نموذج القوارض الإقفارية التامور سليمة

Summary

يحدد هذا البروتوكول خطوات إحداث احتشاء عضلة القلب في الفئران مع الحفاظ على التامور ومحتوياته.

Abstract

أظهر هذا البروتوكول أن التامور ومحتوياته يلعبان دورا أساسيا مضادا للتليف في نموذج القوارض الإقفارية (ربط الشريان التاجي للحث على إصابة عضلة القلب). تتطلب غالبية نماذج احتشاء عضلة القلب قبل السريرية تعطيل سلامة التامور مع فقدان البيئة الخلوية المتجانسة. ومع ذلك ، فقد تم تطوير منهجية مؤخرا من قبلنا للحث على احتشاء عضلة القلب ، مما يقلل من تلف التامور ويحتفظ بعدد الخلايا المناعية المقيمة في القلب. وقد لوحظ تحسن في الانتعاش الوظيفي للقلب في الفئران ذات مساحة التامور السليمة بعد ربط الشريان التاجي. توفر هذه الطريقة فرصة لدراسة الاستجابات الالتهابية في الفضاء التاموري بعد احتشاء عضلة القلب. يمكن الجمع بين التطوير الإضافي لتقنيات وضع العلامات مع هذا النموذج لفهم مصير ووظيفة الخلايا المناعية التامورية في تنظيم الآليات الالتهابية التي تدفع إعادة تشكيل القلب ، بما في ذلك التليف.

Introduction

حتى يومنا هذا ، يتم التعرف على أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) باعتبارها السبب الرئيسي للوفاة على مستوى العالم ، مما يؤدي إلى عبء مالي كبير وانخفاض في نوعية حياة المريض¹. مرض الشريان التاجي (CAD) هو نوع فرعي من الأمراض القلبية الوعائية ويلعب دورا أساسيا في تطور احتشاء عضلة القلب (MI) ، وهو مساهم رئيسي في الوفيات. بحكم التعريف ، ينتج MI عن إصابة لا رجعة فيها لأنسجة عضلة القلب بسبب الظروف المطولة لنقص التروية ونقص الأكسجة. تفتقر أنسجة عضلة القلب إلى القدرة على التجديد ، لذا فإن الإصابات دائمة وتؤدي إلى استبدال عضلة القلب بندبة ليفية يمكن أن تكون وقائية في البداية ولكنها تساهم في النهاية في إعادة تشكيل القلب الضار وفشل القلب في نهاية المطاف².

على الرغم من أن إدارة المرضى الذين يعانون من CAD قد تحسنت بشكل كبير خلال العقود القليلة الماضية ، إلا أن قصور القلب المزمن (CHF) الثانوي لنقص التروية يؤثر على العديد من المرضى في جميع أنحاء العالم. للوقاية من هذا الوباء وإدارته ، من الضروري فهم الآليات الأساسية على نطاق أوسع وتطوير مناهج علاجية جديدة. علاوة على ذلك ، تسلط النتائج السابقة الضوء على قيود العلاج الجهازي وضرورة تطوير بدائل دقيقة. بالنظر إلى أن التحقيق في العواقب الجزيئية ل MI في البشر يتأثر بالقدرة على الوصول إلى الأنسجة المحتشدة ، فإن النماذج الحيوانية التي تلخص خصائص وتطور MI البشري و CHF المتعلقة بالأمراض القلبية الوعائية لا غنى عنها.

نظرا لأن النماذج الحيوانية المثالية تشبه إلى حد كبير الاضطراب البشري للخصائص الهيكلية والوظيفية ، يجب أن توجه مسببات المرض تصورها. في CAD ، هو تضيق تصلب الشرايين المزمن للشرايين التاجية أو انسداد الخثار الحاد. تم تطوير طرق مختلفة وتطبيقها في أنواع مختلفة من المختبر للحث على تضييق الشريان التاجي أو انسداده. يمكن تصنيف هذه الاستراتيجيات على نطاق واسع إلى مجموعتين: (1) التلاعب الميكانيكي للشريان التاجي للحث على MI و (2) تسريع تصلب الشرايين لتسهيل تضييق الشريان التاجي مما يؤدي إلى MI. تتضمن الاستراتيجية الأولى عادة إما ربط الشريان التاجي أو وضع دعامة داخل الشريان. يميل النهج الثاني إلى الاعتماد على تعديل النظام الغذائي للحيوان ليشمل الأطعمة الغنية بالدهون / الكوليسترول. بعض القيود على هذا النهج الأخير تشمل عدم السيطرة على توقيت وموقع انسداد الشريان التاجي.

في المقابل ، فإن الحث الجراحي ل MI أو نقص التروية في نموذج حيواني له العديد من المزايا ، مثل الموقع والتوقيت الدقيق ومدى الحدث التاجي ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر قابلية للتكرار. الطريقة الأكثر استخداما هي الربط الجراحي للشريان التاجي النازل الأمامي الأيسر (LAD). تلخص هذه النماذج الاستجابات البشرية للإصابة الإقفارية الحادة ، بالإضافة إلى التقدم إلى^{CHF 3}. تم تطوير جراحة LAD على الحيوانات الصغيرة مثل القوارض في البداية في الحيوانات الكبيرة ، وأصبحت أكثر جدوى مع التقدم التكنولوجي⁴. في إنشاء مثل هذه النماذج ، تم تفضيل الفئران لأسباب مختلفة ، بما في ذلك توافرها النسبي ، وانخفاض النفقات في السكن ، وقدرتها على التلاعب الجيني.

تتطلب النماذج الجراحية المعاصرة لأمراض القلب الإقفارية باستخدام انسداد LAD من الباحث فتح التامور لربط الشريان بشكل مؤقت أو دائم⁵. تؤدي هذه الاستراتيجيات إلى تعطيل مساحة التامور ، والتي تلعب وظيفة ميكانيكية وتزليق بشكل أساسي لضمان وظيفة القلب المناسبة. عيب آخر لفتح التامور هو فقدان سائل التامور الأصلي للحيوان بمكوناته الخلوية والبروتينية المختلفة ^6,7. ردا على ذلك ، تم تطوير طريقة للحث على MI مع الحفاظ على التامور سليمة من قبلنا. بالإضافة إلى تقليل اضطراب هذه البيئة المتجانسة ، يسمح هذا النهج بوضع علامات على خلايا معينة وتتبعها بعد التسبب في MI. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل هذا النهج بشكل أفضل إصابة نقص تروية عضلة القلب في البيئة البشرية.

Protocol

تم استخدام ذكور وإناث الفئران C57BL / 6J بين 8-14 أسبوعا من العمر لهذه التجارب. حصل هذا البروتوكول على موافقة أخلاقية من لجنة رعاية الحيوان في جامعة كالجاري ويتبع جميع إرشادات رعاية الحيوان.

1. إعداد الماوس والجراحة

1. تعقيم الأدوات الجراحية (عن طريق معقم الخرز أو الأوتوكلاف).
2. وزن الماوس للوزن قبل الجراحة والجرعة المسكنة.
3. ضع الماوس في صندوق تحريضي يحتوي على 4٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين. تأكيد الطائرة المخدرة عن طريق معسر أصابع القدم ومراقبة الحيوان لعدم وجود رد فعل.
4. حقن مسكن تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ من البوبرينورفين) (انظر جدول المواد).
5. ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة أثناء الجراحة وحافظ على التخدير مع 3٪ إيزوفلوران يتم توصيله عبر مخروط الأنف. ضع مرهم العيون لتجنب جفاف العين على كل عين.
6. حلق الشعر من مناطق جراحة الصدر والرقبة.
7. كبح الكفوف من الماوس ووضعها على طاولة الجراحة.
8. قم بتنبيب الماوس عن طريق إدخال قسطرة ناعمة 23 G في القصبة الهوائية عبر الفم والبلعوم.
   1. قم بتهوية الفأر بعد التنبيب بنسبة 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين كغاز حامل باستخدام جهاز تهوية تجاري (انظر جدول المواد) مضبوط بمعدل 110 نفسا / دقيقة ، وحجم مد وجزر يبلغ 250 ميكرولتر ، وضغط زفير نهائي إيجابي (PEEP) يبلغ 4 مم زئبق.
9. لف الماوس بنسبة 30٪ على جانبه الأيمن لوضع الجانب الأيسر من الصدر لإجراء الجراحة.
10. نظف المنطقة الجراحية ب 3 مقشرات متناوبة من 70٪ إيثانول وبيتادين بحركة دائرية (انظرجدول المواد). ضع ستائر جراحية معقمة حول منطقة الجراحة.
11. قم بعمل شق جانبي 2-3 سم في جلد الصدر لتصور عضلات الصدر على الجانب الأيسر. قطع الصدرية الكبرى والصغرى باستخدام شق 1 سم من خط الوسط إلى الخارج لتصور العضلات الوربية بين الضلعين الثالث والرابع.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب النزيف الزائد من العضلة الصدرية من خلال الكي من الأوعية النزيفية.
12. قم بعمل شق 2 سم في العضلة الوربية اليسرى لإدخال الهواء (عن طريق حركة الهواء السلبي) في تجويف الصدر للسماح للقلب والرئتين بالسقوط بعيدا عن الشق الجراحي. علاوة على ذلك ، قم بتوسيع الفتحة بمساعدة جهاز الكي (انظر جدول المواد) لشق الوربي ومنع النزيف
    ملاحظة: يجب إيقاف جهاز التنفس الصناعي مؤقتا خلال فترة الكي لتجنب التفاعلات المتفجرة مع الأكسجين. يتم الحرص على عدم إتلاف كيس التامور.
13. باستخدام المبعدات ، اسحب الأضلاع لفضح القلب.
14. مراقبة التامور والقلب الكامن تحت المجهر المجسم.
    ملاحظة: تأمور الفأر رقيق بما يكفي لتصور الأوعية الدموية للقلب.
15. ضع الملقط برفق على سطح التأمور لتقليل حركته وحركة القلب الأساسي.
16. معلم بصريا الشريان التاجي الأمامي الأيسر النازل (LAD) من خلال تتبع ظهوره من تحت الزائدة اليسرى.
17. باستخدام محرك الإبرة الدقيقة ، قم بتوجيه خياطة مناسبة (انظر جدول المواد) من خلال التامور ، تحت LAD ، مع ظهور الخيط على الجانب الآخر من LAD والتامور. اربط الخيط لتقييد تدفق الدم عبر الشريان التاجي وتقليم الخيط الزائد بمساعدة المقص (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: عند تقييد تدفق الدم إلى الشريان التاجي ، يجب أن يكون ابيضاض الجزء الأمامي من البطين الأيسر مرئيا. يمثل هذا الإجراء نموذج ربط دائم. ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق نهج ربط عابر مع فترات نقص تروية مختلفة في هذه المرحلة.
18. أسفل موقع الشق داخل المنطقة المعقمة ، أدخل قسطرة 24 G عن طريق الجلد في الصدر (قم بإزالة إبرة التوجيه بعد دخول تجويف الصدر). ثم أغلق الأضلاع متبوعة بطبقات العضلات والجلد باستخدام خياطة مناسبة (إبرة مستدقة للعضلات ، إبرة قطع تقليدية للجلد).
19. بمجرد إغلاق الصدر ، قم بإخلاء الهواء المتبقي من تجويف الصدر عبر قسطرة 24 G باستخدام شفط لطيف مع حقنة 3 مل وضغطات على الصدر. بمجرد إزالة الهواء ، اسحب قسطرة 24 G.
20. تقليل إيزوفلوران إلى 1 ٪.
21. قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران مع الحفاظ على التهوية بالأكسجين للسماح للفأر بالتعافي من التخدير. بمجرد أن يظهر الحيوان علامات التنفس بشكل مستقل ، قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية 23 G من الفم وضع الفأر في قفص الاسترداد ليتم مراقبته لاستئناف التنفس الطبيعي.
22. اسمح للماوس بالتعافي في القفص مع وضع جزء من القفص على وسادة تدفئة لتوفير مصدر حرارة خارجي.
23. توفير حقن الصيانة من مسكن (البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ، تحت الجلد) كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد الجراحة.
24. مراقبة الحالة الصحية للفئران يوميا لمدة 7 أيام ، والتي تشمل تقييم الشقوق وعدم الراحة الحيوانية.
    ملاحظة: بسبب غزو هذا الإجراء (بضع الصدر) ، قد يكون من الضروري إعطاء المضادات الحيوية.

2. التقييم الوظيفي لوظيفة القلب عن طريق تخطيط صدى القلب (ECG)

1. حث الماوس والحفاظ عليه تحت التخدير العام مع 1.5-2٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين.
2. ضع الماوس في وضع ضعيف على منصة مرحلة ساخنة وقم بتوصيل الكفوف بأسلاك تخطيط القلب.
3. حلق صدر الماوس.
4. الحصول على صور تخطيط صدى القلب باستخدام مسبار محول طاقة خطي 40 ميجاهرتز وهلام الاتصال وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب (انظر جدول المواد).
5. قم بإيقاف تشغيل isoflurane واترك الماوس يتعافى على منصة التسخين قبل إعادة القفص إلى حالة نشطة.
   ملاحظة: تقييم تخطيط صدى القلب غير جراحي وبالتالي يمكن إجراؤه طوليا طوال التجربة لتحديد التغييرات قبل وبعد ربط الشريان التاجي.

3. جمع أنسجة القلب لتلطيخ التليف

1. التضحية الفئران مع استنشاق 100 ٪ CO₂ وتشريح القلب بعناية.
   ملاحظة: باستخدام المقص والملقط ، يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع الأوعية الكبيرة التي تدخل (الوريد الأجوف ، الوريد الرئوي) والخروج (الشريان الرئوي ، الشريان الأورطي) القلب لتحريره من الدورة الدموية في التجويف الصدري.
2. إصلاح القلب في 10 ٪ الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل.
3. قطع العينات باستخدام شفرة حلاقة مستقيمة من خلال البطين الأيمن والحاجز بين البطينين والبطين الأيسر ، مما يضمن مرور الشق عبر مركز منطقة الاحتشاء. ثم يتم إرسال العينات إلى المرفق الأساسي لتضمين البارافين.
4. قطع أقسام الأنسجة بسمك 5 ميكرومتر مع ميكروتوم ووضعها على شرائح زجاجية للتلطيخ.
5. قم بإزالة البارافين باستخدام الزيلين التجاري وغسول الكحول المتدرج (2x 99٪ ، 1x 95٪ ، 1x 70٪) بالماء منزوع الأيونات ، ثم أعد الترطيب.
6. وصمة عار مع 0.1 ٪ سيريوس الأحمر في حمض البكريك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. اغسل المقاطع بحمض الخليك 0.5٪ لمدة 3 دقائق واشطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
8. قم بتجفيف الأقسام باستخدام الترتيب العكسي للغسيل الموضح في 3.4 ، مع زيادة تركيزات الإيثانول المتدرجة ثم الزيلين.
9. قم بتركيب أقسام الأنسجة بمحلول تركيب (انظر جدول المواد) للتقييم المجهري.

4. التدفق الخلوي للقلب وغسل تجويف التامور

1. التضحية الفئران مع استنشاق 100 ٪ CO₂ للتأثير.
2. ضع الماوس على ظهره وثبت الذراعين والساقين على لوحة جراحية باستخدام شريط لاصق.
3. افتح بعناية الجانب الأيسر (الجانب الأيمن من وجهة نظر المجرب) من التجويف الصدري ، بدءا من قطع الحجاب الحاجز إلى نقطة المنتصف تقريبا ثم قطع الأضلاع الخارجية باتجاه القص.
   ملاحظة: تجنب وخز الأوعية الدموية الكبيرة، وخاصة تلك التي تعمل بالتوازي مع القص.
4. سحب الأضلاع باستخدام مرقئ لفضح القلب الأساسي والتأمور.
   ملاحظة: التامور هش للغاية ، لذا تأكد من عدم التقاطه بالمقص أثناء القطع.
5. باستخدام أنبوب PE-10 (انظر جدول المواد) يتم إدخال قسطرة في الفضاء التاموري بالقرب من تقاطع الأذين الأيسر والبطين الأيسر ، قم بحقن 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في تجويف التامور.
   1. اسمح لمحلول ملحي بالتجمع والتجمع من الجانب الخلفي للقلب ، مع الحرص على عدم ثقب أو تمزق التامور في هذه العملية. كرر هذه الخطوة مرتين وضع سائل الغسيل على الثلج أثناء معالجة القلب.
6. استئصال القلب عن طريق قطع الأوعية الرئيسية (الشريان الأورطي والشريان الرئوي والوريد والوريد الأجوف) التي تدخل القلب وتخرج منه. أزل الأذينين الأيمن والأيسر ووزن أنسجة القلب البطينية.
7. فرم الأنسجة في قطعة صغيرة 1 مم² باستخدام مقص وضعها في 10 مل من مخزن الهضم الذي يحتوي على 450 وحدة / مل من كولاجيناز I ، و 125 وحدة / مل من كولاجيناز الحادي عشر ، و 60 وحدة / مل من DNase I ، و 60 وحدة / مل من الهيالورونيداز في PBS لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري.
8. مرر أنسجة القلب المتجانسة من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر (انظر جدول المواد) وقم بتدويرها لأسفل عند 60 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا المتنية القلبية.
9. اجمع المادة الطافية ، وقم بتمريرها عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر (انظر جدول المواد) للحصول على تعليق خلية واحدة ، وقم بتدويرها لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
10. إجراء حجب مستقبلات الشظايا القابلة للتبلور (Fc) وتلطيخ العلامات الخلوية على خلايا التامور والقلب كما هو موضح سابقا⁸.
11. قم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي.

5. وضع العلامات على البلاعم التامورية باستخدام طريقة النهج الوربي للفضاء الجنبي (ICAPS)⁹

1. تعقيم الأدوات الجراحية (عن طريق معقم الخرز أو الأوتوكلاف) ورش 70٪ من الإيثانول قبل البدء.
2. حث الماوس والحفاظ عليه تحت التخدير العام مع 1.5-2٪ إيزوفلوران و 800 مل / دقيقة من الأكسجين. تأكيد الطائرة المخدرة عن طريق معسر أصابع القدم ومراقبة الحيوان لعدم وجود رد فعل.
3. حقن مسكن تحت الجلد (البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ).
4. ضع الماوس على وسادة جراحية ساخنة أثناء الجراحة.
5. حلق المنطقة الصدرية الأمامية الجانبية اليمنى.
6. تنظيف المنطقة الجراحية مع الإيثانول والبيتادين.
7. قم بعمل شق بطول 3 سم في الجلد ، ومع ملقط فضح القفص الصدري.
8. قم بتحميل 5 ميكرولتر من حبات الفلورسنت (الكريات المجهرية الفلورية المتاحة تجاريا ، 1 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) و 45 ميكرولتر من المحلول الملحي في قسطرة حقنة أنابيب PE-10 بطرف مشطوف.
9. قم بتوجيه القسطرة إلى الفضاء الوربي كما هو موضح سابقا⁹ ، وقم بحقن محلول الخرزة ببطء وإزالة القسطرة بحركة واحدة.
10. أغلق الجلد باستخدام الدبابيس.
    ملاحظة: يتم استخدام الدبابيس بدلا من الغرز لتقليل احتمال إعادة فتح الشق.
11. قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، ضع الماوس في قفص الاسترداد وراقب المضاعفات خلال أول 24 ساعة.

النتائج

تم تحسين نموذج ربط الشريان التاجي المعدل هذا لتحقيق قابلية التكاثر وبقاء الحيوان. ومع ذلك ، نظرا للإصابة الكبيرة التي تحدث في القلب ، ترتبط بعض الوفيات المتوقعة أثناء الجراحة وبعدها بالإجراء. عادة ما يكون معدل الوفيات القياسي أعلى في الذكور (~ 25-35٪) منه في الإناث (~ 10-15٪).

يجب أ...

Discussion

يعد تحريض MI في التامور المغلق في القوارض فريدا ويمكن أن يكون له تطبيقات مهمة محتملة. يعتمد الإجراء بشكل كبير على معرفة الجراح بنموذج القوارض وتشريح قلب القوارض. يعتمد النجاح أيضا على الرعاية المقدمة خلال ثلاث خطوات حاسمة: شق العضلات الوربية وتراجع الضلع (الخطوات 1.11-1.13) ، وإنشاء الاحتشاء (ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics