Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

Riepilogo

Questo protocollo delinea i passaggi per indurre l'infarto miocardico nei topi preservando il pericardio e il suo contenuto.

Abstract

Questo protocollo ha dimostrato che il pericardio e il suo contenuto svolgono un ruolo antifibrotico essenziale nel modello ischemico di roditore (legatura coronarica per indurre lesioni miocardiche). La maggior parte dei modelli preclinici di infarto miocardico richiedono l'interruzione dell'integrità pericardica con perdita dell'ambiente cellulare omeostatico. Tuttavia, recentemente abbiamo sviluppato una metodologia per indurre l'infarto miocardico, che riduce al minimo il danno pericardico e mantiene la popolazione di cellule immunitarie residenti nel cuore. È stato osservato un miglioramento del recupero funzionale cardiaco nei topi con uno spazio pericardico intatto dopo la legatura coronarica. Questo metodo offre l'opportunità di studiare le risposte infiammatorie nello spazio pericardico dopo infarto miocardico. L'ulteriore sviluppo delle tecniche di etichettatura può essere combinato con questo modello per comprendere il destino e la funzione delle cellule immunitarie pericardiche nella regolazione dei meccanismi infiammatori che guidano il rimodellamento nel cuore, compresa la fibrosi.

Introduzione

Ad oggi, le malattie cardiovascolari (CVD) sono riconosciute come la principale causa di morte a livello globale, con conseguente significativo onere finanziario e riduzione della qualità della vita dei pazienti¹. La malattia coronarica (CAD) è un sottotipo di CVD e svolge un ruolo essenziale nello sviluppo dell'infarto miocardico (IM), che è uno dei principali contributori alla mortalità. Per definizione, l'infarto miocardico deriva da lesioni irreversibili al tessuto miocardico dovute a condizioni prolungate di ischemia e ipossia. Il tessuto miocardico manca di capacità di rigenerazione, quindi le lesioni sono permanenti e comportano la sostituzione del muscolo cardiaco con una cicatrice fibrotica che può essere inizialmente protettiva, ma alla fine contribuisce al rimodellamento cardiaco avverso e all'eventuale insufficienza cardiaca².

Sebbene la gestione dei pazienti con CAD sia notevolmente migliorata negli ultimi decenni, l'insufficienza cardiaca cronica (CHF) secondaria a ischemia colpisce molti pazienti in tutto il mondo. Per prevenire e gestire questa epidemia, è necessario comprendere più ampiamente i meccanismi sottostanti e sviluppare nuovi approcci terapeutici. Inoltre, i risultati precedenti evidenziano i limiti della terapia sistemica e la necessità di sviluppare alternative precise. Dato che lo studio delle sequele molecolari dell'infarto miocardico nell'uomo è influenzato dalla capacità di accedere al tessuto infartuato, sono indispensabili modelli animali che ricapitolino le caratteristiche e lo sviluppo dell'infarto miocardico umano e della CHF correlati alla CVD.

Poiché i modelli animali ideali assomigliano molto a un disturbo umano per caratteristiche strutturali e funzionali, l'eziologia della malattia dovrebbe guidare il loro concepimento. Nella CAD, è la stenosi aterosclerotica cronica delle arterie coronarie o occlusione trombotica acuta. Diversi metodi sono stati sviluppati e applicati in varie specie di animali da laboratorio per indurre il restringimento o l'occlusione dell'arteria coronaria. Tali strategie possono essere ampiamente classificate in due gruppi: (1) manipolazione meccanica di un'arteria coronaria per indurre un MI e (2) accelerazione dell'aterosclerosi per facilitare il restringimento coronarico che porta a un IM. La prima strategia di solito comporta la legatura di un'arteria coronaria o il posizionamento di uno stent all'interno dell'arteria. Il secondo approccio tende a basarsi sulla modifica della dieta dell'animale per includere alimenti ricchi di grassi / colesterolo. Alcuni dei limiti di quest'ultimo approccio includono la mancanza di controllo sui tempi e sul sito delle occlusioni coronariche.

Al contrario, l'induzione chirurgica di infarto miocardico o ischemia in un modello animale ha diversi vantaggi, come la posizione, i tempi precisi e l'estensione dell'evento coronarico, portando a risultati più riproducibili. Il metodo più utilizzato è la legatura chirurgica dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD). Tali modelli riassumono le risposte umane al danno ischemico acuto, nonché la progressione a CHF³. Inizialmente sviluppata in animali più grandi, la chirurgia LAD su piccoli animali come i roditori è diventata più fattibile con i progressi della tecnologia⁴. Nello stabilire tali modelli, i topi sono stati favoriti per vari motivi, tra cui la loro relativa disponibilità, la bassa spesa per l'alloggio e la loro capacità di manipolazione genetica.

I modelli chirurgici contemporanei di cardiopatia ischemica che utilizzano l'occlusione LAD richiedono al ricercatore di aprire il pericardio per legare temporaneamente o permanentemente l'arteria⁵. Tali strategie comportano l'interruzione dello spazio pericardico, che svolge una funzione essenzialmente meccanica e lubrificante per garantire una corretta funzione cardiaca. Un altro svantaggio dell'apertura del pericardio è la perdita del liquido pericardico nativo dell'animale con i suoi vari componenti cellulari e proteici ^6,7. In risposta, abbiamo sviluppato un metodo per indurre l'infarto miocardico mantenendo intatto il pericardio. Oltre a ridurre al minimo la perturbazione di questo ambiente omeostatico, questo approccio consente di etichettare e tracciare cellule specifiche dopo aver causato un MI. Inoltre, questo approccio rappresenta meglio la lesione ischemica miocardica in ambito umano.

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Protocollo

Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL / 6J tra 8-14 settimane di età. Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Calgary e segue tutte le linee guida sulla cura degli animali.

1. Preparazione e chirurgia del topo

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (tramite sterilizzatore di perline o autoclave).
2. Pesare il topo per il peso prechirurgico e la dose analgesica.
3. Posizionare il mouse in una scatola di induzione con isoflurano al 4% e 800 ml/min di ossigeno. Confermare il piano anestetico pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.
4. Iniettare analgesico per via sottocutanea (0,1 mg/kg di buprenorfina) (vedere Tabella dei materiali).
5. Posizionare il topo su un tampone chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico e mantenere l'anestesia con isoflurano al 3% erogato tramite cono nasale. Applicare unguento oftalmico per evitare secchezza oculare a ciascun occhio.
6. Rasare i capelli dalle aree chirurgiche del torace e del collo.
7. Trattenere le zampe del topo e posizionarle sul tavolo chirurgico.
8. Intubare il topo inserendo un catetere 23 G a punta liscia nella trachea attraverso la bocca e la faringe.
   1. Ventilare il topo dopo l'intubazione con isoflurano al 2% e ossigeno al 100% come gas di trasporto utilizzando un ventilatore commerciale (vedi tabella dei materiali) impostato a una velocità di 110 respiri / min, un volume corrente di 250 μL e pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 4 mmHg.
9. Ruotare il mouse del 30% sul lato destro per posizionare il lato sinistro del torace per un intervento chirurgico.
10. Pulire l'area chirurgica con 3 scrub alternati di etanolo al 70% e betadine con movimenti circolari (vediTabella dei materiali). Posizionare teli chirurgici sterili intorno all'area chirurgica.
11. Fai un'incisione laterale di 2-3 cm nella pelle del torace per visualizzare i muscoli pettorali sul lato sinistro. Tagliare le pettorali maggiori e minori usando un'incisione di 1 cm dalla linea mediana verso l'esterno per visualizzare i muscoli intercostali tra la terza e la quarta costola.
    NOTA: Prestare attenzione per evitare un eccessivo sanguinamento dal muscolo pettorale attraverso la cauterizzazione dei vasi sanguinanti.
12. Fare un'incisione di 2 cm nel muscolo intercostale sinistro per introdurre aria (con movimento passivo dell'aria) nella cavità toracica per consentire al cuore e ai polmoni di allontanarsi dall'incisione chirurgica. Inoltre, espandere l'apertura con l'aiuto di un dispositivo di cauterizzazione (vedi Tabella dei materiali) per incidere l'intercostale e prevenire il sanguinamento
    NOTA: Il ventilatore deve essere temporaneamente interrotto durante il periodo di cauterizzazione per evitare reazioni esplosive con l'ossigeno. Si fa attenzione a non danneggiare il sacco pericardico.
13. Usando i divaricatori, ritrarre le costole per esporre il cuore.
14. Osservare il pericardio e il cuore sottostante sotto uno stereomicroscopio.
    NOTA: Il pericardio del topo è abbastanza sottile da visualizzare la vascolarizzazione del cuore.
15. Posizionare delicatamente una pinza sulla superficie del pericardio per ridurre il suo movimento e quello del cuore sottostante.
16. Evidenziare visivamente l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) tracciando la sua emersione da sotto l'appendice sinistra.
17. Utilizzando il micro-needle driver, guidare una sutura appropriata (vedi Tabella dei materiali) attraverso il pericardio, sotto il LAD, con la sutura che emerge dall'altro lato del LAD e del pericardio. Legare la sutura per limitare il flusso sanguigno attraverso l'arteria coronaria e tagliare la sutura in eccesso con l'aiuto delle forbici (Figura 1A).
    NOTA: Dopo aver limitato il flusso sanguigno all'arteria coronaria, dovrebbe essere visibile lo sbiancamento della porzione anteriore del ventricolo sinistro. Questa procedura rappresenta un modello di legatura permanente. Tuttavia, in questa fase potrebbe essere applicato anche un approccio di legatura transitoria con diversi periodi di ischemia.
18. Sotto il sito di incisione all'interno dell'area sterile, introdurre un catetere da 24 G per via percutanea nel torace (rimuovere l'ago guida dopo essere entrato nella cavità toracica). Quindi, chiudere le costole seguite dagli strati muscolari e dalla pelle usando una sutura appropriata (un ago conico per i muscoli, un ago da taglio convenzionale per la pelle).
19. Una volta chiuso il torace, evacuare l'aria rimanente dalla cavità toracica attraverso il catetere da 24 G mediante aspirazione delicata con una siringa da 3 ml e compressioni toraciche. Una volta rimossa l'aria, estrarre il catetere da 24 G.
20. Ridurre l'isoflurano all'1%.
21. Spegnere l'isoflurano mantenendo la ventilazione con ossigeno per consentire al topo di riprendersi dall'anestesia. Una volta che l'animale mostra segni di respirazione indipendente, rimuovere il tubo tracheale da 23 G dalla bocca e posizionare il topo in una gabbia di recupero da monitorare per la ripresa della normale respirazione.
22. Consentire al mouse di recuperare nella gabbia con una parte della gabbia posizionata su un pad riscaldante per fornire una fonte di calore esterna.
23. Fornire iniezioni di mantenimento di analgesico (Buprenorfina 0,1 mg/kg, per via sottocutanea) ogni 12 ore per 72 ore post-operatorie.
24. Monitorare lo stato di salute dei topi ogni giorno per 7 giorni, che include la valutazione delle incisioni e del disagio degli animali.
    NOTA: A causa dell'invasività di questa procedura (toracotomia), può essere necessaria la somministrazione di antibiotici.

2. Valutazione funzionale della funzione cardiaca mediante ecocardiografia (ECG)

1. Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con isoflurano all'1,5-2% e 800 ml/min di ossigeno.
2. Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma scenica riscaldata e attaccare le zampe agli elettrocateteri ECG.
3. Rasare il petto del mouse.
4. Acquisire immagini ecocardiografiche utilizzando una sonda trasduttore lineare a 40 MHz e gel di contatto e analizzarle con il software appropriato (vedi Tabella dei materiali).
5. Spegnere l'isoflurano e consentire al mouse di recuperare sulla piattaforma di riscaldamento prima di riportare la gabbia a uno stato attivo.
   NOTA: La valutazione dell'ecocardiografia non è invasiva e quindi può essere eseguita longitudinalmente durante l'esperimento per determinare i cambiamenti prima e dopo la legatura coronarica.

3. Raccolta del tessuto cardiaco per la colorazione della fibrosi

1. Sacrificare i topi con l'inalazione di CO 2 al 100_{% e} sezionare attentamente il cuore.
   NOTA: Usando forbici e pinze, questo si ottiene tagliando attraverso i grandi vasi che entrano (vena cava, vena polmonare) ed escono (arteria polmonare, aorta) il cuore per liberarlo dal sistema circolatorio nella cavità toracica.
2. Fissare il cuore in formalina al 10% per almeno 24 ore.
3. Tagliare i campioni usando una lama di rasoio dritta attraverso il ventricolo destro, il setto interventricolare e il ventricolo sinistro, assicurandosi che l'incisione attraversi il centro della zona dell'infarto. I campioni vengono quindi inviati alla struttura principale per l'incorporazione della paraffina.
4. Tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore con un microtomo e posizionarle su vetrini per la colorazione.
5. Deparaffinizzare utilizzando xilene commerciale e lavaggi con alcool graduato (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) con acqua deionizzata, quindi reidratare.
6. Colorare con 0,1% di rosso Sirio in acido picrico per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare le sezioni con acido acetico allo 0,5% per 3 minuti e risciacquare con etanolo al 70% per 1 min.
8. Disidratare le sezioni utilizzando l'ordine inverso dei lavaggi descritto al punto 3.4, con concentrazioni di etanolo crescenti e graduate, quindi xilene.
9. Montare sezioni di tessuto con una soluzione di montaggio (vedi Tabella dei materiali) per la valutazione microscopica.

4. Citometria a flusso del lavaggio del cuore e della cavità pericardica

1. Sacrificare i topi con l'inalazione di CO₂ al 100% per effetto.
2. Posizionare il mouse sul dorso e fissare le braccia e le gambe a una tavola chirurgica usando del nastro adesivo.
3. Aprire con attenzione il lato sinistro (lato destro dalla vista dello sperimentatore) della cavità toracica, iniziando con il taglio del diaframma fino a circa il punto medio e successivamente tagliando le costole esterne verso lo sterno.
   NOTA: Evitare di intaccare i grandi vasi sanguigni, in particolare quelli che corrono paralleli allo sterno.
4. Ritrarre le costole usando un emostatico per esporre il cuore e il pericardio sottostanti.
   NOTA: Il pericardio è molto fragile, quindi assicurati di non prenderlo con le forbici durante il taglio.
5. Utilizzando un catetere per tubi PE-10 (vedi Tabella dei materiali) inserito nello spazio pericardico vicino alla giunzione dell'atrio sinistro e del ventricolo sinistro, iniettare 100 μL di soluzione salina sterile nella cavità pericardica.
   1. Lasciare che la soluzione salina si accumuli e si raccolga dal lato posteriore del cuore, facendo attenzione a non perforare o strappare il pericardio nel processo. Ripeti questo passaggio due volte e posiziona il liquido di lavaggio sul ghiaccio durante l'elaborazione del cuore.
6. Accisa il cuore tagliando i vasi principali (aorta, arteria polmonare, vena e vena cava) che entrano ed escono dal cuore. Rimuovere gli atri destro e sinistro e pesare il tessuto cardiaco ventricolare.
7. Tritare il tessuto in piccoli pezzi da 1 mm² con le forbici e introdurre 10 mL di tampone digestivo contenente 450 U/mL di collagenasi I, 125 U/mL di collagenasi XI, 60 U/mL di DNasi I e 60 U/mL di ialuronidasi in PBS per 1 ora a 37 °C su uno shaker orbitale.
8. Far passare omogenati il tessuto cardiaco attraverso un filtro cellulare da 70 μm (vedere la tabella dei materiali) e ruotare verso il basso a 60 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere le cellule parenchimali cardiache.
9. Raccogliere il surnatante, passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm (vedere la tabella dei materiali) per una sospensione a cella singola e ruotare verso il basso a 400 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le celle.
10. Eseguire il blocco del recettore cristallizzabile (Fc) dei frammenti e la colorazione dei marcatori cellulari sulle cellule pericardiche e cardiache come descritto in precedenza⁸.
11. Eseguire campioni su un citometro a flusso.

5. Marcatura dei macrofagi pericardici utilizzando il metodo ICAPS (Intercostal Approach to the Pleural Space)⁹

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (tramite sterilizzatore a perline o autoclave) e spruzzare etanolo al 70% prima di iniziare.
2. Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con isoflurano all'1,5-2% e 800 ml/min di ossigeno. Confermare il piano anestetico pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.
3. Iniettare analgesici per via sottocutanea (Buprenorfina 0,1 mg/Kg).
4. Posizionare il mouse su un pad chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico.
5. Rasare l'area toracica anterolaterale destra.
6. Pulire l'area chirurgica con etanolo e betadine.
7. Fai un'incisione lunga 3 cm nella pelle e con una pinza espongi la gabbia toracica.
8. Caricare 5 μL di sfere fluorescenti (microsfere fluorescenti disponibili in commercio, 1 μm, vedere Tabella dei materiali) e 45 μL di soluzione salina in un catetere per siringa a tubo PE-10 con punta smussata.
9. Guidare il catetere nello spazio intercostale come descritto in precedenza⁹, iniettare lentamente la soluzione di perline e rimuovere il catetere con un solo movimento.
10. Chiudere la pelle usando graffette.
    NOTA: Le graffette vengono utilizzate al posto delle suture per ridurre al minimo la potenziale riapertura dell'incisione.
11. Spegnere l'isoflurano, posizionare il mouse nella gabbia di recupero e monitorare eventuali complicazioni nelle prime 24 ore.

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Risultati

Questo modello di legatura coronarica modificato è stato ottimizzato per ottenere la riproducibilità e la sopravvivenza degli animali. Tuttavia, a causa della significativa lesione indotta nel cuore, alcune attese mortalità intraoperatoria e post-operatoria sono associate alla procedura. La mortalità standard è tipicamente più alta nei maschi (~25-35%) rispetto alle femmine (~ 10-15%).

L'induzione riuscita di un infarto miocardico con la legatura coronarica modificata dovrebbe essere evi...

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Discussione

L'induzione di un infarto miocardico in un pericardio chiuso nei roditori è unica e può avere applicazioni potenzialmente significative. La procedura si basa fortemente sulla familiarità del chirurgo con il modello di roditore e l'anatomia cardiaca del roditore. Il successo dipende anche dalla cura prestata durante tre fasi critiche: incisione muscolare intercostale e retrazione delle costole (fasi 1.11-1.13), creazione dell'infarto (fase 1.17) e recupero degli animali (fasi 1.22-1.24).

La ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics