Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Resumo

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Resumo

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) fornecem uma ferramenta poderosa para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ( ELA) in vitro. As gravações de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) são um meio de registrar potenciais de campo elétrico de grandes populações de neurônios e analisar a atividade da rede ao longo do tempo. Foi demonstrado anteriormente que a presença de hiPSC-A que são diferenciados usando técnicas para promover um fenótipo de astrócitos da medula espinhal melhorou a maturação e a atividade eletrofisiológica dos neurônios hiPSC-motores (MN) da medula espinhal regionalmente específicos quando comparados àqueles cultivados sem hiPSC-A ou na presença de astrócitos de roedores. Descrito aqui é um método para co-cultura de hiPSC-A da medula espinhal com hiPSC-MN e registrar a atividade eletrofisiológica usando registros de MEA. Embora os protocolos de diferenciação descritos aqui sejam específicos de astrócitos e neurônios que são regionalmente específicos da medula espinhal, a plataforma de co-cultura pode ser aplicada a astrócitos e neurônios diferenciados com técnicas específicas para outros destinos, incluindo hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Esses protocolos visam fornecer um ensaio eletrofisiológico para informar sobre as interações glia-neurônio e fornecer uma plataforma para testar drogas com potencial terapêutico na ELA.

Introdução

Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) são ferramentas poderosas para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) in vitro e fornecem um paradigma translacional para estratégias de descoberta de medicamentos¹. Pesquisadores demonstraram que a cocultura de hiPSC-A com hiPSC-N aumenta a maturação morfológica, molecular, eletrofisiológica e farmacológica de ambos os tipos celulares, gerando redes neuronais complexas e interações astrócitos-neurônios que se assemelham às suas contrapartes in vivo ^2,3. Experimentos de cocultura semelhantes podem recapitular características da patobiologia da ELA, como neurotoxicidade mediada por astrócitos ^4,5 e hiperexcitabilidade neuronal⁶. Além disso, com os avanços nos protocolos de diferenciação, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) podem ser diferenciadas em subtipos neurais regionalmente específicos, incluindo hiPSC-A cortical e medular e hiPSC-N ^7,8. Essas estratégias fornecem o potencial para modelar a patologia do neurônio motor cortical e espinhal na ELA, bem como a influência astrocítica em ambos. No entanto, isso requer que haja um ensaio funcional reprodutível para determinar esses efeitos.

Recentemente, demonstrou-se que o registro de multieletrodos (MEA) é particularmente adequado para a caracterização eletrofisiológica de coculturas neurônio-astrócitos². Ao contrário das análises eletrofisiológicas de célula única, essas matrizes de eletrodos de alta densidade registram passivamente os potenciais de campo extracelular de grandes populações de neurônios sem interromper as condições de cultura e preservar a integridade das membranas celulares. Essas plataformas são particularmente úteis para registrar a atividade celular e de rede das culturas ao longo do tempo e em resposta à manipulação farmacológica. Finalmente, quando a presença de astrócitos é uma variável de cultura, os registros de MEA podem fornecer insights funcionais sobre as interações bidirecionais astrócitos-neurônios ^2,9.

Apresenta-se aqui um protocolo otimizado para a diferenciação de hiPSC em hiPSC-A da medula espinhal e neurônios motores hiPSC (MN) previamente validado². O protocolo de diferenciação hiPSC-A da medula espinhal resulta consistentemente em culturas de astrócitos, que são positivas para a proteína B de ligação ao cálcio S100 (S100β), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e Homeobox B4 (HOXB4) em até 80%, 50% e 90% das células, respectivamente, indicando uma especificação de maturação da glial e da medula espinhal ^2,10 . O protocolo de diferenciação hiPSC-MN gera neurônios >90% positivos para a acetiltransferase de colina (ChAT), sugestivos de uma identidade de neurônio alfa-motor maduro². Além disso, o protocolo descreve técnicas para a geração de coculturas hiPSC-A/MN previamente demonstradas como resultando em neurônios com maior complexidade morfológica pela análise de Scholl e microscopia imunofluorescente quando comparadas a culturas neuronais sem astrócitos ou com astrócitos de roedores². Embora essas descrições sejam específicas para hiPSC-A e hiPSC-N da medula espinhal, uma vantagem única é que a cultura independente inicial de astrócitos e neurônios, seguida de etapas para co-cultura em momentos posteriores, pode ser traduzida para estudar os efeitos das interações neurônio-astrócitos de outras regiões específicas, bem como células específicas da doença ^7,8 . Finalmente, o protocolo descreve como cultivar essas culturas em placas MEA para que a atividade funcional como fator de composição da cocultura possa ser estudada ao longo do tempo com a capacidade de manipular a composição celular, bem como as condições de cultura.

O objetivo desses protocolos é fornecer um ensaio funcional para investigar as interações astrócitos-neurônios, examinar alterações específicas da doença e testar drogas com potencial terapêutico no campo da ELA. Instruções em vídeo são fornecidas para as etapas mais desafiadoras deste protocolo.

Protocolo

1. Preparação do meio de cultura celular

1. Preparar os meios de cultura celular individuais utilizando as composições mencionadas na Tabela 1.
2. Misture e filtre o meio estéril em frascos filtrados de 500 mL e armazene protegido da luz a 4 °C por até 2 semanas.

2. Manutenção e passagem de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos não confluentes (hiPSC)

1. Descongelar a matriz da membrana basal (armazenada em alíquotas a -80 °C) num frigorífico de 2-8 °C durante a noite.
2. Diluir a matriz da membrana basal a 1:100 (v/v) em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) ou no meio Eagles modificado (DMEM) da Dulbecco.
3. Adicionar matriz de membrana basal suficiente para revestir o fundo da placa de cultura de tecidos (5 mL para uma placa de 10 cm, 2 mL para poços individuais de placa de 6 poços) e incubar a 37 °C por um mínimo de 30 min durante a noite ou à temperatura ambiente por um mínimo de 1 h.
4. Aspirar a matriz de membrana basal diluída e lavar a placa uma vez com PBS antes de adicionar meios de cultura e células de semeadura.
5. Examine as placas diariamente para determinar e antecipar quando elas estão prontas para serem passadas. Placas de passagem de hiPSC uma vez que a maioria das colônias se tornaram suficientemente densas para que o centro das colônias exiba áreas brancas dispersas. Não permita que as placas amadureçam além deste ponto. Isso causará excesso de diferenciação, levando ao aparecimento de uma área amarela no centro das colônias devido à multicamadas celulares, à superabundância de células alongadas nas bordas, à compacidade frouxa dentro das colônias ou ao aumento da morte celular.
6. No dia da passagem, desenhe linhas de grade na superfície externa inferior das placas com um marcador para facilitar a cobertura precisa de toda a placa.
7. Desprenda colônias diferenciadas em um exaustor de cultura usando um microscópio de contraste de fase (ampliação de 10x) raspando manualmente com uma ponta de pipeta de 200 μL.
8. Enxaguar as placas duas vezes com PBS (5 mL por lavagem para placas de 10 cm).
9. Adicionar 5 mL de protease de dissociação tecidual pré-aquecida (Tabela de Materiais) e incubar as células a 37 °C até que as bordas das colônias comecem a arredondar (4-7 min), mas antes que as colônias se levantem da placa.
10. Aspirar cuidadosamente a protease de dissociação. Lave suavemente a placa duas vezes com PBS, tomando cuidado para não desalojar as colônias.
11. Adicionar 5 mL de meio hiPSC pré-aquecido (Tabela 1) à placa de cultura.
12. Levante as colônias enquanto as divide em agregados celulares menores, arranhando toda a placa com a ponta de uma pipeta de 5 mL usando um movimento de ida e volta de cima para baixo.
13. Gire a placa 90° e repita o passo acima.
14. Triturar os agregados celulares suavemente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 5 mL e verificar o tamanho dos agregados periodicamente sob um microscópio até que a maioria dos agregados celulares sejam aproximadamente 50-100 células.
15. Semeia os agregados celulares nas placas de matriz de membrana basal pré-revestidas, usando um meio hiPSC adicional para lavar a placa original. Coletar e transferir a maioria dos agregados celulares para as novas placas usando uma pipeta de 5 mL.
    NOTA: Se o protocolo for aplicado de forma consistente, a placa original deve conter colônias de iPSC cobrindo aproximadamente 50% da superfície de cultura antes da passagem. Neste caso, a razão de divisão deve ser de uma placa para cinco novas placas. No entanto, isso pode precisar ser ajustado dependendo das condições de crescimento e das taxas de crescimento específicas da linhagem celular.
16. Agite as placas recém-semeadas para frente e para trás para distribuir os agregados uniformemente.
17. Transfira as placas para uma incubadora (37 °C e 5% de CO₂) e deixe-as intactas durante a noite para permitir a adesão celular adequada.
18. Realizar uma troca completa do meio todos os dias com 10 mL de meio hiPSC. Se houver excesso de detritos celulares no dia seguinte à passagem, lave uma vez com 5 mL do meio antes da mudança da mídia.
19. Planeje a passagem em seguida quando as áreas brancas aparecerem no centro da maioria das colônias de iPSC (etapa 2.5). Isso ocorrerá 4-6 dias após cada passagem.

3. Congelamento hiPSC

1. Execute as etapas iniciais como nas etapas 2.5-2.14 para a passagem do hiPSC.
2. Recolher os agregados celulares num tubo de 15 ml e girar a 200 x g durante 2 min.
3. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em meio de congelamento e transferir para criotubos usando uma pipeta de 5 mL.
   NOTA: Semelhante aos passos de passagem, a razão de divisão usual é de uma placa iPSC para cinco criotubos, dependendo da densidade das colônias. Use um volume total de 1 mL de meio de congelamento para cada criotubo.
4. Coloque os criotubos num recipiente de criopreservação refrigerado e transfira-o para -80 °C durante a noite.
5. Transfira as células para nitrogênio líquido após 24 h.

4. Descongelamento do hiPSC

1. Revestir uma placa de 10 cm com a matriz da membrana basal (ver 2.1-2.3).
2. Remova um criotubo iPSC do azoto líquido e coloque-o imediatamente num banho-maria a 37 °C até 2 minutos para descongelar rapidamente. Agite o frasco para injetáveis no banho até que esteja parcialmente descongelado e contenha um pequeno pedaço de gelo rodeado por líquido.
3. Transfira os agregados celulares do criotubo para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta de 1000 μL. Adicionar até 15 mL de meio hiPSC pré-aquecido para diluir o dimetilsulfóxido (DMSO) no meio de congelamento.
4. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 200 x g por 2 min.
5. Aspirar o sobrenadante e utilizar uma pipeta de 5 ml para ressuspender o pellet celular em meio hiPSC contendo 20 μM de proteína serina/trionina quinase de proteína formadora de bobina enrolada associada a Rho (ROCK-I, composto Y-27632) para evitar uma maior trituração de agregados celulares.
6. Transfira os agregados celulares para uma placa de 10 cm revestida com matriz de membrana basal usando uma pipeta de 5 mL.
   NOTA: Se o protocolo for aplicado de forma consistente, as células em um criotubo podem ser transferidas para uma única placa de 10 cm.
7. Agite a placa para distribuir uniformemente os agregados.
8. Transfira a placa para uma incubadora e deixe-a intacta durante a noite para permitir a adesão celular adequada.
9. Realizar uma troca completa do meio no dia seguinte ao descongelamento com 10 mL de meio hiPSC sem ROCK-I.

5. Diferenciando o hiPSC em células progenitoras neurais da medula espinhal (NPC)

1. Certifique-se de que as placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal estejam prontas para uso antes de iniciar a diferenciação.
2. Comece com iPSC que tenham sido passadas pelo menos uma vez e, de preferência, duas vezes após o descongelamento e com pelo menos quatro placas de 10 cm (ver explicação no passo 5.11).
3. Execute as etapas iniciais como nas etapas 2.5-2.14 para a passagem hiPSC.
4. Transfira os agregados celulares de pelo menos duas placas de 10 cm para um tubo de 15 mL usando uma pipeta de 5 mL.
5. Centrífuga a 200 x g durante 2 min.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular com 10 mL de meio hiPSC usando uma pipeta de 10 mL e, em seguida, centrifugar novamente a 200 x g por 2 min para soltar as aderências célula-a-célula em cada agregado.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio hiPSC contendo 20 μM ROCK-I usando uma pipeta de 1000 μL.
8. Pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 μL para triturar os agregados celulares. Verifique o tamanho dos agregados ao microscópio periodicamente até que a maioria da suspensão celular seja composta por células únicas ou pequenos agregados de células <10.
9. Conte as células com um hemocitômetro (de preferência) ou um contador de células automatizado e calcule a densidade celular na suspensão celular.
10. Placa 3,0 x 10 6 células em cada poço de uma placa de⁶ poços pré-revestida com matriz de membrana basal. Use uma pipeta de 1000 μL para transferir a suspensão celular.
    NOTA: Se o protocolo for aplicado de forma consistente, isso corresponde a uma proporção de duas placas de 10 cm em um único poço de um poço de 6 poços/placa.
11. Repita as etapas 5.3-5.10 com um segundo lote de duas placas de 10 cm e pratique o produto final em uma matriz de membrana basal revestida bem de uma segunda placa de 6 poços. Use uma pipeta de 1000 μL para transferir a suspensão celular.
    NOTA: A conclusão ideal do protocolo NPC da medula espinhal requer dois poços iguais a quatro placas de 10 cm. Para facilitar o fluxo de trabalho, conclua as etapas 5.3 - 5.10 com dois lotes de duas placas, cada uma com o produto final sendo duas placas separadas de 6 poços e cada uma com um poço contendo 3,0 x 10⁶ células nele.
12. Manter a monocamada de iPSC humana resultante em meio hiPSC contendo 20 μM de ROCK-I até que a confluência atinja >90%, tipicamente no dia seguinte, mas não mais de 3 dias após o revestimento inicial para evitar a diferenciação espontânea (não controlada).
13. Se a diferenciação não puder ser iniciada no dia seguinte ao revestimento celular, lave as células uma vez com PBS e mude o meio diariamente para um meio de hiPSC fresco contendo 20 μM ROCK-I. Se não confluir >90% dentro de 3 dias após o revestimento, descarte as células e inicie o protocolo novamente.
14. Uma vez que >90% de confluência é atingida, inicie a diferenciação. Este é o dia in vitro 1 (DIV1) do protocolo de diferenciação.
15. Na DIV 1, descarte o meio hiPSC contendo 20 μM de ROCK-I e enxágue duas vezes com PBS para remover o fator de crescimento fetal (FGF) e o fator de crescimento transformador beta (TGFβ) presentes no meio de células-tronco.
16. Alterar o meio para o meio WiCell (Tabela 1) suplementado com 0,2 μM de LDN193189 (LDN) e 10 μM de SB431542 (SB) por 48 h.
17. Na DIV 3, lavar uma vez com PBS e trocar o meio para meio WiCell suplementado com LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + Ácido Retinóico (AR; 1μM) por 48 h.
18. Na DIV 5, lavar uma vez com PBS e mudar o meio para WiCell: Base do meio de indução neural (NIM) (Tabela 1) (50%:50%, v/v) suplementado com LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) por 48 h.
19. Na DIV 7, execute a troca média com o mesmo meio que na etapa 5.18.
20. Na DIV 8, lave uma vez com PBS e mude o meio para WiCell:NIM base (50%:50%) suplementada com AR (1 μM) + puromoramina (PMN) (1 μM) + Fator neurotrófico recombinante derivado do cérebro humano (BDNF) (10 ng/mL) + Ácido ascórbico (ASAC) (0,4 μg/mL) por 48 h.
21. Na DIV 10, lavar uma vez com PBS e mudar o meio para a base NIM (100%) suplementado conforme mencionado na etapa 5.20 por 48 h.
22. No DIV 11 ou 12, revestir um balão de cultura estéril^{de 25 cm 2} com matriz de membrana basal em preparação para a passagem.
23. Aspirar o meio de cada poço da placa de 6 poços l e enxaguar as células uma vez com PBS.
24. Adicionar 2 mL de tripsina a 0,05% a cada poço e incubar a 37 °C por 5-15 min; agitar intermitentemente as placas pode ajudar no descolamento celular.
25. Se as células ainda não estiverem em suspensão, desprenda mecanicamente ejetando o meio NIM de uma ponta de pipeta de 1000 μL para as células com um movimento circular (certifique-se de cobrir toda a superfície) ou raspando com um raspador de células (não preferido).
26. Transfira as células de 2 poços para um tubo de 15 mL e adicione o inibidor de tripsina na proporção apropriada à quantidade de tripsina usada usando uma pipeta de 5 mL.
27. Centrifugar a 200 x g por 2 min, aspirar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender com 10 mL de base NIM usando uma pipeta de 10 mL.
28. Centrifugar novamente a 200 x g durante 2 minutos para soltar as aderências célula-a-célula.
29. Após a segunda etapa de centrifugação, remova o sobrenadante e ressuscite o pellet com 1 mL de meio NIM (100%) suplementado com AR (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL) e ROCK-I (20 μM). Usando uma ponta de pipeta de 1000 μL, triture as células para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes até que uma suspensão turva seja obtida.
30. Re-semear os agregados neste meio para a matriz de membrana basal revestida 25 cm 2 frasco de cultura estéril de modo que o resultado final seja a combinação das células de dois poços de uma placa de 6 poços para uma única membrana basal revestida com matriz de 25 cm 2 frasco de cultura estéril (passagem²:1). Use uma pipeta de 1000 μL para transferir a suspensão celular.
    NOTA: As células devem ser >90% confluentes na DIV 13 e não são necessárias mais etapas até o dia 14. Se as células não forem confluentes, mantenha o ROCK-I na mídia por mais 1 ou 2 dias.
31. Na DIV 14, mude o meio para o meio NIM fresco + AR (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL).
32. Na DIV 15, altere o meio para NIM: Base do meio de diferenciação neural (NDM) (Tabela 1) (50%:50%) com AR (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/mL) + Suplemento B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + Neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) (10 ng/mL) + Fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) (10 ng/mL) + Fator neurotrófico ciliar (CNTF) (10 ng/mL). Mude com a mídia fresca a cada dois dias.
33. Na DIV 21, altere o meio para a base NDM (100%) suplementado como na etapa 5.32 e mude com o meio fresco a cada dois dias.
34. No DIV 25-30, colete o NPC e congele-o ou passe-o para uma placa de 10 cm para diferenciação terminal.
35. Enxaguar o balão de T-25 com PBS e adicionar tripsina a 0,05%.
36. Incubar durante 5 min a 37 °C.
37. Enxaguar a tripsina e as células com a base NDM e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar o inibidor de tripsina na proporção apropriada à tripsina e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
38. Ressuscite o pellet celular com neurônio motor ou meio de diferenciação de astrócitos (Tabela 1) e use uma pipeta de 1000 μL para triturar para cima e para baixo para obter uma única suspensão celular (geralmente até 5 vezes).
39. Contar as células e transferir para uma placa de 10 cm revestida conforme descrito na secção 6, utilizando qualquer meio de diferenciação +Rock-I, para diferenciar hiPSC-MN e hiPSC-A.
40. Alternativamente, congelar as culturas ressuspendendo em um meio de congelamento composto por 90% de meio NDM com fatores de crescimento (como nas etapas 5,32-5,33) e 10% de DMSO, triturar de forma semelhante e, em seguida, transferir para um criotubo. Alíquota 6 x 10⁶ NPC por criotubo.

6. Descongelamento de culturas NPC

1. Revestir placas de 10 cm com poliornitina (OLP) e laminina no dia anterior ao descongelamento das células.
   1. Adicionar 5 mL de OLP diluído a 100 μg/mL em PBS ou água destilada (dH₂O) às placas. Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1 h até durante a noite.
   2. Aspirar a solução PLO e enxaguar as placas três vezes com PBS. (A OLP é tóxica se não for devidamente lavada.)
   3. Adicionar laminina diluída em PBS a uma concentração de 10 μg/mL às placas revestidas de OLP. Incubar a 37 °C durante um mínimo de 1 h, de preferência durante a noite. Após a incubação, aspirar a solução de laminina sem enxaguar para melhorar a adesão celular.
      NOTA: As placas podem ser revestidas com OLP antes do tempo, lavadas três vezes com água, secas em um exaustor estéril e armazenadas a 4 °C.
2. Descongele um frasco para injetáveis de NPC (ou seja, DIV 25 ou 30) contendo 6 x 10⁶ células/frasco para cada placa de cultura celular de 10 cm.
3. Retire o criotubo NPC do azoto líquido e coloque imediatamente em banho-maria a 37 °C até 2 min. Descongele rapidamente agitando o frasco para injetáveis até que haja um pequeno pedaço de gelo rodeado por líquido.
4. Transfira agregados celulares para um cônico de 15 mL usando uma pipeta de 1000 μL e adicione até 15 mL de NDM pré-aquecido ou Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 supplement para diluir o DMSO.
5. Centrífuga a 300 x g durante 5 min.
6. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular com astrócitos ou meio de diferenciação MN (Tabela 1) + ROCK-I (20 μM) e utilizar uma pipeta de 1000 μL para triturar para cima e para baixo até obter uma única suspensão celular (até 5 vezes).
7. Transfira a suspensão de célula única para uma placa de 10 cm revestida de PLO-Laminina.
8. Transfira a placa para uma incubadora e deixe-a intacta durante a noite para permitir a adesão celular adequada.

7. Diferenciando NPC da medula espinhal em neurônios motores

1. Execute as etapas iniciais, conforme mencionado nas etapas 6.1-6.8, sendo o meio final o meio de diferenciação MN + ROCK-I (20 μM).
2. No dia seguinte ao chapeamento, realize uma troca completa do meio com o meio de diferenciação MN sem ROCK-I e, em seguida, troque o meio a cada dois dias. No fim de semana, alimente as células na sexta-feira e depois novamente na segunda-feira. Lave as células com PBS quando necessário para remover os detritos celulares.
3. Alterar o meio com meio de diferenciação MN + arabinosídeo de citosina (ARA-C) (0,02 μM) e incubar por 48 h quando progenitores gliais comprometidos emergem como células planas de proliferação única sob progenitores de MN pós-mitóticos agregados em aglomerados celulares.
   NOTA: Normalmente, isso ocorre nos primeiros 7 dias após o revestimento inicial, embora possa haver variabilidade dependendo da linhagem celular.
4. Após 48 h, aspirar o meio contendo ARA-C, enxaguar as culturas suavemente com PBS três vezes e trocar o meio para meio MN fresco sem ARA-C.
5. Após o tratamento com ARA-C, realize trocas médias a cada dois dias (ou segunda, quarta e sexta-feira), removendo o meio antigo com uma pipeta manual em vez de um aspirador a vácuo para evitar o descolamento prematuro dos aglomerados neuronais. Além disso, enriqueça o meio MN com laminina 1 μg/mL uma vez por semana para aumentar ainda mais a ligação neuronal às placas de cultura.

8. Diferenciando NPC em astrócitos da medula espinhal

1. Descongelar as culturas de NPC como na seção 6, utilizando o Meio de Diferenciação de Astrócitos (Tabela 1) com a adição de soro fetal bovino (FBS) com um volume para concentração volumétrica de 1% (NS + 1% FBS), bem como ROCK-I (20 μM) para chapeamento.
   NOTA: A substituição de soro comercialmente disponível (Tabela 1) pode ser substituída por FBS usando os mesmos fatores de diluição.
2. No dia seguinte ao plaqueamento, trocar o meio de cultura com NS + meio FBS a 1% sem inibidor de ROCK e, em seguida, trocar o meio em dias alternados. Nos fins de semana, alimente as células na sexta-feira e depois novamente na segunda-feira. Lave as células com PBS quando necessário para remover os detritos celulares. Se as células continuarem a morrer, suplemente a mídia com ROCK-I (10 μM) para promover a sobrevivência celular. Seja cauteloso para não usar o ROCK-I com muita frequência ou por muito tempo, dado o potencial de selecionar células imortais.
3. Permita que os astrócitos se tornem confluentes antes de passá-los.
   Observação : O tamanho da célula aumentará com o tempo, portanto, não há um número definido para a passagem. A proporção típica de passagem é de 1:2 ou 1:3. No caso de má sobrevivência ou passagem para muitas placas, combine duas (ou mais, conforme necessário) placas de 10 cm a uma placa de 10 cm para manter a confluência.
4. Para passar culturas de progenitores de astrócitos, lavar as placas uma vez com PBS (para remover FBS), incubar com tripsina a 0,05% por 5 min, coletar as células em meio NS + FBS a 1% (FBS inativará a tripsina) e, em seguida, centrifugar a 300 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante, ressuspender as células em meio NS + 1% FBS e, em seguida, triturar para uma suspensão de célula única. Distribuir células em NS + 1% FBS para novas placas de 10 cm.
   NOTA: Além de expandir as culturas de astrócitos, a passagem repetida de placas serve ao propósito de matar quaisquer células progenitoras remanescentes que tenham escolhido um destino neuronal. Portanto, mesmo que não haja uma taxa mitótica muito alta, as placas podem ser passadas em uma proporção de 1: 1 se parecer haver contaminação neuronal.
5. Mude o revestimento ao longo da diferenciação para aumentar o rendimento da seguinte forma.
   1. Chapear as culturas de NPC inicialmente descongeladas e as primeiras passagens após o revestimento inicial na OLP/Laminina.
   2. Chapear os astrócitos imaturos em placas revestidas de matriz de membrana basal.
   3. Astrócitos mais maduros em placas (isto é, após o dia 90) em qualquer matriz de membrana basal, placas revestidas de OLP/Laminina (tipicamente para co-cultura com neurônios) ou em placas não revestidas.
6. Congele os progenitores de astrócitos a qualquer momento durante o período de maturação de 60 dias para sincronizar culturas ou salvar para experimentos posteriores. Ao descongelar além do estágio NPC, descongele os progenitores de astrócitos nas placas revestidas da matriz da membrana basal, em vez de PLO / Laminina.
7. Na DIV 90 e posteriormente, mude o meio de NS + 1% FBS para NS + 5% FBS para promover a sobrevivência dos astrócitos e diminuir sua proliferação.

9. Co-cultura de MN e astrócitos da medula espinhal em placas de matriz de múltiplos eletrodos

1. Diferenciar e chapear os neurônios motores e astrócitos quando eles estiverem prontos para serem usados no mesmo dia e envelhecidos até DIV 60 para os neurônios motores e DIV 90 para os astrócitos.
2. Revestir as placas MEA no dia anterior ou no dia do chapeamento da seguinte forma, se trabalhar com placas de plástico de 24 poços (Tabela de Materiais).
3. Diluir a OLP em água ou PBS a 100 μg/mL.
   1. Adicione 15-20 μL a cada poço (dependendo do nível de conforto da pipeta), formando uma gota no centro do poço cobrindo a área dos eletrodos e a área circundante, mas não a totalidade do poço.
   2. Tome cuidado para não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Seja consistente com o volume de poço para poço para garantir a cobertura da mesma área de superfície em cada poço.
   3. Incubar a OLP a 37 °C durante um período mínimo de 1 h (de preferência 2 h).
      NOTA: Os pequenos volumes secarão se não houver umidade suficiente nas placas. Adicione água aos compartimentos ao redor dos poços para garantir umidade suficiente durante todo o curso do revestimento e das gravações.
4. Aspirar o máximo de PLO possível usando uma ponta de micropipeta de plástico. Tome cuidado para não tocar nos eletrodos. Lave com 250 μL de água três vezes. Se estiver usando um aspirador a vácuo para lavagens, não permita a ponta perto da matriz de eletrodos. Após a terceira lavagem, retire o máximo de água possível, usando uma ponta de pipeta, conforme necessário. Deixe a superfície secar sob o exaustor de cultura celular com a tampa removida.
5. Quando as superfícies das placas estiverem secas, adicione a laminina diluída a 10 μg/mL em PBS. Use 15-20 μL para cobrir cada matriz de eletrodos. Adicione água aos compartimentos de umidade, substitua a tampa e devolva a placa à incubação de 37 °C por um período mínimo de 2 h até a noite.
6. No dia do plaqueamento, enxaguar as culturas de MN e astrócitos uma vez com PBS e adicionar tripsina a 0,05% a 37 °C para levantar as células (5 min). Recolher num tubo cónico de 15 ml contendo inibidor de tripsina e lavar as placas com meio ou base para garantir que todas as células são recolhidas. Centrifugar a 300 x g por 5 min e ressuspender com uma pipeta de 1000 μL para gerar 1 mL de suspensão de uma única célula. Ao ressuspender MN e astrócitos, mude para o meio de co-cultura (Tabela 1), com a adição de 20 μM ROCK-I.
7. Conte o MN e os astrócitos em paralelo usando um hemocitômetro. Ao contar e fazer cálculos, tampe as suspensões celulares e coloque-as em um rack de isopor a 4 °C.
8. Calcular o volume necessário para ressuspender as culturas para uma concentração de 5 x 10 4 células por 5 μL para os neurónios motores e de 2,5 x 10⁴ células por 5 μL para os astrócitos. Centrifugar as suspensões celulares de 1 mL a 300 x g por 5 min e ressuspender no volume calculado.
9. Calcule o número de poços desejados a serem semeados e multiplique-o por 5 μL de cada suspensão celular. Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos em uma proporção de 1:1 e misture pipetando até combinar completamente (geralmente duas vezes), mas evite ser muito agressivo.
10. Remova a laminina de cada poço da placa MEA usando uma ponta de pipeta. Transfira 10 μL da suspensão celular combinada final para cada poço, formando uma pequena gotícula cobrindo a matriz de eletrodos para fornecer uma densidade celular de 5 x 10 4 MN e 2,5 x 10⁴ astrócitos por poço.
    NOTA: A alta densidade celular na suspensão combinada requer ressuspensão frequente entre os poços durante a etapa de semeadura para garantir contagens de células precisas e consistentes.
11. Devolva as placas à incubadora por 20-30 min. Tome cuidado para não perturbar a gota celular e permitir que as células formem anexos iniciais nas placas.
12. Após 20-30 min, adicione meios de co-cultura quentes + ROCK-I a cada poço pipetando 250 μL na parede de cada poço, seguido por um adicional de 250 μL na parede do mesmo poço no lado oposto. Devolva a placa à incubadora.
13. Examine as placas no dia seguinte à semeadura (Dia 1 de Cocultura). Se houver detritos celulares significativos ou células mortas, troque o meio por um meio de co-cultura fresco contendo ROCK-I. Caso contrário, mude o meio no segundo dia após a semeadura (Dia da Co-Cultura 2) para o meio de co-cultura sem ROCK-I. Realizar trocas de meio meio médio (aspirar 50% e adicionar 60% do volume final para contabilizar a evaporação) duas vezes por semana.
14. Se estiver usando sistemas MEA com placas de vidro de 30 mm de poço único (Tabela de Materiais), a preparação da placa pode levar 2 ou mais dias. Siga as etapas abaixo para executar isso.
15. Levante as células e os detritos celulares das culturas anteriores de MEA com tripsina a 0,05% por 5-15 min.
16. Aspirar tripsina e enxaguar três vezes com água.
17. Esterilizar adicionando etanol a 70% e incubar no exaustor por 10 min. Aspirar o etanol e, em seguida, enxaguar com água três vezes.
18. Aplicar detergente aniónico a 1% com enzima protease em água. Cubra as placas com uma tampa e envolva com filme termoplástico e papel alumínio, e depois deixe-as em um balancim à temperatura ambiente durante a noite.
19. Aspirar o detergente e, em seguida, enxaguar três vezes com água.
20. Se estiver planejando armazenar as placas, adicione um volume suficiente de água. Cubra as placas com tampa e envolva-as com filme termoplástico e papel alumínio, e deixe-as na geladeira até o próximo uso.
21. Se estiver planejando revestir, deixe a superfície secar sob o capuz de cultura de células.
22. Se for necessária esterilização extra (por exemplo, infecção prévia ou uso não recente), somente neste momento, exponha as placas MEA à luz ultravioleta (UV) sob o capô por 30 a 60 min.
    NOTA: Evitar a luz UV frequente evitará danos aos eletrodos. O uso de luz UV quando as placas têm soro sobre elas resultará em eletrodos não funcionais, razão pela qual ela só deve ser usada em placas limpas.
23. Quando as placas estiverem completamente secas, prossiga com a limpeza a plasma por 1 minuto para carregar a superfície de vidro das placas MEA e aumentar a eficácia do revestimento. Limpe a plasma pelo menos uma vez a cada 4-5 ciclos de ciclos de limpeza de placas MEA.
    1. Como alternativa, quando a limpeza a plasma não for viável ou não for justificada, adicione um volume suficiente de meio contendo FBS para cobrir a superfície das placas MEA e devolvê-las à incubadora durante a noite.
24. Utilizar o revestimento PLO/Laminina conforme descrito acima na secção 6. Adicionar solução de OLP (100 μg em PBS) imediatamente após a limpeza ou aspiração de plasma e enxaguar o meio contendo FBS.
25. Chapear as células como acima nas seguintes densidades: 1 x 10 5 hiPSC-A / placa e 5 x 10⁵ hiPSC-MN/placa.

10. Gravação de matriz multi-eletrodo

1. Extraia os dados de tensão bruta a uma frequência de amostragem de 12,5 kHz, usando um filtro Butterworth com um filtro passa-alta de 200 Hz e um filtro passa-baixas de 3 kHz. Defina o reconhecimento de pico como pontos de tempo instantâneos de tensões ≥6 desvios padrão da linha de base. Identifique explosões como uma atividade com picos de >5 em 100 ms. Defina a atividade da rede quando mais de 35% do total de eletrodos ativos dispararem dentro de 100 ms com um mínimo de 50 picos por explosão de rede.
2. Comece a gravar o mais rápido possível após o Dia 1 da Co-Cultura (CC).
   NOTA: A atividade elétrica raramente será observada antes do Dia 3 do CC.
3. Culturas paralelas em placas em densidades semelhantes e replicações nas placas de cultura apropriadas ou coberturas para ensaios bioquímicos, imunocitoquímica (ICC) ou qPCR.
4. Realizar gravações com a temperatura ajustada para 37 °C ad CO₂ a 5%. Transfira as placas para a máquina e deixe-as se equilibrar por pelo menos 5 minutos antes da gravação.
5. Registre a atividade de linha de base a cada dois dias ou semanalmente, durante 1-15 minutos, dependendo do desenho experimental. Não grave por pelo menos 1 h após uma troca média e, idealmente, aguarde 24 horas após cada troca de mídia.
6. Para evitar a contaminação, troque o meio (ou seja, meia troca média como na etapa 9.14) após qualquer registro em que a tampa da placa estéril tenha que ser aberta fora do exaustor estéril (ou seja, a aplicação de compostos de drogas). Realize trocas médias completas e lavagens para lavar os medicamentos se as placas continuarem a ser usadas além do tratamento medicamentoso.
7. Para fins de análise, use pelo menos três replicações técnicas e biológicas para cada condição. Expresse dados eletrofisiológicos como meio de n ≥ 3 replicações.

11. Ensaios farmacológicos em matriz de múltiplos eléctrodos

1. Use uma combinação diferente de co-culturas, dependendo da questão experimental: neurônios ALS com astrócitos controle, neurônios controle com astrócitos ALS, neurônios ALS e astrócitos, neurônios controle e astrócitos.
2. Ao investigar os efeitos eletrofisiológicos transitórios de compostos direcionados a neurônios ou astrócitos, registre a atividade basal por um período mínimo de 1 minuto com a tampa da placa removida, mas a tampa da máquina fechada.
3. Abra manualmente a tampa da máquina sem interromper o registro eletrofisiológico e troque 25 μL de meio com o veículo de droga apropriado (geralmente meio fresco) usando uma pipeta multicanal se tratar vários poços. Feche a tampa manualmente.
4. Registre por mais 1 min (ou mais, se houver mudanças significativas induzidas pelo veículo das quais a cultura precisa se recuperar).
5. Abra manualmente a tampa novamente e troque 25 μL de meio com a droga de interesse no mesmo veículo. Feche a tampa da máquina e continue a gravar.
   NOTA: A duração do registro e o volume do medicamento/veículo administrado podem variar ou precisam ser otimizados dependendo da questão experimental.
6. Para efeitos de análise, certifique-se de que a adição do veículo não provoca alterações significativas nos parâmetros eletrofisiológicos. Calcular as mudanças percentuais da atividade após a droga em comparação com após a adição do veículo e comparar entre as condições.
7. Para investigar os efeitos eletrofisiológicos longitudinais, como candidatos a drogas modificadoras da doença, registre a atividade basal descrita na etapa 11.2. Para tal, utilizar o meio de co-cultura que contém o(s) medicamento(s) de interesse no veículo adequado ou o meio que contém apenas o veículo.
8. Para fins de análise, comparar os registros de ponto de tempo da ELA ou coculturas de controle tratadas longitudinalmente com drogas entre si e condições de controle.

Resultados

O protocolo de padronização da medula espinhal para a geração de hiPSC-MN e hiPSC-A da medula espinhal está descrito na Figura 1. Nesse protocolo, as hiPSCs são mantidas e passadas como colônias não confluentes (Figura 2A). A neurogênese é iniciada (indução neural) através da inibição dupla do SMAD pela adição de LDN193189 e SB431542, inativando as vias da proteína morfogenética óssea (BMP) e do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β...

Discussão

Até o momento, métodos baseados em hiPSC e MEA para registros eletrofisiológicos de coculturas de astrócitos-neurônios encontraram aplicação limitada no campo da ELA⁶ e ainda não em plataformas totalmente humanas, em contraste com seu uso mais difundido para modelagem in vitro da epilepsia⁹. Esta plataforma, no entanto, tem o potencial de abordar questões patofisiologicamente relevantes na pesquisa da ELA, como os mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp