Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Resumen

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Resumen

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) proporcionan una herramienta poderosa para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro. Las grabaciones de matriz de electrodos múltiples (MEA) son un medio para registrar potenciales de campo eléctrico de grandes poblaciones de neuronas y analizar la actividad de la red a lo largo del tiempo. Se demostró previamente que la presencia de hiPSC-A que se diferencian utilizando técnicas para promover un fenotipo de astrocito de la médula espinal mejoró la maduración y la actividad electrofisiológica de las neuronas motoras (MN) hiPSC de la médula espinal específicas regionalmente en comparación con las cultivadas sin hiPSC-A o en presencia de astrocitos de roedores. Aquí se describe un método para cocultivar hiPSC-A de la médula espinal con hiPSC-MN y registrar la actividad electrofisiológica utilizando grabaciones MEA. Si bien los protocolos de diferenciación descritos aquí son particulares para los astrocitos y las neuronas que son regionalmente específicos de la médula espinal, la plataforma de cocultivo se puede aplicar a astrocitos y neuronas diferenciadas con técnicas específicas para otros destinos, incluidos hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Estos protocolos tienen como objetivo proporcionar un ensayo electrofisiológico para informar sobre las interacciones glia-neurona y proporcionar una plataforma para probar medicamentos con potencial terapéutico en la ELA.

Introducción

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) son herramientas poderosas para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro y proporcionan un paradigma traslacional para las estrategias de descubrimiento de fármacos¹. Los investigadores han demostrado que el cocultivo de hiPSC-A con hiPSC-N mejora la maduración morfológica, molecular, electrofisiológica y farmacológica de ambos tipos celulares, generando redes neuronales complejas e interacciones astrocito-neurona que se asemejan a sus contrapartes in vivo ^2,3. Experimentos similares de cocultivo pueden recapitular las características distintivas de la patobiología de la ELA, como la neurotoxicidad mediada por astrocitos ^4,5 y la hiperexcitabilidad neuronal⁶. Además, con los avances en los protocolos de diferenciación, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se pueden diferenciar en subtipos neuronales específicos de la región, incluidos hiPSC-A cortical y de médula espinal e hiPSC-N ^7,8. Estas estrategias proporcionan el potencial para modelar la patología de las neuronas motoras corticales y espinales en la ELA, así como la influencia astrocítica en ambas. Sin embargo, esto requiere que haya un ensayo funcional reproducible para determinar estos efectos.

Recientemente se demostró que el registro de matriz de electrodos múltiples (MEA) es particularmente adecuado para la caracterización electrofisiológica de cocultivos neuronales-astrocitos². A diferencia de los análisis electrofisiológicos unicelulares, estas matrices de electrodos de alta densidad registran pasivamente los potenciales de campo extracelular de grandes poblaciones de neuronas sin interrumpir las condiciones de cultivo y preservar la integridad de las membranas celulares. Estas plataformas son particularmente útiles para registrar la actividad celular y de red de los cultivos a lo largo del tiempo y en respuesta a la manipulación farmacológica. Finalmente, cuando la presencia de astrocitos es una variable de cultivo, los registros de MEA pueden proporcionar información funcional sobre las interacciones bidireccionales astrocito-neurona ^2,9.

Aquí se presenta un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSC en hiPSC-A de la médula espinal y hiPSC-neuronas motoras (MN) que ha sido previamente validado². El protocolo de diferenciación hiPSC-A de la médula espinal da como resultado consistentemente cultivos de astrocitos, que son positivos para la proteína B de unión al calcio S100 (S100β), la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y Homeobox B4 (HOXB4) en hasta el 80%, 50% y 90% de las células, respectivamente, lo que indica una especificación glial y de la médula espinal madura ^2,10 . El protocolo de diferenciación hiPSC-MN genera neuronas que son >90% positivas para la colina acetiltransferasa (ChAT), lo que sugiere una identidad madura de neurona alfa-motora². Además, el protocolo describe técnicas para la generación de cocultivos hiPSC-A/MN previamente demostrados para dar lugar a neuronas con mayor complejidad morfológica por análisis de Scholl y microscopía inmunofluorescente en comparación con cultivos neuronales sin astrocitos o con astrocitos de roedores². Si bien estas descripciones son específicas de la médula espinal hiPSC-A y hiPSC-N, una ventaja única es que el cultivo independiente inicial de astrocitos y neuronas seguido de pasos para el cocultivo en puntos de tiempo posteriores se puede traducir para estudiar los efectos de las interacciones neurona-astrocito de otras regiones específicas, así como de células específicas de la enfermedad ^7,8 . Finalmente, el protocolo describe cómo cultivar estos cultivos en placas MEA para que la actividad funcional como factor de composición de cocultivo pueda estudiarse a lo largo del tiempo con la capacidad de manipular la composición celular y las condiciones de cultivo.

El objetivo de estos protocolos es proporcionar un ensayo funcional para investigar las interacciones astrocito-neurona, examinar los cambios específicos de la enfermedad y probar medicamentos con potencial terapéutico en el campo de la ELA. Se proporcionan instrucciones en video para los pasos más desafiantes de este protocolo.

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo celular

1. Preparar los medios de cultivo celular individuales utilizando las composiciones mencionadas en la Tabla 1.
2. Mezclar y filtrar estéril el medio en frascos filtrados de 500 ml, y almacenar protegido de la luz a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Mantenimiento y paso de células madre pluripotentes inducidas humanas no confluentes (hiPSC)

1. Descongele la matriz de la membrana basal (almacenada en alícuotas a -80 °C) en un refrigerador de 2-8 °C durante la noche.
2. Diluir la matriz de la membrana basal a 1:100 (v/v) en solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) o en el medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM).
3. Agregue suficiente matriz de membrana basal para recubrir el fondo de la placa de cultivo de tejidos (5 ml para una placa de 10 cm, 2 ml para pocillos individuales de placa de 6 pocillos) e incubar a 37 °C durante un mínimo de 30 minutos durante la noche o a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 h.
4. Aspire la matriz de membrana basal diluida y lave la placa una vez con PBS antes de agregar medios de cultivo y células de siembra.
5. Examine las placas diariamente para determinar y anticipar cuándo están listas para ser pasadas. Placas de paso de hiPSC una vez que la mayoría de las colonias se han vuelto lo suficientemente densas como para que el centro de las colonias muestre áreas blancas dispersas. No permita que las placas maduren más allá de este punto. Causará un exceso de diferenciación que conduce a la aparición de un área amarilla en el centro de las colonias debido a la multicapa celular, la superabundancia de células alargadas en los bordes, la compacidad suelta dentro de las colonias o el aumento de la muerte celular.
6. El día de la travesía, dibuje líneas de cuadrícula en la superficie exterior inferior de las placas con un marcador para facilitar la cobertura precisa de toda la placa.
7. Separar colonias diferenciadas en una campana de cultivo utilizando un microscopio de contraste de fase (aumento de 10x) raspado manual con una punta de pipeta de 200 μL.
8. Enjuague las placas dos veces con PBS (5 ml por lavado para placas de 10 cm).
9. Añadir 5 ml de proteasa de disociación tisular precalentada (Tabla de materiales) e incubar las células a 37 °C hasta que los bordes de las colonias comiencen a redondearse (4-7 min), pero antes de que las colonias se levanten de la placa.
10. Aspirar cuidadosamente la proteasa de disociación. Enjuague suavemente la placa dos veces con PBS, teniendo cuidado de no desalojar las colonias.
11. Agregue 5 ml de medio hiPSC precalentado (Tabla 1) a la placa de cultivo.
12. Levante las colonias mientras las divide en agregados de células más pequeñas rascando toda la placa con la punta de una pipeta de 5 ml con un movimiento de ida y vuelta de arriba a abajo.
13. Gire la placa 90° y repita el paso anterior.
14. Triturar suavemente los agregados celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml y verificar el tamaño de los agregados periódicamente bajo un microscopio hasta que la mayoría de los agregados celulares sean aproximadamente 50-100 células.
15. Siembre los agregados celulares en las placas de matriz de membrana basal prerecubiertas, utilizando un medio hiPSC adicional para lavar la placa original. Recoja y transfiera la mayoría de los agregados celulares a las nuevas placas utilizando una pipeta de 5 ml.
    NOTA: Si el protocolo se aplica de manera consistente, la placa original debe contener colonias de iPSC que cubran aproximadamente el 50% de la superficie de cultivo antes del paso. En este caso, la proporción de división debe ser de una placa a cinco placas nuevas. Sin embargo, esto puede necesitar ser ajustado dependiendo de las condiciones de crecimiento y las tasas de crecimiento específicas de la línea celular.
16. Agite las placas recién sembradas hacia adelante y hacia atrás para distribuir los agregados de manera uniforme.
17. Transfiera las placas a una incubadora (37 °C y 5% de_CO2) y déjelas inalteradas durante la noche para permitir una adhesión celular adecuada.
18. Realice un cambio completo de medio todos los días con 10 ml de medio hiPSC. Si hay exceso de desechos celulares al día siguiente del pasaje, lávese una vez con 5 ml del medio antes del cambio de medio.
19. Planifique el paso a continuación cuando aparezcan áreas blancas en el centro de la mayoría de las colonias iPSC (paso 2.5). Esto ocurrirá 4-6 días después de cada pasaje.

3. Congelación de hiPSC

1. Realice los pasos iniciales como en los pasos 2.5-2.14 para el paso de hiPSC.
2. Recoja los agregados celulares en un tubo de 15 ml y gire a 200 x g durante 2 min.
3. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet en un medio de congelación y transferir a criotubos con una pipeta de 5 ml.
   NOTA: Similar a los pasos de paso, la relación de división habitual es de una placa iPSC a cinco criotubos, dependiendo de la densidad de colonias. Use un volumen total de 1 ml de medio de congelación para cada criotubo.
4. Coloque los criotubos en un recipiente de criopreservación refrigerado y transfiéralo a -80 °C durante la noche.
5. Transfiera las células a nitrógeno líquido después de 24 h.

4. Descongelación de hiPSC

1. Cubra una placa de 10 cm con la matriz de la membrana basal (ver 2.1-2.3).
2. Retire un criotubo iPSC del nitrógeno líquido y colóquelo inmediatamente en un baño de agua a 37 °C durante un máximo de 2 minutos para descongelarlo rápidamente. Agite el vial en el baño hasta que esté parcialmente descongelado y contenga un pequeño trozo de hielo rodeado de líquido.
3. Transfiera los agregados celulares del criotubo a un tubo cónico de 15 ml utilizando una pipeta de 1000 μL. Agregue hasta 15 ml de medio hiPSC precalentado para diluir el dimetilsulfóxido (DMSO) en el medio de congelación.
4. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml a 200 x g durante 2 min.
5. Aspirar el sobrenadante y utilizar una pipeta de 5 ml para resuspender el pellet celular en medio hiPSC que contenga 20 μM de inhibidor de la serina/treonina quinasa de la proteína formadora de bobina asociada a Rho (ROCK-I, compuesto Y-27632) para evitar una mayor trituración de los agregados celulares.
6. Transfiera los agregados celulares a una placa de 10 cm recubierta de matriz de membrana basal utilizando una pipeta de 5 ml.
   NOTA: Si el protocolo se aplica de manera consistente, las células en un criotubo se pueden transferir a una sola placa de 10 cm.
7. Agite el plato para distribuir los agregados de manera uniforme.
8. Transfiera la placa a una incubadora y déjela sin perturbaciones durante la noche para permitir una adhesión celular adecuada.
9. Realizar un cambio completo del medio al día siguiente de la descongelación con 10 mL de medio hiPSC sin ROCK-I.

5. Diferenciación de hiPSC en células progenitoras neurales (NPC) de la médula espinal

1. Asegúrese de que las placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal estén listas para usar antes de comenzar la diferenciación.
2. Comience con iPSC que hayan sido pasadas al menos una vez y preferiblemente dos después de la descongelación y con al menos cuatro placas de 10 cm (ver explicación en el paso 5.11).
3. Realice los pasos iniciales como en los pasos 2.5-2.14 para el paso hiPSC.
4. Transfiera los agregados celulares de al menos dos placas de 10 cm a un tubo de 15 ml utilizando una pipeta de 5 ml.
5. Centrifugar a 200 x g durante 2 min.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 10 ml de medio hiPSC usando una pipeta de 10 ml, y luego centrifugar nuevamente a 200 x g durante 2 min para aflojar las adherencias de célula a célula en cada agregado.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 ml de medio hiPSC que contenga 20 μM ROCK-I utilizando una pipeta de 1000 μL.
8. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 μL para triturar los agregados celulares. Verifique el tamaño de los agregados bajo un microscopio periódicamente hasta que la mayoría de la suspensión celular comprenda células individuales o pequeños agregados de <10 células.
9. Cuente las células con un hemocitómetro (preferido) o un contador celular automatizado y calcule la densidad celular en la suspensión celular.
10. Placa 3.0 x 10 6 celdas en cada pocillo de una placa de⁶ pocillos pre-recubierta con matriz de membrana basal. Utilice una pipeta de 1000 μL para transferir la suspensión celular.
    NOTA: Si el protocolo se aplica de manera consistente, esto corresponde a una proporción de dos placas de 10 cm en un solo pocillo de un pocillo 6 / placa.
11. Repita los pasos 5.3-5.10 con un segundo lote de dos placas de 10 cm y coloque el producto final en un pozo recubierto de matriz de membrana basal de una segunda placa de 6 pocillos. Utilice una pipeta de 1000 μL para transferir la suspensión celular.
    NOTA: La finalización ideal del protocolo NPC de la médula espinal requiere dos pocillos iguales a cuatro placas de 10 cm. Para facilitar el flujo de trabajo, complete los pasos 5.3- 5.10 con dos lotes de dos placas, cada una con el producto final siendo dos placas separadas de 6 pocillos y cada una con un pozo que contiene 3.0 x 10⁶ celdas en él.
12. Mantener la monocapa de iPSC humana resultante en medio hiPSC que contenga 20 μM ROCK-I hasta que la confluencia alcance el >90%, normalmente al día siguiente, pero no más de 3 días después del recubrimiento inicial para evitar la diferenciación espontánea (incontrolada).
13. Si la diferenciación no puede iniciarse el día siguiente al recubrimiento celular, lavar las células una vez con PBS y cambiar el medio diariamente a un medio hiPSC fresco que contenga 20 μM ROCK-I. Si no confluye >90% dentro de los 3 días posteriores al recubrimiento, descarte las celdas y comience el protocolo de nuevo.
14. Una vez que se alcance la confluencia >90%, comience la diferenciación. Este es el día in vitro 1 (DIV1) del protocolo de diferenciación.
15. En DIV 1, deseche el medio hiPSC que contiene 20 μM ROCK-I y enjuague dos veces con PBS para eliminar el factor de crecimiento fetal (FGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) presentes en el medio de células madre.
16. Cambiar el medio a medio WiCell (Tabla 1) suplementado con 0,2 μM de LDN193189 (LDN) y 10 μM de SB431542 (SB) durante 48 h.
17. En DIV 3, lavar una vez con PBS y cambiar el medio a medio WiCell suplementado con LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + ácido retinoico (RA; 1μM) durante 48 h.
18. En DIV 5, lavar una vez con PBS y cambiar el medio a WiCell: Base del medio de inducción neural (NIM) (Tabla 1) (50%:50%, v/v) suplementado con LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + AR (1 μM) durante 48 h.
19. En DIV 7, realice el intercambio de medios con el mismo medio que en el paso 5.18.
20. En DIV 8, lavar una vez con PBS y cambiar el medio a WiCell:NIM base (50%:50%) suplementado con AR (1 μM) + puromorfamina (PMN) (1 μM) + Factor neurotrófico recombinante derivado del cerebro humano (BDNF) (10 ng/mL) + Ácido ascórbico (ASAC) (0,4 μg/mL) durante 48 h.
21. En DIV 10, lavar una vez con PBS y cambiar el medio a NIM base (100%) complementado como se menciona en el paso 5.20 durante 48 h.
22. En DIV 11 ó 12, cubrir un matraz de cultivo estéril de 25^cm2 con una matriz de membrana basal como preparación para el paso.
23. Aspire el medio de cada pocillo de la placa de 6 pocillos l y enjuague las células una vez con PBS.
24. Añadir 2 mL de tripsina al 0,05% a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 5-15 min; Agitar intermitentemente las placas puede ayudar en el desprendimiento celular.
25. Si las celdas aún no están en suspensión, separe mecánicamente expulsando los medios NIM de una punta de pipeta de 1000 μL sobre las celdas con un movimiento circular (asegúrese de cubrir toda la superficie) o raspando con un raspador celular (no preferido).
26. Transfiera las células de 2 pocillos a un tubo de 15 ml y agregue un inhibidor de tripsina en proporción adecuada a la cantidad de tripsina utilizada con una pipeta de 5 ml.
27. Centrifugar a 200 x g durante 2 min, aspirar el sobrenadante y luego volver a suspender con 10 ml de base NIM usando una pipeta de 10 ml.
28. Centrifugar de nuevo a 200 x g durante 2 min para aflojar las adherencias de célula a célula.
29. Después de la segunda etapa de centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 ml de medio NIM (100%) suplementado con AR (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / ml) + ASAC (0,4 μg / ml) y ROCK-I (20 μM). Con una punta de pipeta de 1000 μL, triturar las células hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces hasta obtener una suspensión turbia.
30. Volver a sembrar los agregados en este medio en el matraz de cultivo estéril recubierto de 25 cm 2 de matriz de membrana basal, de modo que el resultado final sea la combinación de las células de dos pocillos de una placa de 6 pocillos a un único matraz de cultivo estéril recubierto con matriz de membrana basal de 25 cm 2 (paso²:1). Utilice una pipeta de 1000 μL para transferir la suspensión celular.
    NOTA: Las celdas deben ser >90% confluentes en DIV 13, y no se necesitan más pasos hasta el día 14. Si las células no son confluentes, mantenga ROCK-I en los medios durante 1 o 2 días adicionales.
31. En DIV 14, cambie el medio a un medio NIM fresco + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0.4 μg/mL).
32. En DIV 15, cambie el medio a NIM: Medio de diferenciación neural (NDM) base (Tabla 1) (50%:50%) con AR (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/ml) + Suplemento B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + Neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) (10 ng/mL) + Factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) (10 ng/mL) + Factor neurotrófico ciliar (CNTF) (10 ng/mL). Cambie con medios nuevos cada dos días.
33. En DIV 21, cambie el medio a base NDM (100%) suplementado como en el paso 5.32, y cambie con medio fresco cada dos días.
34. En DIV 25-30, recoja el NPC y congélelo o páselo a una placa de 10 cm para la diferenciación terminal.
35. Enjuagar el matraz T-25 con PBS y añadir tripsina al 0,05%.
36. Incubar durante 5 min a 37 °C.
37. Enjuague la tripsina y las células con la base NDM y transfiérala a un tubo cónico de 15 ml. Añadir el inhibidor de tripsina en proporción adecuada a tripsina y centrifugar a 300 x g durante 5 min.
38. Resuspender el pellet celular con medio de diferenciación de neuronas motoras o astrocitos (Tabla 1) y utilizar una pipeta de 1000 μL para triturar hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de una sola célula (generalmente hasta 5 veces).
39. Contar las células y transferir a una placa de 10 cm recubierta como se describe en la sección 6, utilizando medios de diferenciación +Rock-I, para diferenciar hiPSC-MN y hiPSC-A.
40. Alternativamente, congele los cultivos resuspendiendo en un medio de congelación compuesto de 90% de medio NDM con factores de crecimiento (como en los pasos 5.32-5.33) y 10% de DMSO, triture de manera similar y luego transfiéralo a un criotubo. Alícuota 6 x 10⁶ NPC por criotubo.

6. Descongelación de las culturas de los NPC

1. Cubra las placas de 10 cm con poliornitina (PLO) y laminina el día anterior a la descongelación de las células.
   1. Añadir 5 ml de PLO diluido a 100 μg/ml en PBS o agua destilada (_dH2O) a las placas. Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1 h hasta toda la noche.
   2. Aspire la solución de PLO y enjuague las placas tres veces con PBS. (La OLP es tóxica si no se lava adecuadamente).
   3. Añadir laminina diluida en PBS a una concentración de 10 μg/ml a las placas recubiertas de PLO. Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1 h, preferiblemente durante la noche. Después de la incubación, aspire la solución de laminina sin enjuagar para mejorar la adhesión celular.
      NOTA: Las placas pueden recubrirse con PLO antes de tiempo, lavarse tres veces con agua, secarse en una campana estéril y almacenarse a 4 ° C.
2. Descongele un vial NPC (es decir, DIV 25 o 30) que contenga 6 x 10⁶ células/vial por cada placa de cultivo celular de 10 cm.
3. Retire el criotubo NPC del nitrógeno líquido y colóquelo inmediatamente en un baño maría a 37 °C durante un máximo de 2 minutos. Descongelar rápidamente agitando el vial hasta que quede un pequeño trozo de hielo rodeado de líquido.
4. Transfiera los agregados celulares a una cónica de 15 ml usando una pipeta de 1000 μL y agregue hasta 15 ml de NDM precalentado o suplemento Modified Eagles Medium (DMEM) / F21 F12 de Dulbecco para diluir el DMSO.
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
6. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet celular con astrocito o medio de diferenciación MN (Tabla 1) + ROCK-I (20 μM) y utilizar una pipeta de 1000 μL para triturar hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola célula (hasta 5 veces).
7. Transfiera la suspensión de una sola celda a una placa de 10 cm recubierta de plomo-laminina.
8. Transfiera la placa a una incubadora y déjela sin perturbaciones durante la noche para permitir una adhesión celular adecuada.

7. Diferenciar NPC de la médula espinal en neuronas motoras

1. Realice los pasos iniciales como se mencionó en los pasos 6.1-6.8, siendo el medio final el medio de diferenciación MN + ROCK-I (20 μM).
2. El día después del chapado, realice un intercambio completo del medio con el medio de diferenciación MN sin ROCK-I, y luego cambie el medio cada dos días. Durante el fin de semana, alimente a las células el viernes y luego nuevamente el lunes. Enjuague las celdas con PBS cuando sea necesario para eliminar los restos celulares.
3. Cambiar el medio con medio de diferenciación MN + arabinósido de citosina (ARA-C) (0,02 μM) e incubar durante 48 h cuando los progenitores comprometidos glial emergen como células planas proliferantes individuales bajo progenitores de MN postmitóticos agregados en grupos de células.
   NOTA: Por lo general, esto ocurre dentro de los primeros 7 días después de la placa inicial, aunque puede haber variabilidad dependiendo de la línea celular.
4. Después de 48 h, aspirar el medio que contiene ARA-C, enjuagar suavemente los cultivos con PBS tres veces y cambiar el medio a medio MN fresco sin ARA-C.
5. Después del tratamiento con ARA-C, realice intercambios de medios cada dos días (o lunes, miércoles y viernes) retirando el medio viejo con una pipeta manual en lugar de un aspirador de vacío para evitar el desprendimiento prematuro de los grupos neuronales. Además, enriquezca el medio MN con laminina 1 μg/ml una vez a la semana para mejorar aún más la unión neuronal a las placas de cultivo.

8. Diferenciar NPC en astrocitos de la médula espinal

1. Descongelar los cultivos NPC como en la sección 6, utilizando medio de diferenciación de astrocitos (Tabla 1) con la adición de suero fetal bovino (FBS) con un volumen para la concentración de volumen de 1% (NS + 1% FBS), así como ROCK-I (20 μM) para el recubrimiento.
   NOTA: El reemplazo de suero disponible comercialmente (Tabla 1) puede sustituirse por FBS utilizando los mismos factores de dilución.
2. El día después del recubrimiento, cambie el medio de cultivo con NS + 1% de medio FBS sin inhibidor de ROCK, y luego cambie el medio cada dos días. Durante los fines de semana, alimente a las células el viernes y luego nuevamente el lunes. Enjuague las celdas con PBS cuando sea necesario para eliminar los restos celulares. Si las células continúan muriendo, complemente los medios con ROCK-I (10 μM) para promover la supervivencia celular. Tenga cuidado de no usar ROCK-I con demasiada frecuencia o demasiado tiempo, dado el potencial de seleccionar células inmortales.
3. Permita que los astrocitos se vuelvan confluentes antes de pasarlos.
   NOTA: El tamaño de la celda aumentará con el tiempo, por lo que no hay un número establecido para el paso. La proporción típica de pases es de 1:2 o 1:3. En el caso de mala supervivencia o pasar a demasiadas placas, combine dos (o más, según sea necesario) placas de 10 cm en una placa de 10 cm para mantener la confluencia.
4. Para pasar cultivos progenitores de astrocitos, lavar las placas una vez con PBS (para eliminar FBS), incubar con tripsina al 0,05% durante 5 min, recoger las células en medio NS + 1% FBS (FBS inactivará tripsina), y luego centrifugar a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en medio NS + 1% FBS, y luego triturar a una suspensión de una sola célula. Distribuir células en NS + 1% FBS a nuevas placas de 10 cm.
   NOTA: Además de expandir los cultivos de astrocitos, el paso repetido de placas sirve para matar cualquier célula progenitora restante que haya elegido un destino neuronal. Por lo tanto, incluso si no hay una tasa mitótica muy alta, las placas pueden pasar en una proporción de 1: 1 si parece haber contaminación neuronal.
5. Cambie el recubrimiento en el curso de la diferenciación para mejorar el rendimiento de la siguiente manera.
   1. Coloque los cultivos NPC inicialmente descongelados y los primeros pasajes después del recubrimiento inicial en OLP/Laminina.
   2. Placa de los astrocitos inmaduros en placas recubiertas de matriz de membrana basal.
   3. Placa de astrocitos más maduros (es decir, después del día 90) en la matriz de la membrana basal, placas recubiertas de OLP / laminina (típicamente para cocultivo con neuronas) o en placas no recubiertas.
6. Congele los progenitores de astrocitos en cualquier momento durante el período de maduración de 60 días para sincronizar cultivos o guardarlos para experimentos posteriores. Al descongelar más allá de la etapa NPC, descongele los progenitores de astrocitos en las placas recubiertas de la matriz de la membrana basal en lugar de OLP / laminina.
7. En DIV 90 y posteriormente, cambie el medio de NS + 1% FBS a NS + 5% FBS para promover la supervivencia de los astrocitos y disminuir su proliferación.

9. Co-cultivo de MN y astrocitos de la médula espinal en placas de matriz de electrodos múltiples

1. Diferenciar y platear las neuronas motoras y los astrocitos cuando estén listos para ser utilizados el mismo día y envejecidos a DIV 60 para las neuronas motoras y DIV 90 para los astrocitos.
2. Cubra las placas MEA el día anterior o el día del recubrimiento de la siguiente manera si trabaja con placas de plástico de 24 pocillos (Tabla de materiales).
3. Diluir PLO en agua o PBS a 100 μg/mL.
   1. Agregue 15-20 μL a cada pocillo (dependiendo del nivel de comodidad de la pipeta), formando una gota en el centro del pozo que cubre el área de los electrodos y el área circundante, pero no la totalidad del pozo.
   2. Tenga cuidado de no dañar los electrodos con la punta de la pipeta. Sea consistente con el volumen de un pozo a otro para garantizar la cobertura de la misma área de superficie en cada pozo.
   3. Incubar PLO a 37 °C durante un mínimo de 1 h (preferiblemente 2 h).
      NOTA: Los volúmenes pequeños se secarán si no hay suficiente humedad en las placas. Agregue agua a los compartimentos que rodean los pozos para garantizar suficiente humedad durante el curso del recubrimiento y las grabaciones.
4. Aspire la mayor cantidad de PLO posible con una punta de micropipeta de plástico. Tenga cuidado de no tocar los electrodos. Lavar con 250 μL de agua tres veces. Si utiliza un aspirador de vacío para lavados, no permita que la punta se acerque a la matriz de electrodos. Después del tercer lavado, retire la mayor cantidad de agua posible, utilizando una punta de pipeta según sea necesario. Deje que la superficie se seque debajo de la campana de cultivo celular sin tapa.
5. Una vez que las superficies de la placa estén secas, agregue laminina diluida a 10 μg / ml en PBS. Utilice 15-20 μL para cubrir cada matriz de electrodos. Añadir agua a los compartimentos de humedad, volver a colocar la tapa y devolver la placa a una incubación a 37 °C durante un mínimo de 2 h hasta toda la noche.
6. El día del recubrimiento, enjuague los cultivos de MN y astrocitos una vez con PBS y agregue tripsina al 0,05% a 37 °C para levantar las células (5 min). Recoja en un tubo cónico de 15 ml que contenga inhibidor de tripsina y lave las placas con medio o base para asegurarse de que se recogen todas las células. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender con una pipeta de 1000 μL para generar 1 ml de suspensión de una sola célula. Al volver a suspender MN y astrocitos, cambiar al medio de cocultivo (Tabla 1), con la adición de 20 μM ROCK-I.
7. Contar el MN y los astrocitos en paralelo usando un hemocitómetro. Mientras cuenta y realiza cálculos, tape las suspensiones de celdas y colóquelas en una rejilla de espuma de poliestireno a 4 °C.
8. Calcular el volumen requerido para resuspender los cultivos a una concentración de 5 x 10 4 células por 5 μL para las neuronas motoras y 2,5 x 10⁴ células por 5 μL para los astrocitos. Centrifugar las suspensiones de celdas de 1 ml a 300 x g durante 5 min y volver a suspender en el volumen calculado.
9. Calcule el número de pozos deseados a sembrar y multiplíquelo por 5 μL de cada suspensión celular. Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en una proporción de 1: 1 y mezcle pipeteando hasta que se combinen completamente (generalmente dos veces), pero evite ser demasiado agresivo.
10. Retire la laminina de cada pocillo de la placa MEA con una punta de pipeta. Transfiera 10 μL de la suspensión celular combinada final a cada pocillo, formando una pequeña gota que cubre la matriz de electrodos para proporcionar una densidad celular de 5 x 10 4 MN y 2.5 x 10⁴ astrocitos por pocillo.
    NOTA: La alta densidad celular en la suspensión combinada requiere una resuspensión frecuente entre pocillos durante la etapa de siembra para garantizar recuentos celulares precisos y consistentes.
11. Devuelva las placas a la incubadora durante 20-30 minutos. Tenga cuidado de no perturbar la gota de la célula y permitir que las células formen uniones iniciales en las placas.
12. Después de 20-30 min, agregue medios de cocultivo calientes + ROCK-I a cada pocillo pipeteando 250 μL hacia abajo en la pared de cada pozo, seguido de 250 μL adicionales por la pared del mismo pozo en el lado opuesto. Devuelva la placa a la incubadora.
13. Examine las placas el día después de la siembra (Día 1 de cocultivo). Si hay restos celulares significativos o células muertas, intercambie el medio con un medio de cocultivo fresco que contenga ROCK-I. De lo contrario, cambie el medio el segundo día después de la siembra (Día de Co-Cultura 2) al medio de cocultivo sin ROCK-I. Realice intercambios medios-medios (aspirar al 50% y agregar el 60% del volumen final para tener en cuenta la evaporación) dos veces por semana.
14. Si se utilizan sistemas MEA con placas de vidrio de 30 mm de un solo pozo (Tabla de materiales), la preparación de la placa puede tardar 2 o más días. Siga los pasos a continuación para realizar esto.
15. Levante las células y los restos celulares de los cultivos MEA anteriores con tripsina al 0,05% durante 5-15 min.
16. Aspire tripsina y enjuague tres veces con agua.
17. Esterilizar añadiendo etanol al 70% e incubar en la campana durante 10 min. Aspirar el etanol, y luego enjuagar con agua tres veces.
18. Aplicar detergente aniónico al 1% con enzima proteasa en agua. Cubra las placas con una tapa y envuélvalas con película termoplástica y papel de aluminio, y luego déjelas en un balancín a temperatura ambiente durante la noche.
19. Aspire el detergente y luego enjuague tres veces con agua.
20. Si planea almacenar los platos, agregue un volumen suficiente de agua. Cubra las placas con una tapa y envuélvalas con película termoplástica y papel de aluminio, y déjelas en el refrigerador hasta el próximo uso.
21. Si planea recubrir, deje que la superficie se seque debajo de la campana de cultivo celular.
22. Si se necesita esterilización adicional (p. ej., infección previa o uso no reciente), solo en este punto, exponga las placas MEA a la luz ultravioleta (UV) debajo del capó durante 30-60 minutos.
    NOTA: Evitar la luz UV frecuente evitará daños a los electrodos. El uso de luz UV cuando las placas tienen suero dará como resultado electrodos no funcionales, por lo que solo debe usarse en placas limpias.
23. Cuando las placas estén completamente secas, proceda con la limpieza por plasma durante 1 minuto para cargar la superficie de vidrio de las placas MEA y mejorar la eficacia del recubrimiento. Limpie con plasma al menos una vez cada 4-5 ciclos de ciclos de limpieza de placas MEA.
    1. Como alternativa, cuando la limpieza con plasma no sea factible o no esté garantizada, agregue un volumen suficiente de medio que contenga FBS para cubrir la superficie de las placas MEA y devuélvalas a la incubadora durante la noche.
24. Utilice el recubrimiento OLP/Laminina como se describe anteriormente en la sección 6. Añadir solución de PLO (100 μg en PBS) inmediatamente después de limpiar o aspirar con plasma y enjuagar el medio que contiene FBS.
25. Placa las celdas como arriba en las siguientes densidades: 1 x 10 5 hiPSC-A / placa y 5 x 10⁵ hiPSC-MN/placa.

10. Grabación de matriz de electrodos múltiples

1. Extraiga los datos de voltaje sin procesar a una frecuencia de muestreo de 12,5 kHz, utilizando un filtro Butterworth con un filtro de paso alto de 200 Hz y un filtro de paso bajo de 3 kHz. Establezca el reconocimiento de picos como puntos de tiempo instantáneos de voltajes ≥6 desviaciones estándar de la línea de base. Identifique las ráfagas como una actividad con picos de >5 en 100 ms. Defina la actividad de la red cuando más del 35% del total de electrodos activos se disparan dentro de los 100 ms con un mínimo de 50 picos por ráfaga de red.
2. Comience a grabar tan pronto como sea posible después del Día 1 de Co-Cultura (CC).
   NOTA: La actividad eléctrica rara vez se notará antes del Día 3 de CC.
3. Cultivos paralelos en placas a densidades similares y réplicas en las placas de cultivo o cubreobjetos apropiados para ensayos bioquímicos, inmunocitoquímica (ICC) o qPCR.
4. Realice grabaciones con la temperatura ajustada a 37 °C y_CO2 al 5%. Transfiera las placas a la máquina y deje que se equilibren durante al menos 5 minutos antes de la grabación.
5. Registre la actividad de referencia cada dos días o semanalmente, durante 1-15 minutos dependiendo del diseño experimental. No grabe durante al menos 1 h después de un intercambio de medios, e idealmente espere 24 h después de cada intercambio de medios.
6. Para evitar la contaminación, cambie el medio (es decir, medio de intercambio de medio como en el paso 9.14) después de cualquier registro en el que la tapa de la placa estéril deba abrirse fuera de la campana estéril (es decir, la aplicación de compuestos farmacológicos). Realice intercambios completos de medios y lavados para lavar los medicamentos si las placas van a continuar usándose más allá del tratamiento farmacológico.
7. Para fines de análisis, use al menos tres réplicas técnicas y biológicas para cada condición. Expresar datos electrofisiológicos como medias de n ≥ 3 réplicas.

11. Ensayos farmacológicos en matriz de electrodos múltiples

1. Utilice una combinación diferente de cocultivos dependiendo de la pregunta experimental: neuronas de ELA con astrocitos de control, neuronas de control con astrocitos de ELA, neuronas de ELA y astrocitos, neuronas de control y astrocitos.
2. Al investigar los efectos electrofisiológicos transitorios de compuestos dirigidos a neuronas o astrocitos, registre la actividad basal durante un mínimo de 1 minuto con la tapa de la placa quitada pero la tapa de la máquina cerrada.
3. Abrir manualmente la tapa de la máquina sin detener el registro electrofisiológico e intercambiar 25 μL de medio con el vehículo farmacológico apropiado (generalmente medio fresco) utilizando una pipeta multicanal si se tratan múltiples pocillos. Cierre la tapa manualmente.
4. Registre durante 1 minuto adicional (o más si hay cambios significativos inducidos por el vehículo de los cuales el cultivo necesita recuperarse).
5. Abra manualmente la tapa de nuevo e intercambie 25 μL de medio con el fármaco de interés en el mismo vehículo. Cierre la tapa de la máquina y continúe grabando.
   NOTA: La duración del registro y el volumen del fármaco/vehículo administrado pueden variar o necesitar ser optimizados dependiendo de la pregunta experimental.
6. Para fines de análisis, asegúrese de que la adición del vehículo no provoque cambios significativos en los parámetros electrofisiológicos. Calcule los cambios porcentuales de la actividad después de la droga en comparación con después de la adición del vehículo y compare entre las condiciones.
7. Para investigar los efectos electrofisiológicos longitudinales, como los fármacos modificadores de la enfermedad candidatos, registre la actividad basal descrita en el paso 11.2. Para ello, utilice el medio de cocultivo que contiene el(los) medicamento(s) de interés en el vehículo apropiado o el medio que contiene el vehículo solamente.
8. Para fines de análisis, compare los registros de puntos de tiempo de ELA o cocultivos de control tratados longitudinalmente con fármacos entre sí y las condiciones de control.

Resultados

El protocolo de patrones de la médula espinal para la generación de hiPSC-MN y hiPSC-A de la médula espinal se describe en la Figura 1. En este protocolo, las hiPSC se mantienen y pasan como colonias no confluentes (Figura 2A). La neurogénesis se inicia (inducción neural) a través de la inhibición dual de SMAD mediante la adición de LDN193189 y SB431542, inactivando las vías de la proteína morfogenética ósea (BMP) y del factor de crecimiento transfor...

Discusión

Hasta la fecha, los métodos basados en hiPSC y MEA para registros electrofisiológicos de cocultivos astrocito-neurona han encontrado una aplicación limitada en el campo de ALS⁶ y aún no en plataformas completamente humanas, en contraste con su uso más generalizado para el modelado in vitro de la epilepsia⁹. Esta plataforma, sin embargo, tiene el potencial de abordar cuestiones fisiopatológicamente relevantes en la investigación de la ELA, como los mecanismos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp