Bozulmamış Bir Perikard İskemik Kemirgen Modeli

Özet

Bu protokol, perikard ve içeriğini korurken farelerde miyokard enfarktüsünü indükleme adımlarını özetlemektedir.

Özet

Bu protokol, perikardın ve içeriğinin iskemik kemirgen modelinde (miyokard hasarını indüklemek için koroner ligasyon) önemli bir anti-fibrotik rol oynadığını göstermiştir. Klinik öncesi miyokard enfarktüsü modellerinin çoğu, homeostatik hücresel ortamın kaybıyla perikardiyal bütünlüğün bozulmasını gerektirir. Bununla birlikte, son zamanlarda, perikardiyal hasarı en aza indiren ve kalbin yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonunu koruyan miyokard enfarktüsünü indüklemek için tarafımızdan bir metodoloji geliştirilmiştir. Koroner ligasyonu takiben sağlam bir perikardiyal boşluğa sahip farelerde iyileşmiş bir kardiyak fonksiyonel iyileşme gözlenmiştir. Bu yöntem, miyokard enfarktüsünü takiben perikardiyal boşluktaki enflamatuar yanıtları incelemek için bir fırsat sağlar. Etiketleme tekniklerinin daha da geliştirilmesi, fibroz da dahil olmak üzere kalpte yeniden şekillenmeyi sağlayan enflamatuar mekanizmaların düzenlenmesinde perikardiyal bağışıklık hücrelerinin kaderini ve işlevini anlamak için bu modelle birleştirilebilir.

Giriş

Bugüne kadar, kardiyovasküler hastalık (KVH) dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edilmekte ve bu da önemli bir mali yüke ve hastanın yaşam kalitesinde azalmaya neden olmaktadır¹. Koroner arter hastalığı (KAH), KVH'nin bir alt tipidir ve mortaliteye başlıca katkıda bulunan miyokard enfarktüsünün (MI) gelişiminde önemli bir rol oynar. Tanım olarak, MI, uzun süreli iskemi ve hipoksi koşullarına bağlı olarak miyokard dokusunda geri dönüşümsüz yaralanmadan kaynaklanır. Miyokard dokusu rejenerasyon kapasitesinden yoksundur, bu nedenle yaralanmalar kalıcıdır ve kalp kasının başlangıçta koruyucu olabilen fibrotik bir yara izi ile değiştirilmesine neden olur, ancak sonuçta olumsuz kardiyak yeniden yapılanmaya ve nihai kalp yetmezliğine katkıda bulunur².

KAH hastalarının yönetimi son birkaç on yılda dramatik bir şekilde iyileşmiş olsa da, iskemiye sekonder kronik kalp yetmezliği (CHF) dünya çapında birçok hastayı etkilemektedir. Bu salgının önlenmesi ve yönetilmesi için altta yatan mekanizmaların daha kapsamlı anlaşılması ve yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca, geçmiş bulgular sistemik tedavinin sınırlılıklarını ve kesin alternatiflerin geliştirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. İnsanlarda MI'nin moleküler sekellerinin araştırılmasının enfarktüs dokusuna erişme yeteneğinden etkilendiği göz önüne alındığında, insan MI ve CHF'nin KVH ile ilgili özelliklerini ve gelişimini özetleyen hayvan modelleri vazgeçilmezdir.

İdeal hayvan modelleri, yapısal ve fonksiyonel özellikler açısından bir insan bozukluğuna çok benzediğinden, hastalık etiyolojisi anlayışlarına rehberlik etmelidir. KAH'da koroner arterlerin kronik aterosklerotik darlığı veya akut trombotik tıkanıklıktır. Koroner arter daralması veya tıkanmasını indüklemek için çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinde farklı yöntemler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Bu tür stratejiler genel olarak iki gruba ayrılabilir: (1) bir MI'yi indüklemek için bir koroner arterin mekanik manipülasyonu ve (2) bir MI'ye yol açan koroner daralmayı kolaylaştırmak için aterosklerozun hızlandırılması. İlk strateji genellikle bir koroner arterin bağlanmasını veya arter içine bir stent yerleştirilmesini içerir. İkinci yaklaşım, hayvanın diyetini yüksek yağlı / kolesterollü yiyecekleri içerecek şekilde değiştirmeye dayanma eğilimindedir. Bu ikinci yaklaşımın sınırlamalarından bazıları, koroner oklüzyonların zamanlaması ve yeri üzerinde kontrol eksikliğini içerir.

Buna karşılık, bir hayvan modelinde MI veya iskeminin cerrahi indüksiyonu, daha tekrarlanabilir sonuçlara yol açan konum, kesin zamanlama ve koroner olayın kapsamı gibi çeşitli avantajlara sahiptir. En sık kullanılan yöntem sol ön inen koroner arterin (LAD) cerrahi ligasyonudur. Bu tür modeller, akut iskemik hasara karşı insan tepkilerini ve CHF^3'e ilerlemeyi özetlemektedir. Başlangıçta daha büyük hayvanlarda geliştirilen LAD ameliyatı, kemirgenler gibi küçük hayvanlar üzerinde teknolojideki ilerlemelerle daha uygulanabilir hale gelmiştir⁴. Bu tür modellerin oluşturulmasında, fareler göreceli mevcudiyetleri, konuttaki düşük masrafları ve genetik manipülasyon kapasiteleri de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle tercih edilmiştir.

LAD oklüzyonu kullanan iskemik kalp hastalığının çağdaş cerrahi modelleri, araştırmacının arteri geçici veya kalıcı olarak bağlamak için perikardın açılmasını gerektirir⁵. Bu tür stratejiler, uygun kalp fonksiyonunu sağlamak için esasen mekanik ve yağlama fonksiyonu oynayan perikardiyal boşluğun bozulmasına neden olur. Perikardın açılmasının bir diğer dezavantajı, hayvanın doğal perikardiyal sıvısını çeşitli hücresel ve protein bileşenleri ile kaybetmektir ^6,7. Buna cevaben, perikardı sağlam tutarken MI'yi indüklemek için bir yöntem tarafımızdan geliştirilmiştir. Bu homeostatik ortamın bozulmasını en aza indirmenin yanı sıra, bu yaklaşım bir MI'ye neden olduktan sonra belirli hücrelerin etiketlenmesine ve izlenmesine izin verir. Ek olarak, bu yaklaşım insan ortamında miyokard iskemik hasarını daha iyi temsil eder.

Protokol

Bu deneyler için 8-14 haftalık erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanıldı. Bu protokol, Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nden etik onay almıştır ve tüm hayvan bakım kurallarına uymaktadır.

1. Fare hazırlığı ve ameliyatı

1. Cerrahi aletleri sterilize edin (boncuk sterilizatörü veya otoklav yoluyla).
2. Ameliyat öncesi ağırlık ve analjezik doz için fareyi tartın.
3. Fareyi% 4 izofluran ve 800 mL / dak oksijen içeren bir indüksiyon kutusuna yerleştirin. Ayak parmaklarını sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği açısından gözlemleyerek anestezi düzlemini onaylayın.
4. Analjezik subkutan olarak enjekte edin (0.1 mg / kg Buprenorfin) (bakınız Malzeme Tablosu).
5. Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve burun konisi yoluyla verilen% 3 izofluran ile anesteziyi sürdürün. Her göze kuru gözlerden kaçınmak için oftalmik merhem uygulayın.
6. Göğüs ve boyun cerrahi bölgelerindeki saçları tıraş edin.
7. Farenin pençelerini kısıtlayın ve ameliyat masasına yerleştirin.
8. Ağız ve farenks yoluyla trakeaya pürüzsüz uçlu 23 G kateter yerleştirerek fareyi entübe edin.
   1. Entübasyonu takiben fareyi, 110 nefes/dak hızında, 250 μL'lik bir gelgit hacminde ve 4 mmHg'lik pozitif ekspiratuar basınç (PEEP) olarak ayarlanmış ticari bir Vantilatör ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak taşıyıcı gaz olarak %2 izofluran ve %100 oksijen ile havalandırın.
9. Ameliyat için göğsün sol tarafını konumlandırmak için fareyi% 30 sağ tarafına yuvarlayın.
10. Cerrahi bölgeyi dairesel bir hareketle% 70 etanol ve betadin içeren 3 alternatif ovma ile temizleyin(bkz. Steril cerrahi örtüleri cerrahi alanın etrafına yerleştirin.
11. Sol taraftaki pektoralis kaslarını görselleştirmek için göğüs derisinde 2-3 cm'lik bir yanal kesi yapın. Üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki interkostal kasları görselleştirmek için orta hattan dışa doğru 1 cm'lik bir kesi kullanarak pektoralis majör ve minörünü kesin.
    NOT: Kanayan damarların koterizasyonu yoluyla pektoralis kasından aşırı kanamayı önlemek için özen gösterilmelidir.
12. Kalbin ve akciğerlerin cerrahi kesiden uzaklaşmasına izin vermek için göğüs boşluğuna hava (pasif hava hareketi ile) sokmak için sol interkostal kasta 2 cm'lik bir kesi yapın. Ayrıca, interkostal kesip kanamayı önlemek için bir koter cihazı yardımıyla açıklığı genişletin (bakınız Malzeme Tablosu)
    NOT: Oksijenle patlayıcı reaksiyonları önlemek için koterizasyon döneminde ventilatör geçici olarak durdurulmalıdır. Perikardiyal keseye zarar vermemeye özen gösterilir.
13. Retraktörleri kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları geri çekin.
14. Perikardın ve altta yatan kalbin stereomikroskop altında gözlemlenmesini sağlayın.
    NOT: Fare perikardi, kalbin vaskülatürünü görselleştirmek için yeterince incedir.
15. Hareketini ve altta yatan kalbin hareketini azaltmak için perikardın yüzeyine nazikçe forseps yerleştirin.
16. Sol ön inen (LAD) koroner arteri, sol uzantının altından çıkışını izleyerek görsel olarak işaret eder.
17. Mikro iğne sürücüsünü kullanarak, LAD ve perikardın diğer tarafında ortaya çıkan sütür ile LAD'nin altındaki perikard boyunca uygun bir sütürü ( Malzeme Tablosuna bakınız) yönlendirin. Koroner arterden kan akışını kısıtlamak için sütürü bağlayın ve fazla sütürü makas yardımıyla kesin (Şekil 1A).
    NOT: Koroner artere kan akışını kısıtladıktan sonra, sol ventrikülün ön kısmının ağartılması görünür olmalıdır. Bu prosedür kalıcı bir ligasyon modelini temsil eder. Ancak bu aşamada farklı iskemi dönemlerine sahip geçici bir ligasyon yaklaşımı da uygulanabilir.
18. Steril bölgedeki kesi yerinin altında, göğsün içine perkütan olarak 24 G'lık bir kateter sürün (göğüs boşluğuna girdikten sonra kılavuz iğneyi çıkarın). Daha sonra, kaburgaları ve ardından kas katmanlarını ve cildi uygun bir dikiş (kas için konik bir iğne, cilt için geleneksel kesme iğnesi) kullanarak kapatın.
19. Göğüs kapandıktan sonra, kalan havayı göğüs boşluğundan 24 G kateter aracılığıyla 3 mL'lik bir şırınga ve göğüs kompresyonları ile nazik bir emme kullanarak boşaltın. Hava çıkarıldıktan sonra, 24 G kateteri geri çekin.
20. İzofluranı% 1'e düşürün.
21. Farenin anesteziden kurtulmasını sağlamak için oksijenle havalandırmayı sürdürürken izofluranı kapatın. Hayvan bağımsız olarak nefes alma belirtileri gösterdiğinde, 23 G trakea tüpünü ağızdan çıkarın ve fareyi normal solunumun yeniden başlaması için izlenecek bir kurtarma kafesine yerleştirin.
22. Harici bir ısı kaynağı sağlamak için kafesin bir kısmı bir ısıtma pedine yerleştirilerek farenin kafeste iyileşmesine izin verin.
23. Ameliyat sonrası 72 saat boyunca her 12 saatte bir analjezik (Buprenorfin 0.1 mg / kg, deri altından) bakım enjeksiyonları sağlayın.
24. Farelerin sağlık durumunu 7 gün boyunca günlük olarak izleyin, bu da insizyonları ve hayvan rahatsızlıklarını değerlendirmeyi içerir.
    NOT: Bu prosedürün invazivliği nedeniyle (torakotomi), antibiyotik uygulaması gerekli olabilir.

2. Ekokardiyografi (EKG) ile kardiyak fonksiyonun fonksiyonel değerlendirilmesi

1. Fareyi genel anestezi altında %1.5-2 izofluran ve 800 mL/dk oksijen ile indükleyin ve bakımını yapın.
2. Fareyi ısıtılmış bir sahne platformunda sırtüstü konuma getirin ve pençeleri EKG uçlarına takın.
3. Farenin göğsünü tıraş edin.
4. 40 MHz lineer transdüser probu ve temas jeli kullanarak ekokardiyografi görüntüleri elde edin ve uygun yazılımla analiz edin (bkz.
5. İzofluranı kapatın ve kafesi aktif bir duruma döndürmeden önce farenin ısıtma platformunda iyileşmesine izin verin.
   NOT: Ekokardiyografi değerlendirmesi non-invazivdir ve bu nedenle koroner ligasyon öncesi ve sonrası değişiklikleri belirlemek için deney boyunca uzunlamasına yapılabilir.

3. Fibroz boyama için kalp dokusu toplama

1. Fareleri% 100 CO₂ soluyarak feda edin ve kalbi dikkatlice diseke edin.
   NOT: Makas ve forseps kullanılarak bu, torasik boşluktaki dolaşım sisteminden serbest bırakmak için kalbe giren (vena kava, pulmoner ven) ve çıkan (pulmoner arter, aort) büyük damarların kesilmesiyle elde edilir.
2. Kalbi en az 24 saat boyunca% 10 formalin'de sabitleyin.
3. Sağ ventrikül, interventriküler septum ve sol ventrikülden düz bir tıraş bıçağı kullanarak örnekleri kesin ve insizyonun enfarktüs bölgesinin merkezinden geçmesini sağlayın. Numuneler daha sonra parafin gömme için çekirdek tesise gönderilir.
4. 5 μm kalınlığındaki doku kesitlerini bir mikrotomla kesin ve boyama için cam slaytlara yerleştirin.
5. Ticari ksilen ve derecelendirilmiş alkol kullanarak deparafinize deparinize deiyonize su ile yıkayın (2x 99%, 1x95%, 1x 70%) ve daha sonra rehidrat.
6. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca pikrik asit içinde% 0.1 Sirius kırmızısı ile leke.
7. Bölümleri 3 dakika boyunca %0,5 asetik asitle yıkayın ve 1 dakika boyunca %70 etanol ile durulayın.
8. 3.4'te belirtilen ters yıkama sırasını kullanarak bölümleri kurutun, artan ve derecelendirilmiş etanol konsantrasyonları ve ardından ksilen.
9. Mikroskobik değerlendirme için doku kesitlerini bir montaj çözeltisi ile monte edin (bkz.

4. Kalp ve perikardiyal kavite lavajının akış sitometrisi

1. Fareleri% 100 CO₂ inhalasyonu ile feda edin.
2. Fareyi sırtına yerleştirin ve kolları ve bacakları bant kullanarak bir cerrahi tahtaya sabitleyin.
3. Göğüs boşluğunun sol tarafını (deneyci görüşünden sağ taraf) dikkatlice açın, diyaframı yaklaşık orta noktaya kadar keserek başlayın ve daha sonra dış kaburgaları sternuma doğru kesin.
   NOT: Büyük kan damarlarını, özellikle sternuma paralel olarak çalışanları çentiklemekten kaçının.
4. Altta yatan kalbi ve perikardı açığa çıkarmak için bir hemostat kullanarak kaburgaları geri çekin.
   NOT: Perikard çok kırılgandır, bu nedenle kesim sırasında makasla yakalamadığınızdan emin olun.
5. Sol atriyum ve sol ventrikülün birleşme noktasına yakın perikardiyal boşluğa yerleştirilen bir PE-10 tüp ( bakınız Malzeme Tablosu) kateter kullanarak, perikardiyal boşluğa 100 μL steril salin enjekte edin.
   1. Tuzlu suyun kalbin arka tarafından birikmesine ve toplanmasına izin verin, işlem sırasında perikardın delinmemesine veya yırtılmamasına dikkat edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve kalbi işlerken lavaj sıvısını buzun üzerine yerleştirin.
6. Kalbe giren ve çıkan ana damarları (aort, pulmoner arter, ven ve vena kava) keserek kalbi tüketin. Sağ ve sol atriyumu çıkarın ve ventriküler kalp dokusunu tartın.
7. Makas kullanarak dokuyu küçük 1^mm2 parçalar halinde doğrayın ve 450 U/mL kollajenaz I, 125 U/mL kollajenaz XI, 60 U/mL DNaz I ve PBS'de 60 U/mL hyaluronidaz içeren 10 mL sindirim tamponuna orbital çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de 1 saat boyunca yerleştirin.
8. Kalp dokusu homojenlerini 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kardiyak parankimal hücreleri çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 60 x g'de aşağı doğru döndürün.
9. Süper natantı toplayın, tek bir hücre süspansiyonu için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden (Malzeme Tablosuna bakınız) geçin ve hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de aşağı doğru döndürün.
10. Daha önce tarif edildiği gibi perikardiyal ve kardiyak hücreler üzerinde hücresel belirteçlerin fragman kristalize edilebilir (Fc) reseptör blokajını ve boyanmasını gerçekleştirin⁸.
11. Örnekleri bir akış sitometresinde çalıştırın.

5. Perikard makrofajının plevral boşluğa interkostal yaklaşım (ICAPS) yöntemi kullanılarak etiketlenmesi⁹

1. Cerrahi aletleri sterilize edin (boncuk sterilizatörü veya otoklav yoluyla) ve başlamadan önce% 70 etanol püskürtün.
2. Fareyi genel anestezi altında %1.5-2 izofluran ve 800 mL/dk oksijen ile indükleyin ve bakımını yapın. Ayak parmaklarını sıkıştırarak ve hayvanı refleks eksikliği açısından gözlemleyerek anestezi düzlemini onaylayın.
3. Analjezik subkutan olarak enjekte edilir (Buprenorfin 0.1 mg / Kg).
4. Ameliyat sırasında fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin.
5. Sağ anterolateral torasik bölgeyi tıraş edin.
6. Cerrahi bölgeyi etanol ve betadin ile temizleyin.
7. Deride 3 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve forseps ile göğüs kafesini açığa çıkarın.
8. 5 μL floresan boncuk (ticari olarak temin edilebilen floresan mikrosferler, 1 μm, bakınız Malzeme Tablosu) ve 45 μL salin, eğimli uçlu bir PE-10 tüp şırınga kateterine yükleyin.
9. Kateteri daha önce tarif edildiği gibi interkostal boşluğa yönlendirin⁹, boncuk çözeltisini yavaşça enjekte edin ve kateteri tek bir hareketle çıkarın.
10. Zımbaları kullanarak cildi kapatın.
    NOT: Kesinin potansiyel olarak yeniden açılmasını en aza indirmek için dikiş yerine zımbalar kullanılır.
11. İzofluranı kapatın, fareyi kurtarma kafesine yerleştirin ve ilk 24 saat boyunca komplikasyonları izleyin.

Sonuçlar

Bu modifiye koroner ligasyon modeli, tekrarlanabilirlik ve hayvan hayatta kalma sağlamak için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, kalpte indüklenen önemli yaralanma nedeniyle, beklenen bazı intraoperatif ve postoperatif mortalite prosedürle ilişkilidir. Standart mortalite tipik olarak erkeklerde (~% 25-35) kadınlardan (~% 10-15) daha yüksektir.

Bir MI'nin modifiye koroner ligasyon ile başarılı bir şekilde indüklenmesi, kalbin fonksiyonel parametrelerindeki ve yapısal özelli...

Tartışmalar

Kemirgenlerde kapalı bir perikardda bir MI'yi indüklemek benzersizdir ve potansiyel olarak önemli uygulamalara sahip olabilir. Prosedür, cerrahın kemirgen modeline ve kemirgen kalp anatomisine aşinalığına büyük ölçüde dayanır. Başarı aynı zamanda üç kritik adımda verilen bakıma da bağlıdır: interkostal kas insizyonu ve kaburga retraksiyonu (Adım 1.11-1.13), enfarktüsün oluşturulması (Adım 1.17) ve hayvan iyileşmesi (Adım 1.22-1.24).

Torakotomi, perikardın deli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Steri-350 Bead Sterilizer	Inotech	NC9449759
10% Formalin	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm Cell strainer	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm Cell strainer	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK Lysis Buffer	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W Catheter Needle 24 G X 3/4"	CDMV Inc	108778
Betadine (10% povidone-iodine topical solution)	CDMV Inc	104826
Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP Ophthalmic Ointment	CDMV Inc	17909
Castroviejo Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
Collagenase I	Millipore Sigma	SCR103
Collagenase XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb Suture - CV-11 taper needle	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb Suture - PC-13 cutting needle	Medtronic Canada	SL-1659
Curved Blunt Forceps	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako Mounting Medium	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
Ethanol, 100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon Suture - BV-130-4 taper needle	Johnson & Johnson Inc.	2815G
Fiber-Optic Light	Nikon	2208502
Fine Forceps	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG Carboxylate Microspheres 1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293	Model 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
Isofluorane Vaporizer	Harvard Apparatus	75-0951
Isoflurane USP, 250 mL	CDMV Inc	108737
Magnetic Fixator Retraction System	Fine Science Tools	18200-20
MX550D- 40 MHz probe	Fujifilm- Visual Sonics
Needle Driver	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
Scissors	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B Stereo Microscope	Nikon	SMZ1-PS
VentElite Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic (10 mL, 0.3mg/mL buprenorphine))	CDMV Inc	124918	controlled drug
Vevo 2100 Software	Fujifilm-Visual Sonics