的色素沉着比周围区域浅。在一些蠕虫中，腹侧上皮细胞的色素沉着不能提供足够的信心。这些蠕虫可以丢弃，因为有些蠕虫的卵巢可能没有发育良好。
5. 一旦通过色素沉着定位推定的卵巢，验证卵巢的位置。
   注意:首先，卵巢位于头神经节的后方。其次，深色睾丸位于卵巢上方背侧。卵巢位于最前部睾丸的前面（图1B）。有时，睾丸叶位于卵巢水平或略微前方。
6. 使用两把手术刀切开两个卵巢的前后（图 1C）以完全去除前部和后部蠕虫碎片。用一把刀固定蠕虫并清洁另一把用于切割的刀。
7. 切开卵巢碎片的中线以分离两个卵巢。翻转碎片，使腹侧朝下。
8. 用两对尖头镊子（5-SA 型）剥去背组织，露出肠道（图 1D）。
   注意:圆顶形子房位于肠支下方。
9. 用镊子的尖端或软刷轻轻去除位于腹侧组织上方的肠道分支，以露出卵巢（图 1E）。
10. 去除周围组织以取出卵巢（图 1F，G）。
11. 取出卵巢并将其转移到 1.5 mL 试管中，用 1 mL PBS 洗涤。

3. TEM 固定

1. 在 PBS 中洗涤卵巢 10 分钟，轻轻摇晃。保持管子直立，让卵巢在重力作用下沉到底部。重复洗涤一次。
   注意:如果卵巢没有下沉，请用微型台式离心机（最大速度 2000 × g）轻轻旋转 15 秒。
2. 用 2% PFA/2.5% GA/PBS 替换 PBS。
3. 将样品在室温下在摇床上以 40 rpm 固定 1 小时。
4. 将样品在 4 °C 的固定剂中以 40 rpm 的摇床保存过夜。

4. TEM 样品处理

1. 在 PBS 中洗涤卵巢 3 次，每次 10 分钟。
2. 用双蒸水 （ddH₂O） 洗涤卵巢 3 次，每次 10 分钟。
3. 将卵巢在 2% OsO₄ 水溶液中后固定 1-2 小时，在室温下或在 4 °C 下过夜。
   注意:在此步骤中，样品容器需要用封口膜密封。用反渗透处理的水制备 2% OsO₄ （参见 材料表）。
4. 用 ddH₂O 冲洗样品 3 次，每次 10 分钟。
5. 在 4 °C 下在 2% 乙酸铀酰 （UA） 水中对卵巢进行预染色过夜。
   注意:UA 解决方案在使用前需要进行筛选; en bloc 染色期间避免光照。用反渗透处理的水制备 2% OsO₄ （参见 材料表）。
6. 用 ddH₂O 4 次冲洗样品，轻轻搅拌，每次 10 分钟。
7. 在分级乙醇系列（30%、50%、70%、95% 和两次 100%，每种溶液 10 分钟）中脱水卵巢，然后在环氧丙烷中孵育两次（10 分钟）平衡它们。
8. 对于树脂浸润，将样品在 50% 环氧丙烷/50% 液体环氧树脂混合物中于 4 °C 孵育过夜。 用 100% 环氧树脂浸润样品，轻轻搅拌 3 次变化（每次变化 1 小时）。
9. 将卵巢包埋在 100% 环氧树脂中，并在 60 °C 下将树脂聚合 48 小时。

5. 超薄切片机

1. 使用光学显微镜进行块状修剪和样品检查
   1. 用剃须刀片将样品块修剪成金字塔形状。
   2. 用玻璃刀或金刚石刀切割 1-2 μm 厚的切片。
   3. 将切片转移到装有一滴水的载玻片上，然后在热板上加热载玻片，直到切片变平并在水分蒸发过程中粘附在载玻片表面。
   4. 用 1% 甲苯胺蓝 O 滴覆盖切片，并在热板上加热 ~10 秒。用流水冲洗玻片，然后晾干。在常规光学显微镜下检查切片。
2. 超薄切片切割、收集和后染色。
   1. 用金刚石刀切割 50-70 nm 厚的超薄切片。将切片从刀式水舟转移到网状或单槽铜格栅上。
   2. 用 2% UA 染色切片 8 分钟。在运行 ddH₂O 中清洗网格 30 秒。
   3. 用 1% 铅溶液对切片染色 6 分钟。在运行 ddH₂O 中清洗切片 1 分钟并风干。

6. 数据收集和分析

1. 使用适当的软件收集 TEM 数据，例如数字显微照片（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
2. 在 80 kV 下操作示波器。真空准备好后，将样品网格插入示波器中。
3. 通过单击菜单上的 Light 来启用光束。转动左侧控制板上的 Intensity 旋钮，直到 Auto Exposure 时间为 ~1 s。单击 Start Acquire 获取最终图像。
4. 使用开源图像处理、建模和显示 （IMOD） 软件包构建三维 EM 模型。

7. 抗体染色

1. 在 1.5 mL 微量离心管中清洗解剖的卵巢（步骤 2.16），其中含有 1 mL 补充有 0.5% Triton X-100 （PBST） 的 1x PBS。将试管放在振荡器上以 40 rpm 的速度搅拌 10 分钟。让管子放在架子上，卵巢在重力作用下沉。用新鲜的 PBST 替换洗涤液，然后重复两次。
2. 在 PBST 中，在室温下用 2 μg/mL 蛋白酶 K 和 0.1% 十二烷基硫酸钠消化组织 10 分钟。
3. 在 PBST 中洗涤消化的卵巢 3 次，每次洗涤 10 分钟。
4. 将卵巢与 10% 马血清的 PBST 溶液在室温下孵育 1 小时。
5. 在封闭溶液（PBS 中的 10% 马血清和 0.5% Triton X-100）中稀释一抗 1 至 100。将卵巢与一抗在 4 °C 下孵育过夜，轻轻摇动。
6. 在 PBST 中洗涤卵巢 3 次，每次洗涤 10 分钟。
7. 将卵巢与二抗在 4 °C 下孵育过夜，轻轻摇动。在封闭溶液中以 1:300 稀释所有二抗。
8. 在 PBST 中洗涤卵巢 3 次，确保第一次和第三次洗涤持续 10 分钟。在第二次洗涤中，在室温下用 PBST 中 1:300 稀释的 Hoechst 33342 对卵巢核染色 30 分钟。
9. 将卵巢安装在载玻片上。
   注:抗褪色封片剂可用于延长荧光信号。

结果

这里介绍的方法已由 Guo 等人描述²¹。成功解剖的关键是识别卵巢色素沉着并正确定位导板。该方法的策略是从广泛的位置移动到特定位置。首先，要实现这一目标，依靠背侧和腹侧色素沉着模式（图 1A、B）。卵巢所在的腹侧色素沉着在 5% NAC 处理和 4% PFA 固定后会变白。如果使用的蠕虫不能提供明显的色素沉着区分，?...

讨论

这些基于固定的涡虫卵巢解剖程序将有助于理解卵母细胞减数分裂以及卵巢发育和再生。卵母细胞及其体细胞支持细胞的大小范围为 20 μm 至 50 μm。基于解剖的方法将提供对完整单卵巢细胞的可及性，这是切片或基于整体安装的方法无法实现的。该协议将有助于在细胞和亚细胞分辨率下研究完整的涡虫卵巢解剖结构和卵母细胞生物学。

这些程序需要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	EM grade
2% aqueous OsO4	Electron Microscopy Sciences	19152
50% glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320	EM grade
Digital Micrograph	Gatan Inc.		Version 2.33.97.1, TEM data collection
Epon resin	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin
Ethanol	Ted Pella	19207	Denatured
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Horse serum	Sigma	H1138
Lead Acetate	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ water			reverse-osmosis treated water
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	75569	EM grade
Proteinase K	Thermo Fisher Scientific	25530049
Toluidine blue O	Electron Microscopy Sciences	92319
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	541093