JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا طريقة للتمييز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الحبل الشوكي التي يسببها الإنسان وثقافتها المشتركة للتسجيل الكهربيفيزيولوجي.

Abstract

توفر الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) أداة قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر. تعد تسجيلات الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) وسيلة لتسجيل إمكانات المجال الكهربائي من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وتحليل نشاط الشبكة بمرور الوقت. وقد ثبت سابقا أن وجود hiPSC-A المتمايز باستخدام تقنيات لتعزيز النمط الظاهري للخلايا النجمية للحبل الشوكي يحسن النضج والنشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي (MN) عند مقارنتها بتلك المستزرعة بدون hiPSC-A أو في وجود الخلايا النجمية للقوارض. الموصوفة هنا هي طريقة لمشاركة زراعة الحبل الشوكي hiPSC-A مع hiPSC-MN وتسجيل النشاط الكهربي باستخدام تسجيلات MEA. في حين أن بروتوكولات التمايز الموصوفة هنا خاصة بالخلايا النجمية والخلايا العصبية الخاصة إقليميا بالحبل الشوكي ، يمكن تطبيق منصة الاستزراع المشترك على الخلايا النجمية والخلايا العصبية المتباينة بتقنيات خاصة بمصائر أخرى ، بما في ذلك hiPSC-A القشري و hiPSC-N. تهدف هذه البروتوكولات إلى توفير مقايسة فيزيولوجية كهربية للإبلاغ عن تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية وتوفير منصة لاختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في ALS.

Introduction

الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) هي أدوات قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر وتوفر نموذجا متعديا لاستراتيجيات اكتشاف الأدوية1. لقد أثبت الباحثون أن الثقافة المشتركة ل hiPSC-A مع hiPSC-N تعزز النضج المورفولوجي والجزيئي والفيزيولوجي الكهربي والدوائي لكلا النوعين من الخلايا ، مما يولد شبكات عصبية معقدة وتفاعلات الخلايا العصبية النجمية التي تشبه نظيراتها في الجسم الحي 2,3. يمكن لتجارب الاستزراع المشترك المماثلة أن تلخص السمات المميزة لعلم الأحياء المرضي ALS مثل السمية العصبية بوساطة الخلايا النجمية 4,5 وفرط استثارة الخلايا العصبية6. بالإضافة إلى ذلك ، مع التقدم في بروتوكولات التمايز ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC) إلى أنواع فرعية عصبية خاصة بالمنطقة ، بما في ذلك hiPSC-A و hiPSC-N 7,8 القشرية والحبل الشوكي. توفر هذه الاستراتيجيات إمكانية نمذجة أمراض الخلايا العصبية الحركية القشرية والشوكية في ALS بالإضافة إلى التأثير النجمي على كليهما. ومع ذلك ، يتطلب هذا وجود اختبار وظيفي قابل للتكرار لتحديد هذه الآثار.

لقد تبين مؤخرا أن تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) مناسب بشكل خاص للتوصيف الفيزيولوجي الكهربي للثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والنجمية2. على عكس التحليلات الفيزيولوجية الكهربية أحادية الخلية ، تسجل هذه المصفوفات الكهربية عالية الكثافة بشكل سلبي إمكانات المجال خارج الخلية من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية دون تعطيل ظروف الثقافة والحفاظ على سلامة أغشية الخلايا. هذه المنصات مفيدة بشكل خاص لتسجيل النشاط الخلوي والشبكي للثقافات بمرور الوقت واستجابة للتلاعب الدوائي. أخيرا ، عندما يكون وجود الخلايا النجمية متغيرا ثقافيا ، يمكن أن توفر تسجيلات MEA رؤى وظيفية حول التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية 2,9.

يظهر هنا بروتوكول محسن لتمايز hiPSC إلى hiPSC-A الحبل الشوكي والخلايا العصبية الحركية hiPSC (MN) التي تم التحقق من صحتها مسبقا2. ينتج عن بروتوكول تمايز الحبل الشوكي hiPSC-A باستمرار مزارع الخلايا النجمية ، والتي تكون إيجابية لبروتين S100 المرتبط بالكالسيوم B (S100β) ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و Homeobox B4 (HOXB4) في ما يصل إلى 80٪ و 50٪ و 90٪ من الخلايا ، على التوالي ، مما يشير إلى نضج مواصفات الحبل الدبقي والشوكي 2,10 . يولد بروتوكول التمايز hiPSC-MN خلايا عصبية إيجابية بنسبة >90٪ ل الكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) ، مما يوحي بهوية الخلايا العصبية الحركية ألفاالناضجة 2. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول تقنيات لتوليد الثقافات المشتركة hiPSC-A / MN التي ثبت سابقا أنها تؤدي إلى خلايا عصبية ذات تعقيد مورفولوجي معزز من خلال تحليل شول والفحص المجهري المناعي عند مقارنتها بالثقافات العصبية بدون الخلايا النجمية أو مع الخلايا النجمية للقوارض2. في حين أن هذه الأوصاف خاصة ب hiPSC-A و hiPSC-N للحبل الشوكي ، فإن الميزة الفريدة هي أن الثقافة المستقلة الأولية للخلايا النجمية والخلايا العصبية متبوعة بخطوات للثقافة المشتركة في نقاط زمنية لاحقة يمكن ترجمتها لدراسة آثار تفاعلات الخلايا العصبية والنجمية من مناطق محددة أخرى بالإضافة إلى الخلايا الخاصة بالمرض 7,8 . وأخيرا، يصف البروتوكول كيفية زراعة هذه الثقافات على لوحات MEA بحيث يمكن دراسة النشاط الوظيفي كعامل لتكوين الاستزراع المشترك بمرور الوقت مع القدرة على معالجة التكوين الخلوي وكذلك ظروف الثقافة.

الهدف من هذه البروتوكولات هو توفير اختبار وظيفي للتحقيق في تفاعلات الخلايا العصبية النجمية ، وفحص التغيرات الخاصة بالمرض ، واختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في مجال ALS. يتم توفير تعليمات الفيديو للخطوات الأكثر تحديا في هذا البروتوكول.

Protocol

1. إعداد وسائط زراعة الخلية

  1. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا الفردية باستخدام التراكيب المذكورة في الجدول 1.
  2. قم بخلط وتعقيم الوسائط في زجاجات مفلترة سعة 500 مل ، وقم بتخزينها محمية من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

2. الحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) وتمريرها

  1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (المخزنة في القسمة عند -80 درجة مئوية) في ثلاجة 2-8 درجة مئوية طوال الليل.
  2. قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي عند 1: 100 (v / v) في محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) أو وسط النسور المعدل من Dulbecco (DMEM).
  3. أضف ما يكفي من مصفوفة الغشاء القاعدي لتغطية الجزء السفلي من لوحة زراعة الأنسجة (5 مل للوحة 10 سم ، 2 مل للآبار المفردة من لوحة 6 آبار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة طوال الليل أو في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
  4. قم بشفط مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف واغسل اللوحة مرة واحدة باستخدام PBS قبل إضافة وسائط الاستزراع وخلايا البذر.
  5. افحص الألواح يوميا لتحديد وتوقع متى تكون جاهزة للمرور. لوحات مرور hiPSC بمجرد أن تصبح غالبية المستعمرات كثيفة بما فيه الكفاية بحيث يعرض مركز المستعمرات مناطق بيضاء متناثرة. لا تدع اللوحات تنضج بعد هذه النقطة. سوف يتسبب في تمايز زائد يؤدي إلى ظهور منطقة صفراء في وسط المستعمرات بسبب تعدد طبقات الخلايا ، أو فرط الخلايا الممدودة عند الحواف ، أو الاكتناز الفضفاض داخل المستعمرات ، أو زيادة موت الخلايا.
  6. في يوم المرور ، ارسم خطوطا شبكية على السطح الخارجي السفلي للألواح بعلامة لتسهيل التغطية الدقيقة للوحة بأكملها.
  7. افصل المستعمرات المتمايزة في غطاء مزرعة باستخدام مجهر تباين الطور (تكبير 10x) يكشط يدويا بطرف ماصة 200 ميكرولتر.
  8. شطف لوحات مرتين مع PBS (5 مل لكل غسلة للوحات 10 سم).
  9. أضف 5 مل من بروتياز تفكك الأنسجة قبل التسخين (جدول المواد) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في التقريب (4-7 دقائق) ، ولكن قبل رفع المستعمرات من اللوحة.
  10. يستنشق بعناية البروتياز التفكك. شطف بلطف لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني ، مع الحرص على عدم إزاحة المستعمرات.
  11. أضف 5 مل من وسط hiPSC الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى لوحة الثقافة.
  12. ارفع المستعمرات أثناء تقسيمها إلى مجاميع خلايا أصغر عن طريق خدش اللوحة بأكملها بطرف ماصة سعة 5 مل باستخدام حركة ذهابا وإيابا من أعلى إلى أسفل.
  13. اقلب اللوحة 90 درجة وكرر الخطوة أعلاه.
  14. قم بنسج مجاميع الخلايا برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 5 مل وتحقق من حجم الركام بشكل دوري تحت المجهر حتى تصبح غالبية مجاميع الخلايا حوالي 50-100 خلية.
  15. قم بزرع مجاميع الخلية في ألواح مصفوفة الغشاء القاعدي المطلية مسبقا ، باستخدام وسيط hiPSC إضافي لغسل اللوحة الأصلية. جمع ونقل معظم مجاميع الخلية إلى لوحات جديدة باستخدام ماصة 5 مل.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول بشكل متسق ، فيجب أن تحتوي اللوحة الأصلية على مستعمرات iPSC تغطي حوالي 50٪ من سطح الاستزراع قبل المرور. في هذه الحالة ، يجب أن تكون نسبة الانقسام من لوحة واحدة إلى خمس لوحات جديدة. ومع ذلك ، قد يحتاج هذا إلى تعديل اعتمادا على ظروف النمو ومعدلات النمو الخاصة بخط الخلية.
  16. رج الألواح المصنفة حديثا ذهابا وإيابا لتوزيع الركام بالتساوي.
  17. انقل الألواح إلى حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) ، واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.
  18. قم بإجراء تغيير متوسط كامل كل يوم باستخدام 10 مل من وسيط hiPSC. إذا كان هناك حطام خلوي زائد في اليوم التالي للمرور ، اغسله مرة واحدة ب 5 مل من الوسط قبل تغيير الوسائط.
  19. خطط للمرور بعد ذلك عندما تظهر المناطق البيضاء في وسط غالبية مستعمرات iPSC (الخطوة 2.5). سيحدث هذا بعد 4-6 أيام من كل ممر.

3. تجميد hiPSC

  1. قم بتنفيذ الخطوات الأولية كما في الخطوات 2.5-2.14 لمرور hiPSC.
  2. اجمع مجاميع الخلية في أنبوب سعة 15 مل وقم بتدويرها بسرعة 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  3. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط التجميد ، وانقلها إلى أنابيب التبريد باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    ملاحظة: على غرار خطوات المرور ، فإن نسبة الانقسام المعتادة هي لوحة iPSC واحدة إلى خمسة أنابيب تبريد ، اعتمادا على كثافة المستعمرات. استخدم حجما إجماليا قدره 1 مل من وسط التجميد لكل أنبوب تبريد.
  4. ضع أنابيب التبريد في حاوية حفظ مبردة وانقلها إلى -80 درجة مئوية طوال الليل.
  5. نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل بعد 24 ساعة.

4. ذوبان hiPSC

  1. قم بتغطية صفيحة 10 سم بمصفوفة الغشاء القاعدي (انظر 2.1-2.3).
  2. قم بإزالة أنبوب التبريد iPSC من النيتروجين السائل وضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 دقيقة ليذوب بسرعة. هز القارورة في الحمام حتى تذوب جزئيا وتحتوي على قطعة صغيرة من الثلج محاطة بالسائل.
  3. انقل مجاميع الخلية من أنبوب التبريد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أضف ما يصل إلى 15 مل من وسط hiPSC المسخن مسبقا لتخفيف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في وسائط التجميد.
  4. جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 15 مل عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  5. استنشاق المادة الطافية واستخدم ماصة سعة 5 مل لإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط hiPSC يحتوي على 20 ميكرومتر من مثبط سيرين / ثريونين كيناز المرتبط ب Rho (ROCK-I ، المركب Y-27632) لتجنب المزيد من نسج مجاميع الخلايا.
  6. انقل مجاميع الخلية إلى صفيحة 10 سم مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول باستمرار ، يمكن نقل الخلايا الموجودة في أنبوب تبريد واحد إلى لوحة واحدة مقاس 10 سم.
  7. هز اللوحة لتوزيع الركام بالتساوي.
  8. انقل اللوحة إلى حاضنة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.
  9. قم بإجراء تغيير متوسط كامل في اليوم التالي للذوبان باستخدام 10 مل من وسيط hiPSC بدون ROCK-I.

5. التفريق بين hiPSC في خلايا السلف العصبي في الحبل الشوكي (NPC)

  1. تأكد من أن الألواح ذات 6 آبار المطلية بمصفوفة غشاء الطابق السفلي جاهزة للاستخدام قبل بدء التمايز.
  2. ابدأ ب iPSC التي تم تمريرها مرة واحدة على الأقل ويفضل مرتين بعد الذوبان وبأربع لوحات على الأقل 10 سم (انظر الشرح في الخطوة 5.11).
  3. قم بتنفيذ الخطوات الأولية كما في الخطوات 2.5-2.14 لمرور hiPSC.
  4. انقل مجاميع الخلية من لوحين على الأقل مقاس 10 سم إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 5 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  6. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية ب 10 مل من وسيط hiPSC باستخدام ماصة سعة 10 مل ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة دقيقتين لتخفيف الالتصاقات من خلية إلى خلية في كل مجموعة.
  7. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط hiPSC الذي يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
  8. ماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لسحن مجاميع الخلية. تحقق من حجم الركام تحت المجهر بشكل دوري حتى تتكون غالبية معلق الخلية من خلايا مفردة أو مجاميع صغيرة من <10 خلايا.
  9. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم (المفضل) أو عداد الخلايا الآلي وحساب كثافة الخلية في تعليق الخلية.
  10. لوحة 3.0 × 106 خلايا في كل بئر من لوحة 6 آبار مغلفة مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول باستمرار ، فهذا يتوافق مع نسبة لوحين 10 سم في بئر واحد من 6 بئر / لوحة.
  11. كرر الخطوات 5.3-5.10 مع دفعة ثانية من لوحين 10 سم وقم بطلاء المنتج النهائي في مصفوفة غشاء قاعدي مطلية ببئر للوحة ثانية ذات 6 آبار. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: يتطلب الإكمال المثالي لبروتوكول الحبل الشوكي NPC بئرين يساوي أربع لوحات 10 سم. لسهولة سير العمل ، أكمل الخطوات 5.3- 5.10 بدفعتين من لوحين ، كل منهما المنتج النهائي عبارة عن لوحين منفصلين من 6 آبار ولكل منهما بئر واحد يحتوي على 3.0 × 106 خلايا.
  12. حافظ على طبقة iPSC أحادية البشرية الناتجة في وسط hiPSC يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I حتى يصل الالتقاء إلى >90٪ ، عادة في اليوم التالي ولكن ليس أكثر من 3 أيام بعد الطلاء الأولي لتجنب التمايز التلقائي (غير المنضبط).
  13. إذا تعذر بدء التمايز في اليوم التالي لطلاء الخلية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسائط يوميا إلى وسيط hiPSC جديد يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I. إذا لم يلتقطى >90٪ في غضون 3 أيام من الطلاء ، فتخلص من الخلايا وابدأ البروتوكول من جديد.
  14. بمجرد الوصول إلى التقاء >90٪ ، ابدأ التمايز. هذا هو اليوم في المختبر 1 (DIV1) من بروتوكول التمايز.
  15. في DIV 1 ، تخلص من وسيط hiPSC الذي يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I واشطفه مرتين باستخدام PBS لإزالة عامل نمو الجنين (FGF) وتحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) الموجود في وسط الخلايا الجذعية.
  16. قم بتغيير الوسيط إلى وسيط WiCell (الجدول 1) المكمل ب 0.2 ميكرومتر من LDN193189 (LDN) و 10 ميكرومتر من SB431542 (SB) لمدة 48 ساعة.
  17. في DIV 3 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسيط إلى وسيط WiCell المكمل ب LDN (0.5 ميكرومتر) + SB (10 ميكرومتر) + حمض الريتينويك (RA؛ 1μM) لمدة 48 ساعة.
  18. في DIV 5 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسائط إلى WiCell: قاعدة وسيط الحث العصبي (NIM) (الجدول 1) (50٪: 50٪ ، v / v) مكملة ب LDN (0.5 ميكرومتر) + SB (10 ميكرومتر) + RA (1 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة.
  19. في DIV 7 ، قم بإجراء تبادل متوسط بنفس الوسيط كما في الخطوة 5.18.
  20. في DIV 8 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسيط إلى WiCell: قاعدة NIM (50٪: 50٪) مكملة ب RA (1 ميكرومتر) + بورومورفامين (PMN) (1 ميكرومتر) + عامل التغذية العصبية المؤتلف المشتق من الدماغ البشري (BDNF) (10 نانوغرام / مل) + حمض الأسكوربيك (ASAC) (0.4 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة.
  21. في DIV 10 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير المتوسط إلى قاعدة NIM (100٪) مكملة كما هو مذكور في الخطوة 5.20 لمدة 48 ساعة.
  22. في DIV 11 أو 12 ، قم بتغطية قارورة ثقافة معقمة مقاس 25 سم2 بمصفوفة غشاء قاعدي استعدادا للمرور.
  23. استنشاق الوسط من كل بئر من لوحة 6 آبار l وشطف الخلايا مرة واحدة مع PBS.
  24. أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة ؛ قد يساعد هز الألواح بشكل متقطع في انفصال الخلية.
  25. إذا كانت الخلايا لا تزال غير معلقة ، فقم بفصلها ميكانيكيا عن طريق إخراج وسائط NIM من طرف ماصة 1000 ميكرولتر على الخلايا بحركة دائرية (تأكد من تغطية السطح بالكامل) ، أو عن طريق الكشط باستخدام مكشطة الخلية (غير مفضل).
  26. نقل الخلايا من 2 بئر إلى أنبوب 15 مل وإضافة مثبطات التربسين بنسبة مناسبة إلى كمية التربسين المستخدمة باستخدام ماصة 5 مل.
  27. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين ، واستنشاق المادة الطافية ، ثم إعادة تعليقها باستخدام 10 مل من قاعدة NIM باستخدام ماصة 10 مل.
  28. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة لتخفيف الالتصاقات من خلية إلى خلية.
  29. بعد خطوة الطرد المركزي الثانية ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من متوسط NIM (100٪) المكمل ب RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل) و ROCK-I (20 ميكرومتر). باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، قم بنسف الخلايا لأعلى ولأسفل خمس مرات تقريبا حتى يتم الحصول على تعليق غائم.
  30. إعادة زرع الركام في هذا الوسط إلى مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة 25 سم 2 دورق ثقافة معقمة بحيث تكون النتيجة النهائية هي اتحاد الخلايا من بئرين من صفيحة بئر 6 إلى دورق ثقافة معقم بغشاء قاعدي واحد مغطى بمصفوفة 25 سم 2 (ممر2: 1). استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة >90٪ في DIV 13 ، ولا يلزم اتخاذ خطوات أخرى حتى اليوم 14. إذا لم تكن الخلايا متقاربة ، فاحتفظ ب ROCK-I في الوسائط لمدة 1 أو 2 أيام إضافية.
  31. في DIV 14 ، قم بتغيير الوسائط المتوسطة إلى وسائط NIM جديدة + RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل).
  32. في DIV 15 ، قم بتغيير الوسيط إلى NIM: قاعدة وسيط التمايز العصبي (NDM) (الجدول 1) (50٪: 50٪) مع RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل) + الملحق B (50x) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + التغذية العصبية المشتقة من خط الخلايا الدبقية (GDNF) (10 نانوغرام / مل) + عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) (10 نانوغرام / مل) + عامل التغذية العصبية الهدبي (CNTF) (10 نانوغرام / مل). التغيير مع وسائل الإعلام الجديدة كل يوم.
  33. في DIV 21 ، قم بتغيير الوسيط إلى قاعدة NDM (100٪) المكملة كما في الخطوة 5.32 ، وقم بالتغيير باستخدام وسيط جديد كل يوم.
  34. في DIV 25-30 ، اجمع NPC وقم إما بتجميدها أو تمريرها إلى لوحة 10 سم للتمايز النهائي.
  35. شطف قارورة T-25 مع PBS وإضافة 0.05 ٪ التربسين.
  36. احتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  37. شطف التربسين والخلايا مع قاعدة NDM ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف مثبط التربسين بنسبة مناسبة إلى التربسين وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  38. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام الخلايا العصبية الحركية أو وسط تمايز الخلايا النجمية (الجدول 1) واستخدم ماصة 1000 ميكرولتر للسحن لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق خلية واحدة (عادة ما يصل إلى 5 مرات).
  39. عد الخلايا وانقلها إلى صفيحة مطلية بطول 10 سم كما هو موضح في القسم 6 ، باستخدام إما وسائط التمايز + Rock-I ، للتمييز بين hiPSC-MN و hiPSC-A.
  40. بدلا من ذلك ، قم بتجميد الثقافات عن طريق إعادة التعليق في وسط تجميد يتكون من 90٪ وسط NDM مع عوامل نمو (كما في الخطوات 5.32-5.33) و 10٪ DMSO ، وسحن بالمثل ، ثم انقله إلى أنبوب التبريد. القسمة 6 × 106 NPC لكل أنبوب تبريد.

6. ذوبان ثقافات NPC

  1. قم بتغطية ألواح 10 سم بالبولي أورنيثين (PLO) واللامينين في اليوم السابق لإذابة الخلايا.
    1. أضف 5 مل من PLO المخفف إلى 100 ميكروغرام / مل في PBS أو الماء المقطر (dH2O) إلى الأطباق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة حتى ليلة وضحاها.
    2. نضح محلول PLO وشطف الألواح ثلاث مرات باستخدام PBS. (PLO سامة إذا لم يتم غسلها بشكل صحيح.)
    3. أضف laminin المخفف في PBS إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل إلى الألواح المطلية ب PLO. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، ويفضل بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، استنشاق محلول laminin دون شطف لتعزيز التصاق الخلايا.
      ملاحظة: يمكن طلاء الألواح ب PLO مسبقا ، وغسلها ثلاث مرات بالماء ، وتجفيفها في غطاء معقم ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. قم بإذابة قارورة واحدة من NPC (أي DIV 25 أو 30) تحتوي على 6 × 106 خلايا / قارورة لكل لوحة زراعة خلايا 10 سم.
  3. قم بإزالة أنبوب التبريد NPC من النيتروجين السائل وضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 دقيقة. قم بإذابة الثلج بسرعة عن طريق هز القارورة حتى تكون هناك قطعة ثلج صغيرة محاطة بالسائل.
  4. نقل مجاميع الخلايا إلى مخروطي 15 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وإضافة ما يصل إلى 15 مل من NDM الذي تم تسخينه مسبقا أو وسيط النسور المعدل من Dulbecco (DMEM) / ملحق F21 F12 من Ham لتخفيف DMSO.
  5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية إما باستخدام وسيط تمايز الخلايا النجمية أو MN (الجدول 1) + ROCK-I (20 ميكرومتر) واستخدم ماصة 1000 ميكرولتر للسحن لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة (حتى 5 مرات).
  7. انقل التعليق أحادي الخلية إلى صفيحة 10 سم مطلية ب PLO-Laminin.
  8. انقل اللوحة إلى حاضنة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.

7. التفريق بين الحبل الشوكي NPC إلى الخلايا العصبية الحركية

  1. نفذ الخطوات الأولية كما هو مذكور في الخطوات 6.1-6.8 ، مع كون الوسيط النهائي هو وسيط التمايز MN + ROCK-I (20 ميكرومتر).
  2. في اليوم التالي للطلاء ، قم بإجراء تبادل كامل للوسيط مع وسيط تمايز MN بدون ROCK-I ، ثم قم بتغيير الوسائط كل يوم. خلال عطلة نهاية الأسبوع ، قم بتغذية الخلايا يوم الجمعة ثم مرة أخرى يوم الاثنين. شطف الخلايا مع PBS عند الحاجة لإزالة حطام الخلية.
  3. قم بتغيير الوسط باستخدام وسط تمايز MN + سيتوزين أرابينوسيد (ARA-C) (0.02 ميكرومتر) واحتضان لمدة 48 ساعة عندما تظهر الأسلاف الدبقية الملتزمة كخلايا مسطحة مفردة تتكاثر تحت أسلاف MN بعد الانقسام المجمعة في مجموعات الخلايا.
    ملاحظة: عادة ، يحدث هذا خلال أول 7 أيام بعد الطلاء الأولي ، على الرغم من أنه قد يكون هناك تباين اعتمادا على خط الخلية.
  4. بعد 48 ساعة ، استنشق الوسط الذي يحتوي على ARA-C ، وشطف الثقافات برفق باستخدام PBS ثلاث مرات ، وقم بتغيير الوسط إلى وسط MN طازج بدون ARA-C.
  5. بعد العلاج باستخدام ARA-C ، قم بإجراء عمليات تبادل متوسطة كل يوم (أو الاثنين والأربعاء والجمعة) عن طريق إزالة الوسيط القديم باستخدام ماصة يدوية بدلا من شفاط فراغ لمنع الانفصال المبكر للمجموعات العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإثراء وسط MN ب Laminin 1 ميكروغرام / مل مرة واحدة في الأسبوع لزيادة تعزيز الارتباط العصبي بألواح الثقافة.

8. التفريق بين NPC والخلايا النجمية في الحبل الشوكي

  1. ذوبان ثقافات NPC كما في القسم 6 ، باستخدام وسط تمايز الخلايا النجمية (الجدول 1) مع إضافة مصل الأبقار الجنينية (FBS) بحجم تركيز الحجم 1٪ (NS + 1٪ FBS) وكذلك ROCK-I (20 ميكرومتر) للطلاء.
    ملاحظة: يمكن استبدال السيروم المتوفر تجاريا (الجدول 1) ب FBS باستخدام نفس عوامل التخفيف.
  2. في اليوم التالي للطلاء ، قم بتغيير وسيط الاستزراع باستخدام NS + 1٪ FBS بدون مثبط ROCK ، ثم قم بتغيير الوسيط كل يوم. خلال عطلات نهاية الأسبوع ، قم بتغذية الخلايا يوم الجمعة ثم مرة أخرى يوم الاثنين. شطف الخلايا مع PBS عند الحاجة لإزالة حطام الخلية. إذا استمرت الخلايا في الموت ، فقم بتكملة الوسائط باستخدام ROCK-I (10 ميكرومتر) لتعزيز بقاء الخلية. كن حذرا من عدم استخدام ROCK-I كثيرا أو لفترة طويلة جدا ، نظرا لإمكانية اختيار الخلايا الخالدة.
  3. اسمح للخلايا النجمية أن تصبح متقاربة قبل تمريرها.
    ملاحظة: سيزداد حجم الخلية بمرور الوقت ، لذلك لا يوجد رقم محدد للمرور. نسبة النجاح النموذجية هي 1: 2 أو 1: 3. في حالة ضعف البقاء على قيد الحياة أو الانتقال إلى عدد كبير جدا من الأطباق ، ادمج لوحين (أو أكثر ، حسب الحاجة) بطول 10 سم مع لوحة واحدة مقاس 10 سم للحفاظ على التقاء.
  4. لتمرير مزارع السلف النجمي ، اغسل الألواح مرة واحدة باستخدام PBS (لإزالة FBS) ، واحتضان 0.05٪ تربسين لمدة 5 دقائق ، واجمع الخلايا في NS medium + 1٪ FBS (FBS سوف يعطل التربسين) ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في NS المتوسطة + 1 ٪ FBS ، ثم سحن إلى تعليق خلية واحدة. توزيع الخلايا في NS + 1٪ FBS على لوحات جديدة 10 سم.
    ملاحظة: بالإضافة إلى توسيع ثقافات الخلايا النجمية ، فإن التمرير المتكرر للصفائح يخدم غرض قتل أي خلايا سلفية متبقية اختارت مصيرا عصبيا. لذلك ، حتى لو لم يكن هناك معدل انقسامي مرتفع للغاية ، يمكن تمرير الألواح بنسبة 1: 1 إذا بدا أن هناك تلوثا عصبيا.
  5. تغيير الطلاء على مدار التمايز لتعزيز العائد على النحو التالي.
    1. قم بلوحة ثقافات NPC المذابة في البداية والممرات الأولى بعد الطلاء الأولي على PLO / Laminin.
    2. لوحة الخلايا النجمية غير الناضجة على لوحات مغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي.
    3. صفيحة الخلايا النجمية الأكثر نضجا (أي بعد اليوم 90) إما على مصفوفة الغشاء القاعدي ، أو الألواح المطلية ب PLO / Laminin (عادة للثقافة المشتركة مع الخلايا العصبية) ، أو على لوحات غير مطلية.
  6. قم بتجميد أسلاف الخلايا النجمية في أي وقت خلال فترة النضج البالغة 60 يوما لمزامنة الثقافات أو حفظها للتجارب اللاحقة. عند الذوبان بعد مرحلة NPC ، قم بإذابة أسلاف الخلايا النجمية على الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي بدلا من PLO / Laminin.
  7. في DIV 90 وما بعده ، قم بتبديل الوسيط من NS + 1٪ FBS إلى NS + 5٪ FBS لتعزيز بقاء الخلايا النجمية وتقليل انتشارها.

9. الاستزراع المشترك MN والخلايا النجمية للحبل الشوكي في لوحات صفيف متعددة الأقطاب الكهربائية

  1. قم بتمييز ولوحة الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية عندما تكون جاهزة للاستخدام في نفس اليوم وعمرها إلى DIV 60 للخلايا العصبية الحركية و DIV 90 للخلايا النجمية.
  2. قم بتغطية ألواح MEA في اليوم السابق أو في يوم الطلاء على النحو التالي إذا كنت تعمل بألواح بلاستيكية ذات 24 بئرا (جدول المواد).
  3. تمييع PLO في الماء أو PBS إلى 100 ميكروغرام / مل.
    1. أضف 15-20 ميكرولتر إلى كل بئر (يعتمد على مستوى راحة الماصة) ، مما يشكل قطرة في مركز البئر تغطي منطقة الأقطاب الكهربائية والمنطقة المحيطة بها ولكن ليس كامل البئر.
    2. احرص على عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة. كن متسقا مع الحجم من بئر إلى بئر لضمان تغطية نفس مساحة السطح في كل بئر.
    3. احتضان PLO عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة (يفضل 2 ساعة).
      ملاحظة: سوف تجف الأحجام الصغيرة إذا لم تكن هناك رطوبة كافية في الألواح. أضف الماء إلى المقصورات المحيطة بالآبار لضمان رطوبة كافية طوال فترة الطلاء والتسجيلات.
  4. نضح أكبر قدر ممكن من PLO باستخدام طرف ماصة بلاستيكية. احرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية. يغسل مع 250 ميكرولتر من الماء ثلاث مرات. في حالة استخدام شفاط فراغ للغسيل ، لا تسمح للطرف بالقرب من مجموعة القطب. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء ، باستخدام طرف ماصة حسب الضرورة. دع السطح يجف تحت غطاء زراعة الخلية مع إزالة الغطاء.
  5. بمجرد أن تجف أسطح الألواح ، أضف Laminin المخفف إلى 10 ميكروغرام / مل في PBS. استخدم 15-20 ميكرولتر لتغطية كل مجموعة قطب كهربائي. أضف الماء إلى حجرات الرطوبة ، واستبدل الغطاء ، وأعد اللوحة إلى حضانة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة حتى ليلة وضحاها.
  6. في يوم الطلاء ، اشطف مزارع MN والخلايا النجمية مرة واحدة باستخدام PBS وأضف التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لرفع الخلايا (5 دقائق). اجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على مثبط التربسين وغسل الألواح ذات الوسط أو القاعدة لضمان جمع جميع الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقه باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لتوليد 1 مل من تعليق خلية واحدة. عند إعادة تعليق MN والخلايا النجمية ، قم بالتبديل إلى وسيط الاستزراع المشترك (الجدول 1) ، مع إضافة 20 ميكرومتر ROCK-I.
  7. عد MN والخلايا النجمية بالتوازي باستخدام مقياس الدم. أثناء العد وإجراء العمليات الحسابية ، قم بتغطية معلقات الخلية وضعها في رف الستايروفوم عند 4 درجات مئوية.
  8. احسب الحجم المطلوب لإعادة تعليق المزارع إلى تركيز 5 × 10 4 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا العصبية الحركية و 2.5 × 104 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا النجمية. قم بالطرد المركزي لمعلقات الخلايا سعة 1 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في الحجم المحسوب.
  9. احسب عدد الآبار المرغوبة المراد بذرها واضربها في 5 ميكرولتر من كل تعليق خلوي. اجمع الحجم المطلوب من معلقات الخلايا العصبية والخلايا النجمية بنسبة 1: 1 واخلطها عن طريق السحب حتى تمتزج تماما (عادة مرتين) ، ولكن تجنب أن تكون عدوانيا جدا.
  10. قم بإزالة Laminin من كل بئر من لوحة MEA باستخدام طرف ماصة. انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية المدمج النهائي إلى كل بئر ، مكونا قطرة صغيرة تغطي مجموعة الأقطاب الكهربائية لتوفير كثافة خلية تبلغ 5 × 10 4 MN و 2.5 × 104 خلايا نجمية لكل بئر.
    ملاحظة: تتطلب الكثافة العالية للخلايا في التعليق المشترك إعادة تعليق متكررة بين الآبار أثناء خطوة البذر لضمان عدد خلايا دقيق ومتسق.
  11. أعد اللوحات إلى الحاضنة لمدة 20-30 دقيقة. احرص على عدم إزعاج قطرة الخلية والسماح للخلايا بتكوين مرفقات أولية على الألواح.
  12. بعد 20-30 دقيقة ، أضف وسائط الاستزراع المشترك الدافئة + ROCK-I إلى كل بئر عن طريق سحب 250 ميكرولتر لأسفل على جدار كل بئر ، متبوعا ب 250 ميكرولتر إضافية أسفل جدار نفس البئر على الجانب الآخر. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
  13. افحص الأطباق في اليوم التالي للبذر (يوم الاستزراع المشترك 1). إذا كان هناك حطام خلوي كبير أو خلايا ميتة ، فاستبدل الوسط بوسط زراعة مشترك جديد يحتوي على ROCK-I. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسيط في اليوم الثاني بعد البذر (يوم الاستزراع المشترك 2) إلى وسيط الاستزراع المشترك بدون ROCK-I. قم بإجراء تبادلات نصف متوسطة (نضح 50٪ وإضافة 60٪ من الحجم النهائي لحساب التبخر) مرتين في الأسبوع.
  14. في حالة استخدام أنظمة MEA مع ألواح زجاجية أحادية البئر مقاس 30 مم (جدول المواد) ، فقد يستغرق إعداد اللوحة 2 يوما أو أكثر. اتبع الخطوات أدناه لتنفيذ ذلك.
  15. ارفع الخلايا وحطام الخلايا من مزارع MEA السابقة باستخدام 0.05٪ تربسين لمدة 5-15 دقيقة.
  16. نضح التربسين وشطف ثلاث مرات بالماء.
  17. تعقيم بإضافة 70 ٪ من الإيثانول واحتضان في غطاء المحرك لمدة 10 دقائق. نضح الإيثانول ، ثم شطف بالماء ثلاث مرات.
  18. ضع 1٪ منظف أنيوني مع إنزيم البروتياز في الماء. قم بتغطية الألواح بغطاء ولفها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم ، ثم اتركها على الروك في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  19. نضح المنظف ، ثم اشطفه ثلاث مرات بالماء.
  20. إذا كنت تخطط لتخزين الألواح ، أضف كمية كافية من الماء. قم بتغطية الألواح بغطاء ولفها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم ، واتركها في الثلاجة حتى الاستخدام التالي.
  21. إذا كنت تخطط للطلاء ، اترك السطح يجف تحت غطاء زراعة الخلية.
  22. إذا كانت هناك حاجة إلى تعقيم إضافي (على سبيل المثال ، عدوى سابقة أو استخدام غير حديث) ، في هذه المرحلة فقط ، قم بتعريض ألواح MEA للأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت الغطاء لمدة 30-60 دقيقة.
    ملاحظة: تجنب الأشعة فوق البنفسجية المتكررة سيمنع تلف الأقطاب الكهربائية. سيؤدي استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية عندما تحتوي الألواح على مصل عليها إلى أقطاب كهربائية غير وظيفية ، ولهذا السبب يجب استخدامه فقط على الألواح النظيفة.
  23. عندما تجف الألواح تماما ، تابع تنظيف البلازما لمدة 1 دقيقة لشحن السطح الزجاجي لألواح MEA وتعزيز فعالية الطلاء. تنظيف البلازما مرة واحدة على الأقل كل 4-5 دورات من دورات طلاء وتنظيف الألواح MEA.
    1. كبديل ، عندما يكون تنظيف البلازما غير ممكن أو غير مبرر ، أضف كمية كافية من الوسط المحتوي على FBS لتغطية سطح ألواح MEA وإعادتها إلى الحاضنة طوال الليل.
  24. استخدم طلاء PLO / Laminin كما هو موضح أعلاه في القسم 6. أضف محلول PLO (100 ميكروغرام في PBS) مباشرة بعد تنظيف البلازما أو استنشاق وشطف الوسط المحتوي على FBS.
  25. قم بصفيحة الخلايا على النحو الوارد أعلاه بالكثافات التالية: 1 × 10 5 hiPSC-A / لوحة و5 × 105 hiPSC-MN / لوحة.

10. تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية

  1. استخرج بيانات الجهد الخام بتردد أخذ عينات 12.5 كيلو هرتز ، باستخدام مرشح Butterworth مع مرشح تمرير عالي 200 هرتز ومرشح تمرير منخفض 3 كيلو هرتز. قم بتعيين التعرف على الارتفاع كنقاط زمنية فورية للجهد ≥6 انحرافات معيارية عن خط الأساس. حدد الرشقات النارية كنشاط مع >5 طفرات في 100 مللي ثانية. حدد نشاط الشبكة عندما يتم تشغيل أكثر من 35٪ من إجمالي الأقطاب الكهربائية النشطة في غضون 100 مللي ثانية بحد أدنى 50 طفلا لكل انفجار شبكة.
  2. ابدأ التسجيل في أقرب وقت ممكن بعد يوم الثقافة المشتركة (CC) 1.
    ملاحظة: نادرا ما يتم ملاحظة النشاط الكهربائي قبل CC Day 3.
  3. مزارع الصفائح المتوازية بكثافات مماثلة وتتكرر في ألواح الاستزراع المناسبة أو أغطية المقايسات البيوكيميائية أو الكيمياء المناعية (ICC) أو qPCR.
  4. قم بإجراء التسجيلات مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وCO 2 بنسبة 5٪. انقل اللوحات إلى الجهاز واسمح لها بالتوازن لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
  5. سجل نشاط خط الأساس إما كل يومين أو أسبوعيا ، على مدار 1-15 دقيقة اعتمادا على التصميم التجريبي. لا تسجل لمدة 1 ساعة على الأقل بعد تبادل متوسط ، وانتظر بشكل مثالي لمدة 24 ساعة بعد كل تبادل وسائط.
  6. لمنع التلوث ، قم بتغيير الوسيط (أي نصف التبادل المتوسط كما في الخطوة 9.14) بعد أي تسجيل يجب فيه فتح غطاء اللوحة المعقمة خارج الغطاء المعقم (أي تطبيق مركبات الدواء). قم بإجراء عمليات تبادل متوسطة كاملة وغسالات لغسل الأدوية إذا استمر استخدام الأطباق بعد العلاج بالعقاقير.
  7. لأغراض التحليل ، استخدم ما لا يقل عن ثلاث نسخ مكررة تقنية وبيولوجية لكل حالة. التعبير عن البيانات الكهربية كوسيلة لتكرار n ≥ 3.

11. المقايسات الدوائية على مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية

  1. استخدم مجموعة مختلفة من الثقافات المشتركة اعتمادا على السؤال التجريبي: الخلايا العصبية ALS مع الخلايا النجمية الضابطة ، الخلايا العصبية الضابطة مع الخلايا النجمية ALS ، الخلايا العصبية ALS والخلايا النجمية ، الخلايا العصبية الضابطة والخلايا النجمية.
  2. عند التحقيق في التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية العابرة للمركبات التي تستهدف الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية ، سجل نشاط خط الأساس لمدة لا تقل عن 1 دقيقة مع إزالة غطاء اللوحة ولكن غطاء الماكينة مغلق.
  3. افتح الغطاء يدويا للجهاز دون إيقاف التسجيل الفيزيولوجي الكهربي وتبادل 25 ميكرولتر من الوسط مع مركبة الدواء المناسبة (عادة ما تكون وسيطة جديدة) باستخدام ماصة متعددة القنوات في حالة معالجة آبار متعددة. أغلق الغطاء يدويا.
  4. سجل لمدة 1 دقيقة إضافية (أو أكثر إذا كانت هناك تغييرات كبيرة ناجمة عن السيارة تحتاج الثقافة إلى التعافي منها).
  5. افتح الغطاء يدويا مرة أخرى واستبدل 25 ميكرولتر من الوسط مع الدواء محل الاهتمام في نفس السيارة. أغلق غطاء الجهاز وتابع التسجيل.
    ملاحظة: قد تختلف مدة التسجيل وحجم الدواء / السيارة التي يتم إعطاؤها أو تحتاج إلى تحسين اعتمادا على السؤال التجريبي.
  6. لأغراض التحليل ، تأكد من أن إضافة السيارة لا تثير تغييرات كبيرة في المعلمات الكهربية. حساب النسبة المئوية للتغيرات في النشاط بعد الدواء مقارنة بعد إضافة السيارة والمقارنة بين الظروف.
  7. للتحقيق في التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية الطولية ، مثل الأدوية المرشحة المعدلة للمرض ، سجل نشاط خط الأساس الموضح في الخطوة 11.2. لهذا ، استخدم إما وسيط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على الدواء (الأدوية) ذات الأهمية في السيارة المناسبة أو الوسيط الذي يحتوي على السيارة فقط.
  8. لأغراض التحليل ، قارن تسجيلات النقطة الزمنية من ALS أو الثقافات المشتركة للتحكم التي تمت معالجتها طوليا بالأدوية مع بعضها البعض وظروف التحكم.

النتائج

تم توضيح بروتوكول نمط الحبل الشوكي لتوليد hiPSC-MN و hiPSC-A في الحبل الشوكي في الشكل 1. في هذا البروتوكول ، يتم الحفاظ على hiPSCs وتمريرها كمستعمرات غير متقاربة (الشكل 2 أ). يبدأ تكوين الخلايا العصبية (الحث العصبي) من خلال تثبيط SMAD المزدوج عن طريق إضافة LDN193189 و SB431542 ، مم?...

Discussion

حتى الآن ، وجدت الطرق القائمة على hiPSC و MEA للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للمزارع المشتركة بين الخلايا العصبية النجمية تطبيقا محدودا في مجال ALS6 ولا تزال غير موجودة في المنصات البشرية بالكامل ، على عكس استخدامها الأكثر انتشارا للنمذجة المختبرية للصرع9. ومع ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه المخطوطة بما يلي: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH) ، 2020 جائزة التطوير الوظيفي للعلماء السريريين لمؤسسة دوريس ديوك الخيرية (CWH). 1R01NS117604-01NIH / NINDS (NJM) ، DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM) ، 2019 MSCRFD 5122 (NJM). نشكر الدكتورة رها دستغيب والدكتور نورمان هوغي على توفير منصة MEA وبرامج تحليل البيانات التي استخدمناها للتحقق من صحة منصة الفيزيولوجيا الكهربية الموصوفة. نود أن نشكر خليل روست على مساعدتهم في عرض البروتوكول والتصوير.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm sterile culture platesFalcon353003
25 cm2 sterile culture flasksFalcon353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)Thermofisher21985023Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter SystemCorning430769
5 mL pipetteFalcon357543
6 well sterile culture platesFalcon3046
Amphotericine BGibco15290018Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)SigmaA4403Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)AxionOPT-24
Axion Edge MEA platformAxionMaestro Edge
Basement Membrane matrix - MatrigelCorning354277Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)Peprotech450-13Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion EdgeAirGas/Harris9296NC
Compound EAbcamab142164Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)Sigma AldrichC239Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)Tocris111Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12Thermofisher113300Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 SupplementThermofisherA1517001Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermofisher16140071Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)Peprotech450-10Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
HemocytometerElection Microscopy Sciences63510-20
HeparinMillipore-sigmaH3149-100KUDissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubatorThermoFisher370set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)R&D systems291-G1-200Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acidAbcamab144490Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)Thermofisher10828Working concentration 1x
LamininThermofisher23017-015Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189Stemgent04-0074Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-GlutamineThermofisher25030Working concentration 100x
MEA glass platesMultiChannel Systems60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200GilsonPJ22224
NeurobasalThermofisher21103049Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Thermofisher11140050Working concentration 100x
Pencillin/StreptomycinThermofisher15140122Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)Sigma-AldrichP3655Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)NANAWorking concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)Millipore-Sigma540223Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)SigmaR2625Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitorPeprotech1293823Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542SigmaS4317Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoodsBaker CompanySG-600
Supplement B - B27 SupplementThermofisher21985023Working concentration 50x
Supplement N - N2 SupplementThermofisher17502048Working concentration 100x
Table top cell culture centrifugeThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - ParafilmPARAFILMP7793
Tissue dissociation protease - DispaseStemCell Technologies7923Working concentration 1x
Trypsin InhibitorSigmaT6522-1GDissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermofisher2530054Working concentration 1x
WaterbathThermoFisher2332Isotemp

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 hiPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved