Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen unter Beibehaltung des Perikards und seines Inhalts.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll hat gezeigt, dass das Perikard und sein Inhalt eine wesentliche antifibrotische Rolle im ischämischen Nagetiermodell spielen (koronare Ligatur zur Induktion von Myokardverletzungen). Die Mehrzahl der präklinischen Myokardinfarktmodelle erfordert die Störung der Perikardintegrität mit Verlust des homöostatischen zellulären Milieus. In jüngster Zeit wurde jedoch von uns eine Methode entwickelt, um einen Myokardinfarkt zu induzieren, der den Perikardschaden minimiert und die im Herzen ansässige Immunzellpopulation erhält. Bei Mäusen mit intaktem Perikardraum nach koronarer Ligatur wurde eine verbesserte kardiale Funktionserholung beobachtet. Diese Methode bietet die Möglichkeit, Entzündungsreaktionen im Perikardraum nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Weiterentwicklung der Markierungstechniken kann mit diesem Modell kombiniert werden, um das Schicksal und die Funktion von perikardialen Immunzellen bei der Regulierung der Entzündungsmechanismen zu verstehen, die den Umbau im Herzen, einschließlich der Fibrose, vorantreiben.

Einleitung

Bis heute gelten Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit als die häufigste Todesursache, was zu einer erheblichen finanziellen Belastung und einer Verringerung^{der Lebensqualität der} Patienten führt1. Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist ein Subtyp der Herz-Kreislauf-Erkrankung und spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Myokardinfarkts (MI), der einen Hauptfaktor für die Mortalität darstellt. Definitionsgemäß resultiert MI aus einer irreversiblen Verletzung des Myokardgewebes aufgrund längerer Ischämie und Hypoxie. Dem Myokardgewebe fehlt die Regenerationsfähigkeit, so dass Verletzungen dauerhaft sind und zum Ersatz des Herzmuskels durch eine fibrotische Narbe führen, die zunächst schützend sein kann, aber letztendlich zu einem ungünstigen Herzumbau und schließlich zu einer Herzinsuffizienz beiträgt².

Obwohl sich die Behandlung von Patienten mit KHK in den letzten Jahrzehnten dramatisch verbessert hat, sind viele Patienten weltweit von chronischer Herzinsuffizienz (CHF) infolge von Ischämie betroffen. Um dieser Epidemie vorzubeugen und sie zu bewältigen, ist es notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Darüber hinaus zeigen die bisherigen Befunde die Grenzen der systemischen Therapie und die Notwendigkeit, präzise Alternativen zu entwickeln. Angesichts der Tatsache, dass die Untersuchung der molekularen Folgen von MI beim Menschen von der Fähigkeit beeinflusst wird, Zugang zu infarktiertem Gewebe zu erhalten, sind Tiermodelle, die die Eigenschaften und die Entwicklung von humanem MI und CHF im Zusammenhang mit CVD rekapitulieren, unerlässlich.

Da ideale Tiermodelle in Bezug auf strukturelle und funktionelle Merkmale einer menschlichen Störung sehr ähnlich sind, sollte die Ätiologie der Krankheit ihre Konzeption leiten. Bei der KHK handelt es sich um die chronische atherosklerotische Stenose der Koronararterien oder einen akuten thrombotischen Verschluss. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und bei verschiedenen Arten von Labortieren angewendet, um eine Verengung oder Okklusion der Koronararterien zu induzieren. Solche Strategien können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden: (1) mechanische Manipulation einer Koronararterie, um einen MI zu induzieren, und (2) Beschleunigung der Atherosklerose, um die Koronarverengung zu erleichtern, die zu einem MI führt. Die erste Strategie beinhaltet in der Regel entweder die Ligatur einer Koronararterie oder die Platzierung eines Stents innerhalb der Arterie. Der zweite Ansatz neigt dazu, die Ernährung des Tieres zu ändern, um fettreiche / cholesterinreiche Nahrung aufzunehmen. Zu den Einschränkungen dieses letzteren Ansatzes gehört die mangelnde Kontrolle über den Zeitpunkt und den Ort der Koronarverschlüsse.

Im Gegensatz dazu hat die chirurgische Induktion von MI oder Ischämie in einem Tiermodell mehrere Vorteile, wie z. B. Ort, präzises Timing und Ausmaß des koronaren Ereignisses, was zu reproduzierbaren Ergebnissen führt. Die am weitesten verbreitete Methode ist die chirurgische Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD). Solche Modelle rekapitulieren die menschlichen Reaktionen auf akute ischämische Verletzungen sowie die Progression auf^{CHF 3}. Ursprünglich bei größeren Tieren entwickelt, ist die LAD-Chirurgie an Kleintieren wie Nagetieren mit Fortschritten in der Technologie praktikabler geworden⁴. Bei der Etablierung solcher Modelle wurden Mäuse aus verschiedenen Gründen bevorzugt, darunter ihre relative Verfügbarkeit, geringe Kosten für die Unterbringung und ihre Fähigkeit zur genetischen Manipulation.

Zeitgenössische chirurgische Modelle der ischämischen Herzkrankheit mit LAD-Verschluss erfordern, dass der Forscher das Perikard öffnet, um die Arterie⁵ vorübergehend oder dauerhaft zu ligieren. Solche Strategien führen zu einer Störung des Perikardraums, der im Wesentlichen eine mechanische und schmierende Funktion hat, um eine ordnungsgemäße Herzfunktion zu gewährleisten. Ein weiterer Nachteil der Öffnung des Herzbeutels ist der Verlust der nativen Herzbeutelflüssigkeit des Tieres mit seinen verschiedenen Zell- und Proteinbestandteilen ^6,7. Als Reaktion darauf wurde von uns eine Methode entwickelt, um MI zu induzieren und gleichzeitig das Perikard intakt zu halten. Neben der Minimierung der Störung dieser homöostatischen Umgebung ermöglicht dieser Ansatz das Markieren und Verfolgen bestimmter Zellen nach dem Verursachen eines MI. Darüber hinaus stellt dieser Ansatz die myokardiale ischämische Schädigung im menschlichen Umfeld besser dar.

Protokoll

Für diese Experimente wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 14 Wochen verwendet. Dieses Protokoll wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary ethisch genehmigt und entspricht allen Tierpflegerichtlinien.

1. Vorbereitung und Operation der Maus

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über Perlensterilisator oder Autoklav).
2. Wiegen Sie die Maus für das präoperative Gewicht und die analgetische Dosis.
3. Legen Sie die Maus in eine Induktionsbox mit 4% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.
4. Injizieren Sie das Analgetikum subkutan (0,1 mg/kg Buprenorphin) (siehe Materialtabelle).
5. Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad und halten Sie die Anästhesie mit 3% Isofluran aufrecht, das über den Nasenkonus verabreicht wird. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um trockene Augen für jedes Auge zu vermeiden.
6. Rasieren Sie die Haare aus den Brust- und Nackenbereichen.
7. Halten Sie die Pfoten der Maus fest und positionieren Sie sie auf dem OP-Tisch.
8. Intubieren Sie die Maus, indem Sie einen 23-G-Katheter mit glatter Spitze durch den Mund und den Rachen in die Luftröhre einführen.
   1. Belüften Sie die Maus nach der Intubation mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff als Trägergas mit einem handelsüblichen Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) mit einer Geschwindigkeit von 110 Atemzügen/min, einem Atemzugvolumen von 250 μl und einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 4 mmHg.
9. Rollen Sie die Maus 30% auf der rechten Seite, um die linke Seite der Brust für die Operation zu positionieren.
10. Reinigen Sie den Operationsbereich mit 3 abwechselnden Peelings aus 70% Ethanol und Betadin in kreisförmigen Bewegungen (sieheMaterialtabelle). Legen Sie sterile OP-Abdecktücher um den Operationsbereich herum.
11. Machen Sie einen 2-3 cm langen seitlichen Schnitt in die Haut der Brust, um die Brustmuskeln auf der linken Seite sichtbar zu machen. Schneiden Sie den Pectoralis major und minor mit einem 1 cm langen Schnitt von der Mittellinie nach außen, um die Interkostalmuskulatur zwischen der dritten und vierten Rippe sichtbar zu machen.
    HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass übermäßige Blutungen aus dem Musculus pectoralis durch Kauterisation blutender Gefäße vermieden werden.
12. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in den linken Interkostalmuskel, um Luft (durch passive Luftbewegung) in die Brusthöhle einzuführen, damit Herz und Lunge vom chirurgischen Schnitt abfallen können. Erweitern Sie die Öffnung mit Hilfe eines Kauterisationsgeräts (siehe Materialtabelle), um die Interkostale zu schneiden und Blutungen zu verhindern
    HINWEIS: Das Beatmungsgerät sollte während der Kauterisation vorübergehend gestoppt werden, um explosive Reaktionen mit Sauerstoff zu vermeiden. Es wird darauf geachtet, den Perikardsack nicht zu beschädigen.
13. Ziehen Sie die Rippen mit Retraktoren zurück, um das Herz freizulegen.
14. Beobachten Sie den Perikard und das darunter liegende Herz unter einem Stereomikroskop.
    HINWEIS: Das Perikard der Maus ist dünn genug, um das Gefäßsystem des Herzens sichtbar zu machen.
15. Legen Sie eine Pinzette vorsichtig auf die Oberfläche des Perikards, um seine Bewegung und die des darunter liegenden Herzens zu reduzieren.
16. Visuelle Markierung der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD), indem sie ihren Austritt unter dem linken Anhängsel verfolgt.
17. Führen Sie mit dem Mikronadeltreiber eine geeignete Naht (siehe Materialtabelle) durch das Perikard unter dem LAD, wobei die Naht auf der anderen Seite des LAD und des Perikards hervortritt. Binden Sie die Naht zusammen, um den Blutfluss durch die Koronararterie einzuschränken, und schneiden Sie die überschüssige Naht mit Hilfe einer Schere ab (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Bei Einschränkung des Blutflusses zur Koronararterie sollte eine Blanchierung des vorderen Teils des linken Ventrikels sichtbar sein. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein permanentes Ligaturmodell. In diesem Stadium könnte jedoch auch ein transienter Ligationsansatz mit unterschiedlichen Ischämieperioden angewendet werden.
18. Führen Sie unterhalb der Inzisionsstelle im sterilen Bereich einen 24-G-Katheter perkutan in den Brustkorb ein (entfernen Sie die Führungsnadel nach dem Eintritt in die Brusthöhle). Schließen Sie dann die Rippen, gefolgt von den Muskelschichten und der Haut mit einer geeigneten Naht (eine konische Nadel für den Muskel, eine herkömmliche Schneidnadel für die Haut).
19. Sobald der Brustkorb geschlossen ist, entleeren Sie die verbleibende Luft aus der Brusthöhle über den 24-G-Katheter mit einer sanften Absaugung mit einer 3-ml-Spritze und Thoraxkompressionen. Sobald die Luft entfernt ist, ziehen Sie den 24-G-Katheter zurück.
20. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1%.
21. Schalten Sie das Isofluran aus, während Sie die Beatmung mit Sauerstoff aufrechterhalten, damit sich die Maus von der Anästhesie erholen kann. Sobald das Tier Anzeichen einer selbstständigen Atmung zeigt, entfernen Sie den 23 G Trachealschlauch aus dem Maul und legen Sie die Maus in einen Aufwachkäfig, um die Wiederaufnahme der normalen Atmung zu überwachen.
22. Warten Sie, bis sich die Maus im Käfig erholt hat, wobei ein Teil des Käfigs auf ein Wärmekissen gelegt wird, um eine externe Wärmequelle bereitzustellen.
23. Erhaltungsinjektionen des Analgetikums (Buprenorphin 0,1 mg/kg, subkutan) alle 12 h für 72 h nach der Operation verabreichen.
24. Überwachen Sie den Gesundheitszustand von Mäusen täglich für 7 Tage, einschließlich der Bewertung von Einschnitten und Beschwerden der Tiere.
    HINWEIS: Aufgrund der Invasivität dieses Verfahrens (Thorakotomie) kann die Verabreichung von Antibiotika erforderlich sein.

2. Funktionelle Beurteilung der Herzfunktion mittels Echokardiographie (EKG)

1. Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff.
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine beheizte Bühnenplattform und befestigen Sie die Pfoten an den EKG-Elektroden.
3. Rasieren Sie die Brust der Maus.
4. Nehmen Sie Echokardiographie-Bilder mit einer 40-MHz-Linearwandlersonde und Kontaktgel auf und analysieren Sie sie mit der entsprechenden Software (siehe Materialtabelle).
5. Schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie die Maus auf der Heizplattform regenerieren, bevor Sie den Käfig wieder in einen aktiven Zustand versetzen.
   HINWEIS: Die Echokardiographie-Beurteilung ist nicht-invasiv und kann daher während des gesamten Experiments longitudinal durchgeführt werden, um Veränderungen vor und nach der Koronarligatur zu bestimmen.

3. Entnahme von Herzgewebe zur Fibrose-Färbung

1. Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100% CO₂ und sezieren Sie das Herz vorsichtig.
   HINWEIS: Mit Schere und Pinzette wird dies erreicht, indem die großen Gefäße durchtrennt werden, die in das Herz eintreten (Vena cava, Lungenvene) und es verlassen (Lungenarterie, Aorta), um es aus dem Kreislaufsystem in der Brusthöhle zu lösen.
2. Fixieren Sie das Herz in 10% Formalin für mindestens 24 Stunden.
3. Schneiden Sie Proben mit einer geraden Rasierklinge durch den rechten Ventrikel, das interventrikuläre Septum und den linken Ventrikel, um sicherzustellen, dass der Schnitt durch das Zentrum der Infarktzone ging. Die Proben werden dann zur Einbettung von Paraffin an die Core Facility geschickt.
4. Schneiden Sie Gewebeschnitte von 5 μm Dicke mit einem Mikrotom aus und legen Sie sie zum Färben auf Glasobjektträger.
5. Entparaffinieren Sie mit handelsüblichem Xylol und abgestuftem Alkohol (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) mit deionisiertem Wasser, dann rehydrieren.
6. Mit 0,1% Siriusrot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur färben.
7. Abschnitte mit 0,5% Essigsäure für 3 min waschen und mit 70% Ethanol für 1 min spülen.
8. Die Abschnitte werden in umgekehrter Reihenfolge der Wäschen wie in 3.4 beschrieben mit steigender und abgestufter Ethanolkonzentration und dann mit Xylol dehydriert.
9. Montieren Sie Gewebeschnitte mit einer Befestigungslösung (siehe Materialtabelle) zur mikroskopischen Auswertung.

4. Durchflusszytometrie der Herz- und Perikardhöhlenspülung

1. Opfern Sie die Mäuse mit Inhalation von 100%_CO2 zur Wirkung.
2. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Arme und Beine mit Klebeband an einem OP-Brett.
3. Öffnen Sie vorsichtig die linke Seite (rechte Seite aus der Sicht des Experimentators) der Brusthöhle, beginnen Sie mit dem Schneiden des Zwerchfells bis etwa zum Mittelpunkt und schneiden Sie anschließend durch die äußeren Rippen in Richtung Brustbein.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, große Blutgefäße einzuklemmen, insbesondere solche, die parallel zum Brustbein verlaufen.
4. Ziehen Sie die Rippen mit einem Hämostat zurück, um das darunter liegende Herz und Perikard freizulegen.
   HINWEIS: Der Herzbeutel ist sehr zerbrechlich, achten Sie also darauf, ihn während des Schneidens nicht mit einer Schere zu fangen.
5. Injizieren Sie 100 μl sterile Kochsalzlösung mit einem PE-10-Schlauch (siehe Materialtabelle), der in den Perikardraum in der Nähe der Verbindung von linkem Vorhof und linkem Ventrikel eingeführt wird.
   1. Lassen Sie Kochsalzlösung von der hinteren Seite des Herzens sammeln und sammeln, wobei Sie darauf achten, den Perikard dabei nicht zu durchstechen oder zu zerreißen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und geben Sie Lavageflüssigkeit auf Eis, während Sie das Herz bearbeiten.
6. Schneiden Sie das Herz aus, indem Sie die Hauptgefäße (Aorta, Lungenarterie, Vene und Vena cava) schneiden, die in das Herz ein- und austreten. Entfernen Sie den rechten und linken Vorhof und wiegen Sie das ventrikuläre Herzgewebe.
7. Zerkleinern Sie das Gewebe in kleinen 1 mm² Stücken mit einer Schere und geben Sie 10 ml Verdauungspuffer mit 450 E / ml Kollagenase I, 125 E / ml Kollagenase XI, 60 E / ml DNase I und 60 E / ml Hyaluronidase in PBS für 1 h bei 37 ° C auf einen Orbitalschüttler.
8. Herzgewebe homogenisiert durch ein 70 μm großes Zellsieb (siehe Materialtabelle) und schleudert bei 60 x g für 5 min bei 4 °C, um Herzparenchymzellen zu entfernen.
9. Der Überstand wird gesammelt, durch ein 40-μm-Zellsieb (siehe Materialtabelle) für eine Einzelzellsuspension geleitet und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C nach unten geschleudert, um die Zellen zu pelletieren.
10. Fragmentkristallisierbare (Fc) Rezeptorblockierung und Färbung von zellulären Markern auf Perikard- und Herzzellen, wie zuvor beschrieben⁸.
11. Lassen Sie Proben auf einem Durchflusszytometer laufen.

5. Markierung von Perikardmakrophagen mit der Methode des Interkostalansatzes für den Pleuraraum (ICAPS)⁹

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (über einen Perlensterilisator oder Autoklaven) und sprühen Sie 70% Ethanol ein, bevor Sie beginnen.
2. Induzieren und halten Sie die Maus unter Vollnarkose mit 1,5-2% Isofluran und 800 ml/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesieebene, indem Sie die Zehen einklemmen und das Tier auf Mangel an Reflex beobachten.
3. Analgetikum subkutan injizieren (Buprenorphin 0,1 mg/kg).
4. Legen Sie die Maus während der Operation auf ein beheiztes OP-Pad.
5. Rasieren Sie den rechten anterolateralen Brustbereich.
6. Reinigen Sie den Operationsbereich mit Ethanol und Betadin.
7. Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette frei.
8. Laden Sie 5 μL fluoreszierende Kügelchen (handelsübliche fluoreszierende Mikrokugeln, 1 μm, siehe Materialtabelle) und 45 μL Kochsalzlösung in einen PE-10-Schlauchspritzenkatheter mit abgeschrägter Spitze.
9. Führen Sie den Katheter wie zuvor beschrieben⁹ in den Interkostalraum, injizieren Sie langsam die Perlenlösung und entfernen Sie den Katheter in einer Bewegung.
10. Verschließen Sie die Haut mit Klammern.
    HINWEIS: Klammern werden anstelle von Nähten verwendet, um ein mögliches Wiederöffnen des Einschnitts zu minimieren.
11. Schalten Sie das Isofluran aus, legen Sie die Maus in den Aufwachkäfig und überwachen Sie die ersten 24 Stunden auf Komplikationen.

Ergebnisse

Dieses modifizierte Koronarligaturmodell wurde optimiert, um Reproduzierbarkeit und Überleben der Tiere zu erreichen. Aufgrund der erheblichen Verletzung, die im Herzen induziert wird, sind jedoch einige erwartete intraoperative und postoperative Mortalitäten mit dem Eingriff verbunden. Die Standardsterblichkeit ist typischerweise bei Männern höher (~ 25-35%) als bei Frauen (~ 10-15%).

Die erfolgreiche Induktion eines MI mit der modifizierten koronaren Ligatur sollte durch Veränderungen d...

Diskussion

Die Induktion eines MI in einem geschlossenen Perikard bei Nagetieren ist einzigartig und kann potenziell bedeutende Anwendungen haben. Das Verfahren hängt stark von der Vertrautheit des Chirurgen mit dem Nagetiermodell und der Herzanatomie der Nagetiere ab. Der Erfolg hängt auch von der Pflege ab, die in drei kritischen Schritten angewendet wird: Interkostalmuskelschnitt und Rippenretraktion (Schritte 1.11-1.13), Entstehung des Infarkts (Schritt 1.17) und Genesung des Tieres (Schritte 1.22-1.24).

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics