無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

要約

このプロトコルは、心膜とその内容物を保存しながらマウスに心筋梗塞を誘発するための手順を概説しています。

要約

このプロトコルは、心膜およびその内容物が虚血性げっ歯類モデル(心筋損傷を誘発するための冠状動脈結紮)において必須の抗線維化役割を果たすことを示している。前臨床心筋梗塞モデルの大部分は、恒常性細胞環境の喪失を伴う心膜完全性の破壊を必要とする。しかし、最近、心筋梗塞を誘発する方法論が開発され、心膜の損傷を最小限に抑え、心臓に常在する免疫細胞集団を保持しています。冠状動脈結紮後の無傷の心膜腔を有するマウスにおける改善された心機能回復が観察されている。この方法は、心筋梗塞後の心膜腔における炎症反応を研究する機会を提供する。標識技術のさらなる開発をこのモデルと組み合わせることで、線維症を含む心臓のリモデリングを促進する炎症メカニズムの調節における心膜免疫細胞の運命と機能を理解することができます。

概要

今日まで、心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因として認識されており、その結果、重大な経済的負担と患者の生活の質の低下が生じています¹。冠動脈疾患(CAD)はCVDのサブタイプであり、死亡率の主な原因である心筋梗塞(MI)の発症に不可欠な役割を果たしています。定義上、MIは、虚血および低酸素症の長期状態による心筋組織への不可逆的な損傷から生じる。心筋組織は再生能力を欠いているため、損傷は永続的であり、心筋を線維性瘢痕に置き換え、最初は保護することができますが、最終的には有害な心臓リモデリングと最終的には心不全の一因となります²。

CAD患者の管理は過去数十年で劇的に改善されましたが、虚血に続発する慢性心不全(CHF)は世界中の多くの患者に影響を及ぼしています。この流行を予防および管理するためには、根底にあるメカニズムをより広範囲に理解し、新しい治療アプローチを開発する必要があります。さらに、過去の知見は、全身療法の限界と正確な代替案を開発する必要性を浮き彫りにしている。ヒトにおけるMIの分子後遺症が梗塞組織へのアクセス能力によって影響を受けることを調査するためには、CVDに関連するヒトMIおよびCHFの特徴と発達を再現する動物モデルが不可欠です。

理想的な動物モデルは、構造的および機能的特徴において人間の障害によく似ているため、病気の病因はそれらの概念を導くはずです。CADでは、冠状動脈の慢性アテローム性動脈硬化症狭窄または急性血栓性閉塞症です。冠状動脈の狭窄または閉塞を誘発するために、様々な種の実験動物において異なる方法が開発および適用されてきた。このような戦略は、(1)MIを誘発するための冠状動脈の機械的操作、および(2)MIにつながる冠状動脈狭窄を促進するためのアテローム性動脈硬化症の促進の2つのグループに大別することができる。最初の戦略は通常、冠状動脈の結紮または動脈内のステントの留置のいずれかを含みます。2番目のアプローチは、高脂肪/コレステロール食品を含むように動物の食事を変更することに依存する傾向があります。この後者のアプローチの限界のいくつかには、冠状動脈閉塞のタイミングおよび部位に対する制御の欠如が含まれる。

対照的に、動物モデルにおけるMIまたは虚血の外科的誘導には、冠状動脈イベントの位置、正確なタイミング、および程度などのいくつかの利点があり、より再現性の高い結果につながります。最も広く使用されている方法は、左前下行冠状動脈(LAD)の外科的結紮です。このようなモデルは、急性虚血性損傷に対するヒトの反応、ならびにCHF³への進行を再現する。当初は大型動物で開発されましたが、げっ歯類などの小動物に対するLAD手術は、技術の進歩により実現可能になりました⁴。このようなモデルを確立する際に、マウスは、その相対的な可用性、住居での低コスト、遺伝子操作の能力など、さまざまな理由で支持されてきました。

LAD閉塞を用いた虚血性心疾患の現代の外科モデルでは、研究者が心膜を開いて動脈を一時的または恒久的に結紮する必要があります⁵。そのような戦略は、適切な心機能を確保するために本質的に機械的および潤滑機能を担う心膜腔の破壊をもたらす。心膜を開くことの別の欠点は、その様々な細胞およびタンパク質成分を有する動物の本来の心膜液を失うことである^6,7。そこで、心膜を無傷に保ちながらMIを誘導する方法を開発した。この恒常性環境の摂動を最小限に抑えることに加えて、このアプローチは、MIを引き起こした後に特定の細胞にタグを付けて追跡することを可能にする。さらに、このアプローチは、人間の設定における心筋虚血性損傷をよりよく表します。

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プロトコル

これらの実験には、8〜14週齢の雄および雌のC57BL / 6Jマウスを使用しました。このプロトコルは、カルガリー大学の動物管理委員会から倫理的承認を受けており、すべての動物飼育ガイドラインに従っています。

1.マウスの準備と手術

1. 手術器具を滅菌します(ビーズ滅菌器またはオートクレーブを介して)。
2. 手術前の体重と鎮痛用量についてマウスの体重を測定します。
3. マウスを4%イソフルランと800 mL /分の酸素を含む誘導ボックスに入れます。つま先をつまんで反射の欠如について動物を観察することによって麻酔面を確認します。
4. 鎮痛剤を皮下注射します(0.1 mg / kgのブプレノルフィン)( 材料の表を参照)。.
5. 手術中にマウスを加熱された手術パッドに置き、ノーズコーンを介して送達される3%イソフルランで麻酔を維持します。眼科用軟膏を塗って、各目にドライアイを避けます。
6. 胸と首の手術部位から髪を剃ります。
7. マウスの足を拘束し、手術台に置きます。
8. 滑らかな先端の23Gカテーテルを口と咽頭から気管に挿入してマウスに挿管します。
   1. 挿管後、110呼吸/分の速度、250μLの一回換気量、および呼気終末陽圧(PEEP)4mmHgに設定された市販の人工呼吸器( 材料表を参照)を使用して、キャリアガスとして2%イソフルランと100%酸素でマウスを換気します。
9. マウスを右側で30%回転させて、胸部の左側を手術用に配置します。
10. 70%エタノールとベタジンを円を描くように3回交互にスクラブして手術領域を洗浄します(材料の表を参照)。手術領域の周りに滅菌手術用ドレープを配置します。
11. 胸部の皮膚を2〜3 cm横切開して、左側の胸筋を視覚化します。正中線から外側に1cmの切開を使用して大胸筋と小胸筋を切断し、第3肋骨と第4肋骨の間の肋間筋を視覚化します。
    注:出血している血管の焼灼による胸筋からの過剰な出血を避けるように注意する必要があります。
12. 左肋間筋を2cm切開して胸腔に空気を(受動的な空気の動きによって)導入し、心臓と肺が外科的切開から離れるようにします。さらに、肋間を切開し、出血を防ぐために焼灼装置( 材料の表を参照)の助けを借りて開口部を広げます
    注意: 酸素との爆発的な反応を避けるために、焼灼期間中は人工呼吸器を一時的に停止する必要があります。心嚢を傷つけないように注意します。
13. 開創器を使用して、肋骨を引っ込めて心臓を露出させます。
14. 心膜とその下にある心臓を実体顕微鏡で観察します。
    注:マウスの心膜は、心臓の血管系を視覚化するのに十分なほど薄いです。
15. 心膜の表面に鉗子をそっと置き、心膜とその下にある心臓の動きを減らします。
16. 左前下行(LAD)冠状動脈を、左付属肢の下からの出現を追跡することにより、視覚的にランドマークを付けます。
17. マイクロニードルドライバーを使用して、適切な縫合糸( 材料の表を参照)を心膜を通して、LADの下の、LADと心膜の反対側に縫合糸を出現させます。縫合糸を結び、冠状動脈を通る血流を制限し、ハサミの助けを借りて余分な縫合糸をトリミングします(図1A)。
    注:冠状動脈への血流を制限すると、左心室の前部の白化が見えるはずです。この手順は、永久結紮モデルを表します。ただし、虚血期間の異なる一過性結紮アプローチもこの段階で適用できます。
18. 無菌領域内の切開部位の下に、24Gカテーテルを経皮的に胸部に導入します(胸腔に入った後にガイド針を取り外します)。次に、適切な縫合糸(筋肉用のテーパー針、皮膚用の従来の切断針)を使用して、肋骨を閉じてから筋肉層と皮膚を閉じます。
19. 胸部が閉じたら、3mLシリンジと胸骨圧迫による穏やかな吸引を使用して、24Gカテーテルを介して胸腔から残りの空気を排出します。空気が除去されたら、24Gカテーテルを引き出します。
20. イソフルランを1%に減らす。
21. マウスが麻酔から回復できるように、酸素で換気を維持しながらイソフルランをオフにします。動物が独立して呼吸の兆候を示したら、23 Gの気管チューブを口から取り外し、マウスを回復ケージに入れて、通常の呼吸の再開を監視します。
22. ケージの一部を加温パッドに置き、マウスをケージ内で回復させて、外部熱源を提供します。
23. 鎮痛剤(ブプレノルフィン0.1 mg / kg、皮下)の維持注射を術後72時間、12時間ごとに行います。.
24. マウスの健康状態を7日間毎日監視し、これには切開と動物の不快感の評価が含まれます。
    注:この手順(開胸術)の侵襲性のために、抗生物質の投与が必要な場合があります。

2. 心エコー検査(ECG)による心機能の評価

1. 1.5〜2%のイソフルランと800 mL /分の酸素で全身麻酔下でマウスを誘導および維持します。.
2. 加熱されたステージプラットフォーム上でマウスを仰臥位に置き、足をECGリードに取り付けます。
3. マウスの胸を剃ります。
4. 40 MHzリニアトランスデューサプローブとコンタクトゲルを使用して心エコー検査画像を取得し、適切なソフトウェアで分析します(材料表を参照)。
5. イソフルランをオフにし、ケージを活性状態に戻す前に、マウスが加熱プラットフォームで回復するのを待ちます。
   注:心エコー検査の評価は非侵襲的であるため、実験全体を通して縦断的に実行して、冠状動脈結紮前後の変化を決定できます。

3.線維症染色のための心臓組織採取

1. 100%CO₂ を吸入してマウスを屠殺し、心臓を注意深く解剖する。
   注:これは、はさみと鉗子を使用して、心臓に出入りする大きな血管(大静脈、肺静脈)を切断して、胸腔内の循環器系から心臓を解放することによって達成されます。
2. 心臓を10%ホルマリンで少なくとも24時間固定します。
3. 右心室、心室中隔、左心室をまっすぐなかみそりの刃でサンプルを切断し、切開が梗塞ゾーンの中心を通過するようにします。その後、サンプルはパラフィン包埋のためにコア施設に送られます。
4. 厚さ5μmの組織切片をミクロトームで切断し、スライドガラスの上に置いて染色します。
5. 市販のキシレンと段階的なアルコール洗浄(2x 99%、1x 95%、1x 70%)を脱イオン水で脱パラフィンし、再水和します。
6. ピクリン酸中の0.1%シリウスレッドで室温で2時間染色します。
7. 切片を0.5%酢酸で3分間洗浄し、70%エタノールで1分間すすぎます。
8. 3.4で概説されている洗浄の逆の順序を使用して切片を脱水し、エタノール濃度を上げて段階付けし、次にキシレンを加熱します。
9. 顕微鏡評価のために、組織切片を取り付けソリューション( 材料表を参照)で取り付けます。

4.心臓および心膜腔洗浄のフローサイトメトリー

1. 効果を得るために100%_CO2 の吸入でマウスを屠殺する。
2. マウスを背中に置き、テープを使用して腕と脚を外科用ボードに固定します。
3. 胸腔の左側(実験者の視点から右側)を慎重に開き、横隔膜をほぼ中間点まで切断し、続いて外側の肋骨を胸骨に向かって切断します。
   注意: 大きな血管、特に胸骨と平行に走る血管に傷を付けないでください。
4. 止血剤を使用して肋骨を引っ込め、下にある心臓と心膜を露出させます。
   注:心膜は非常に壊れやすいので、切断中にハサミで捕まえないように注意してください。
5. 左心房と左心室の接合部近くの心膜腔に挿入したPE-10チューブ( 材料の表を参照)カテーテルを使用して、100μLの滅菌生理食塩水を心膜腔に注入します。
   1. 生理食塩水を溜めて心臓の後側から集め、その過程で心膜に穴を開けたり裂いたりしないように注意してください。この手順を2回繰り返し、心臓を処理しながら洗浄液を氷上に置きます。
6. 心臓に出入りする主要な血管(大動脈、肺動脈、静脈、大静脈)を切断して心臓を切除します。左右の心房を取り除き、心室心臓組織の重さを量ります。
7. はさみを使用して組織を1 mm² 小片に細切りにし、450 U / mLのコラゲナーゼI、125 U / mLのコラゲナーゼXI、60 U / mLのDNase I、および60 U / mLのヒアルロニダーゼを含む10 mLの消化バッファーにPBSで、オービタルシェーカーで37°Cで1時間置きます。
8. 心臓組織ホモジネートを70 μmのセルストレーナー( 材料の表を参照)に通し、60 x g で4°Cで5分間スピンダウンして、心臓実質細胞を除去します。
9. 上清を回収し、単一細胞懸濁液用の40 μmセルストレーナー( 材料の表を参照)を通過させ、400 x g で4°Cで5分間スピンダウンして細胞をペレット化します。
10. 前述のように、心膜細胞および心臓細胞上の断片結晶化可能(Fc)受容体遮断および細胞マーカーの染色を行う⁸。
11. フローサイトメーターでサンプルを実行します。

5.胸膜腔への肋間アプローチ(ICAPS)法を使用した心膜マクロファージの標識⁹

1. 開始する前に、手術器具を(ビーズ滅菌器またはオートクレーブを介して)滅菌し、70%エタノールをスプレーします。
2. 1.5〜2%のイソフルランと800 mL /分の酸素で全身麻酔下でマウスを誘導および維持します。.つま先をつまんで反射の欠如について動物を観察することによって麻酔面を確認します。
3. 鎮痛剤を皮下注射します(ブプレノルフィン0.1 mg / Kg)。
4. 手術中に加熱された手術パッドにマウスを置きます。
5. 右前外側胸部を剃ります。
6. エタノールとベタジンで手術部位を洗浄します。
7. 皮膚を3 cmの長さで切開し、鉗子で胸郭を露出させます。
8. 5 μLの蛍光ビーズ(市販の蛍光微小球、1 μm、 材料表を参照)と45 μLの生理食塩水を、先端が斜めのPE-10チューブシリンジカテーテルに入れます。
9. 前述のようにカテーテルを肋間腔に誘導し9、ビーズ溶液をゆっくりと注入^し、カテーテルを一気に取り外す。
10. ステープルを使用して皮膚を閉じます。
    注:ステープルは、切開の潜在的な再開放を最小限に抑えるために、縫合糸の代わりに使用されます。
11. イソフルランの電源を切り、マウスを回復ケージに入れ、最初の24時間にわたって合併症がないか監視します。

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結果

この修正冠状動脈結紮モデルは、再現性と動物の生存を達成するために最適化されています。しかし、心臓に誘発された重大な損傷のために、いくつかの予想される術中および術後の死亡率が手順に関連しています。標準的な死亡率は、典型的には、女性(~10-15%)よりも男性(~25-35%)で高い。

修飾冠状動脈結紮を伴うMIの誘導の成功は、心臓の機能パラメータと構造的特徴の...

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ディスカッション

げっ歯類の閉じた心膜にMIを誘導することは独特であり、潜在的に重要な用途を持つ可能性があります。この手順は、げっ歯類モデルとげっ歯類の心臓解剖学に関する外科医の精通度に大きく依存しています。成功は、肋間筋切開と肋骨の収縮(ステップ1.11-1.13)、梗塞の作成(ステップ1.17)、動物の回復(ステップ1.22-1.24)の3つの重要なステップで与えられるケアにも依存します。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics