Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

Resumo

Este protocolo descreve as etapas para induzir o infarto do miocárdio em camundongos, preservando o pericárdio e seu conteúdo.

Resumo

Este protocolo mostrou que o pericárdio e seu conteúdo desempenham um papel antifibrótico essencial no modelo isquêmico de roedores (ligadura coronariana para induzir lesão miocárdica). A maioria dos modelos pré-clínicos de infarto do miocárdio requer a ruptura da integridade pericárdica com perda do meio celular homeostático. No entanto, recentemente uma metodologia foi desenvolvida por nós para induzir o infarto do miocárdio, o que minimiza os danos pericárdicos e retém a população de células imunes residentes do coração. Foi observada uma melhora da recuperação funcional cardíaca em camundongos com um espaço pericárdico intacto após a ligadura coronariana. Este método oferece uma oportunidade para estudar as respostas inflamatórias no espaço pericárdico após o infarto do miocárdio. O desenvolvimento adicional das técnicas de marcação pode ser combinado com este modelo para entender o destino e a função das células imunes pericárdicas na regulação dos mecanismos inflamatórios que impulsionam o remodelamento no coração, incluindo a fibrose.

Introdução

Até hoje, a doença cardiovascular (DCV) é reconhecida como a principal causa de morte em todo o mundo, resultando em uma significativa carga financeira e redução na qualidade de vida do paciente¹. A doença arterial coronariana (DAC) é um subtipo de DCV e desempenha um papel essencial no desenvolvimento do infarto do miocárdio (IM), que é um dos principais contribuintes para a mortalidade. Por definição, o IAM resulta de lesão irreversível do tecido miocárdico devido a condições prolongadas de isquemia e hipóxia. O tecido miocárdico carece de capacidade de regeneração, de modo que as lesões são permanentes e resultam na substituição do músculo cardíaco por uma cicatriz fibrótica que pode ser inicialmente protetora, mas acaba contribuindo para o remodelamento cardíaco adverso e eventual insuficiência cardíaca².

Embora o manejo de pacientes com DAC tenha melhorado drasticamente nas últimas décadas, a insuficiência cardíaca crônica (ICC) secundária à isquemia afeta muitos pacientes em todo o mundo. Para prevenir e gerenciar essa epidemia, é necessário entender os mecanismos subjacentes mais extensivamente e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Além disso, achados passados destacam as limitações da terapia sistêmica e a necessidade de desenvolver alternativas precisas. Dado que a investigação das sequelas moleculares do IAM em humanos é afetada pela capacidade de acessar o tecido infartado, modelos animais que recapitulam as características e o desenvolvimento do IAM humano e da ICC relacionados às DCV são indispensáveis.

Como os modelos animais ideais se assemelham muito a um distúrbio humano por características estruturais e funcionais, a etiologia da doença deve orientar sua concepção. Na DAC, é a estenose aterosclerótica crônica das artérias coronárias ou oclusão trombótica aguda. Diferentes métodos têm sido desenvolvidos e aplicados em várias espécies de animais de laboratório para induzir o estreitamento ou oclusão da artéria coronária. Tais estratégias podem ser amplamente classificadas em dois grupos: (1) manipulação mecânica de uma artéria coronária para induzir um IAM e (2) aterosclerose acelerada para facilitar o estreitamento coronariano levando a um IAM. A primeira estratégia geralmente envolve a ligadura de uma artéria coronária ou a colocação de um stent dentro da artéria. A segunda abordagem tende a depender da modificação da dieta do animal para incluir alimentos ricos em gordura / colesterol. Algumas das limitações desta última abordagem incluem a falta de controle sobre o momento e o local das oclusões coronarianas.

Em contraste, a indução cirúrgica de IAM ou isquemia em um modelo animal tem várias vantagens, como localização, tempo preciso e extensão do evento coronariano, levando a resultados mais reprodutíveis. O método mais utilizado é a ligadura cirúrgica da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE). Tais modelos recapitulam as respostas humanas à lesão isquêmica aguda, bem como a progressão para ICC³. Inicialmente desenvolvida em animais de maior porte, a cirurgia de LAD em pequenos animais, como roedores, tornou-se mais viável com os avanços da tecnologia⁴. Ao estabelecer tais modelos, os ratos têm sido favorecidos por várias razões, incluindo sua disponibilidade relativa, baixo gasto em habitação e sua capacidade de manipulação genética.

Modelos cirúrgicos contemporâneos de cardiopatia isquêmica utilizando oclusão LAD requerem que o pesquisador abra o pericárdio para ligar temporária ou permanentemente a artéria⁵. Tais estratégias resultam na ruptura do espaço pericárdico, que desempenha uma função essencialmente mecânica e lubrificante para garantir a função cardíaca adequada. Outra desvantagem da abertura do pericárdio é a perda do líquido pericárdico nativo do animal com seus diversos componentes celulares e proteicos ^6,7. Em resposta, um método para induzir o IAM, mantendo o pericárdio intacto, foi desenvolvido por nós. Além de minimizar a perturbação desse ambiente homeostático, essa abordagem permite marcar e rastrear células específicas depois de causar um infarto do miocárdio. Além disso, essa abordagem representa melhor a lesão isquêmica miocárdica no ambiente humano.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas entre 8-14 semanas de idade foram usados para esses experimentos. Este protocolo recebeu aprovação ética do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary e segue todas as diretrizes de cuidados com animais.

1. Preparação e cirurgia do rato

1. Esterilizar ferramentas cirúrgicas (via esterilizador de contas ou autoclave).
2. Pesar o rato quanto ao peso pré-cirúrgico e à dose de analgésicos.
3. Coloque o rato numa caixa de indução com 4% de isoflurano e 800 ml/min de oxigénio. Confirme o plano anestésico beliscando os dedos dos pés e observando o animal por falta de reflexo.
4. Injetar analgésico por via subcutânea (0,1 mg/kg de buprenorfina) (ver Tabela de Materiais).
5. Coloque o rato numa almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia e mantenha a anestesia com isoflurano a 3% administrado através do cone nasal. Aplique pomada oftálmica para evitar olhos secos para cada olho.
6. Raspe o cabelo das áreas cirúrgicas do peito e pescoço.
7. Restrinja as patas do rato e posicione-as sobre a mesa cirúrgica.
8. Intubar o rato inserindo um cateter 23 G de ponta lisa na traqueia através da boca e da faringe.
   1. Ventilar o rato após a intubação com isoflurano a 2% e oxigénio a 100% como gás transportador utilizando um ventilador comercial (ver Tabela de Materiais) regulado a uma taxa de 110 respirações/min, um volume corrente de 250 μL e pressão expiratória final positiva (PEEP) de 4 mmHg.
9. Enrole o mouse 30% no lado direito para posicionar o lado esquerdo do tórax para a cirurgia.
10. Limpe a área cirúrgica com 3 esfoliantes alternados de etanol a 70% e betadine em movimento circular (verTabela de Materiais). Coloque cortinas cirúrgicas estéreis ao redor da área cirúrgica.
11. Faça uma incisão lateral de 2-3 cm na pele do peito para visualizar os músculos peitorais do lado esquerdo. Corte o peitoral maior e menor usando uma incisão de 1 cm da linha média para fora para visualizar os músculos intercostais entre a terceira e a quarta costelas.
    NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar o excesso de sangramento do músculo peitoral através da cauterização dos vasos hemorrágicos.
12. Faça uma incisão de 2 cm no músculo intercostal esquerdo para introduzir ar (por movimento passivo do ar) na cavidade torácica para permitir que o coração e os pulmões caiam da incisão cirúrgica. Além disso, expanda a abertura com a ajuda de um dispositivo de cauterização (ver Tabela de Materiais) para incidir o intercostal e prevenir o sangramento
    NOTA: O ventilador deve ser temporariamente interrompido durante o período de cauterização para evitar reações explosivas com oxigênio. Cuidados são tomados para não danificar o saco pericárdico.
13. Usando afastadores, retraia as costelas para expor o coração.
14. Observe o pericárdio e o coração subjacente sob um estereomicroscópio.
    NOTA: O pericárdio do rato é fino o suficiente para visualizar a vasculatura do coração.
15. Coloque suavemente fórceps na superfície do pericárdio para reduzir seu movimento e o do coração subjacente.
16. Marcar visualmente a artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE), traçando sua emergência sob o apêndice esquerdo.
17. Usando o driver de microagulha, guie uma sutura apropriada (ver Tabela de Materiais) através do pericárdio, sob o LAD, com a sutura emergindo do outro lado do LAD e do pericárdio. Amarre a sutura para restringir o fluxo sanguíneo através da artéria coronária e corte o excesso de sutura com o auxílio de tesoura (Figura 1A).
    NOTA: Ao restringir o fluxo sanguíneo para a artéria coronária, o branqueamento da porção anterior do ventrículo esquerdo deve ser visível. Este procedimento representa um modelo de ligadura permanente. No entanto, uma abordagem de ligadura transitória com diferentes períodos de isquemia também poderia ser aplicada nesta fase.
18. Abaixo do local da incisão dentro da área estéril, introduza um cateter 24 G percutaneamente no peito (remova a agulha guia depois de entrar na cavidade torácica). Em seguida, feche as costelas seguidas de camadas musculares e pele usando uma sutura apropriada (uma agulha cônica para o músculo, agulha de corte convencional para a pele).
19. Uma vez fechado o tórax, evacue o ar restante da cavidade torácica através do cateter 24 G usando sucção suave com uma seringa de 3 mL e compressões torácicas. Uma vez que o ar é removido, retire o cateter 24 G.
20. Reduzir o isoflurano para 1%.
21. Desligue o isoflurano enquanto mantém a ventilação com oxigênio para permitir que o rato se recupere da anestesia. Uma vez que o animal mostre sinais de respiração independente, remova o tubo traqueal de 23 G da boca e coloque o rato em uma gaiola de recuperação a ser monitorada para a retomada da respiração normal.
22. Permita que o rato recupere na gaiola com uma parte da gaiola colocada numa almofada de aquecimento para fornecer uma fonte de calor externa.
23. Fornecer injeções de manutenção de analgésico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, por via subcutânea) a cada 12 h durante 72 h pós-operatório.
24. Monitore o estado de saúde dos ratos diariamente por 7 dias, o que inclui a avaliação de incisões e desconforto animal.
    NOTA: Devido à invasividade deste procedimento (toracotomia), a administração de antibióticos pode ser necessária.

2. Avaliação funcional da função cardíaca por ecocardiografia (ECG)

1. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurano e 800 mL/min de oxigênio.
2. Coloque o rato em posição supina em uma plataforma de palco aquecida e prenda as patas aos eletrodos do ECG.
3. Raspe o peito do mouse.
4. Adquira imagens de ecocardiografia usando uma sonda de transdutor linear de 40 MHz e gel de contato e analise com o software apropriado (consulte Tabela de Materiais).
5. Desligue o isoflurano e permita que o rato recupere na plataforma de aquecimento antes de devolver a gaiola a um estado ativo.
   NOTA: A avaliação ecocardiográfica não é invasiva e, portanto, pode ser realizada longitudinalmente durante todo o experimento para determinar as alterações antes e após a ligadura coronariana.

3. Coleta de tecido cardíaco para coloração de fibrose

1. Sacrifique os ratos com inalação de 100% de CO₂ e disseque cuidadosamente o coração.
   NOTA: Usando tesoura e fórceps, isso é conseguido cortando os grandes vasos que entram (veia cava, veia pulmonar) e saem (artéria pulmonar, aorta) do coração para liberá-lo do sistema circulatório na cavidade torácica.
2. Fixe o coração em formalina a 10% por pelo menos 24 h.
3. Corte as amostras usando lâmina de barbear reta através do ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo, garantindo que a incisão passasse pelo centro da zona de infarto. As amostras são então enviadas para a instalação principal para incorporação de parafina.
4. Corte seções de tecido de 5 μm de espessura com um micrótomo e coloque-as em lâminas de vidro para coloração.
5. Desparafinizar usando xileno comercial e lavagens com álcool graduadas (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) com água deionizada, depois reidratar.
6. Coloração com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico por 2 h à temperatura ambiente.
7. Lave as seções com ácido acético a 0,5% por 3 min e enxágue com etanol a 70% por 1 min.
8. Desidratar as secções utilizando a ordem inversa das lavagens descritas no ponto 3.4, com concentrações de etanol crescentes e graduadas e, em seguida, xileno.
9. Monte seções de tecido com uma solução de montagem (ver Tabela de Materiais) para avaliação microscópica.

4. Citometria de fluxo do lavado do coração e da cavidade pericárdica

1. Sacrifique os ratos com inalação de 100% de CO₂ para o efeito.
2. Coloque o rato de costas e fixe os braços e as pernas a uma tábua cirúrgica com fita adesiva.
3. Abra cuidadosamente o lado esquerdo (lado direito da vista do experimentador) da cavidade torácica, começando com o corte do diafragma até cerca do ponto médio e, posteriormente, cortando as costelas externas em direção ao esterno.
   NOTA: Evite cortar grandes vasos sanguíneos, particularmente aqueles que correm paralelos ao esterno.
4. Retraia as costelas usando um hemostático para expor o coração subjacente e o pericárdio.
   NOTA: O pericárdio é muito frágil, por isso certifique-se de não pegá-lo com uma tesoura durante o corte.
5. Usando um cateter de tubo PE-10 (ver Tabela de Materiais) inserido no espaço pericárdico perto da junção do átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, injete 100 μL de solução salina estéril na cavidade pericárdica.
   1. Deixe a solução salina se acumular e se acumule do lado posterior do coração, tomando cuidado para não perfurar ou rasgar o pericárdio no processo. Repita este passo duas vezes e coloque o fluido de lavagem no gelo enquanto processa o coração.
6. Excise o coração cortando os principais vasos (aorta, artéria pulmonar, veia e veia cava) que entram e saem do coração. Remova os átrios direito e esquerdo e pese o tecido cardíaco ventricular.
7. Picar o tecido em pequenos pedaços de 1 mm² usando tesoura e colocar em 10 mL de tampão de digestão contendo 450 U/mL de colagenase I, 125 U/mL de colagenase XI, 60 U/mL de DNase I e 60 U/mL de hialuronidase em PBS por 1 h a 37 °C em um agitador orbital.
8. Passar homogeneizados do tecido cardíaco através de um filtro celular de 70 μm (ver Tabela de Materiais) e girar para baixo a 60 x g durante 5 min a 4 °C para remover as células do parênquima cardíaco.
9. Recolher o sobrenadante, passar por um filtro celular de 40 μm (ver Tabela de Materiais) para uma única suspensão celular e girar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C para peletizar as células.
10. Realizar bloqueio de receptores cristalizáveis (Fc) de fragmentos e coloração de marcadores celulares em células pericárdicas e cardíacas, conforme descrito anteriormente⁸.
11. Execute amostras em um citômetro de fluxo.

5. Marcação de macrófagos pericárdicos pelo método da Abordagem Intercostal do Espaço Pleural (ICAPS)⁹

1. Esterilize as ferramentas cirúrgicas (via esterilizador de contas ou autoclave) e pulverize 70% de etanol antes de começar.
2. Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 1,5-2% de isoflurano e 800 mL/min de oxigênio. Confirme o plano anestésico beliscando os dedos dos pés e observando o animal por falta de reflexo.
3. Injetar analgésico por via subcutânea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).
4. Coloque o rato numa almofada cirúrgica aquecida durante a cirurgia.
5. Raspe a área torácica anterolateral direita.
6. Limpe a área cirúrgica com etanol e betadina.
7. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento na pele e, com fórceps, exponha a caixa torácica.
8. Carregue 5 μL de esferas fluorescentes (microesferas fluorescentes comercialmente disponíveis, 1 μm, ver Tabela de Materiais) e 45 μL de solução salina em um cateter de seringa de tubulação PE-10 com uma ponta chanfrada.
9. Guie o cateter para o espaço intercostal como descrito anteriormente⁹, injete lentamente a solução do talão e remova o cateter em um movimento.
10. Feche a pele usando grampos.
    NOTA: Os grampos são usados no lugar de suturas para minimizar a potencial reabertura da incisão.
11. Desligue o isoflurano, coloque o rato na gaiola de recuperação e monitorize as complicações durante as primeiras 24 horas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este modelo de ligadura coronária modificado foi otimizado para alcançar a reprodutibilidade e a sobrevivência animal. No entanto, devido à lesão significativa induzida no coração, algumas mortalidades esperadas intraoperatórias e pós-operatórias estão associadas ao procedimento. A mortalidade padrão é tipicamente maior em homens (~ 25-35%) do que em mulheres (~ 10-15%).

A indução bem-sucedida de um IAM com a ligadura coronariana modificada deve ser evidente por alterações nos...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Induzir um IAM em um pericárdio fechado em roedores é único e pode ter aplicações potencialmente significativas. O procedimento depende muito da familiaridade do cirurgião com o modelo de roedores e a anatomia cardíaca do roedor. O sucesso também depende dos cuidados dispensados durante três etapas críticas: incisão muscular intercostal e retração da costela (Passos 1.11-1.13), criação do infarto (Passo 1.17) e recuperação animal (Passos 1.22-1.24).

A toracotomia deve ser feit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics