Mise en place d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région

Résumé

Nous décrivons une méthode de différenciation des astrocytes et des neurones dérivés pluripotents induits par l’homme et leur co-culture pour l’enregistrement électrophysiologique.

Résumé

Les astrocytes et les neurones (hiPSC-A) et les neurones (hiPSC-N) humains pluripotents fournissent un outil puissant pour modéliser la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) in vitro. Les enregistrements à réseaux multi-électrodes (MEA) sont un moyen d’enregistrer les potentiels de champ électrique de grandes populations de neurones et d’analyser l’activité du réseau au fil du temps. Il a été précédemment démontré que la présence d’hiPSC-A différenciés à l’aide de techniques visant à promouvoir un phénotype d’astrocyte de la moelle épinière améliorait la maturation et l’activité électrophysiologique des neurones moteurs hiPSC (MN) de la moelle épinière spécifiques à une région par rapport à ceux cultivés sans hiPSC-A ou en présence d’astrocytes de rongeurs. La méthode décrite ici est une méthode de co-culture de la moelle épinière hiPSC-A avec hiPSC-MN et d’enregistrement de l’activité électrophysiologique à l’aide d’enregistrements MEA. Alors que les protocoles de différenciation décrits ici sont spécifiques aux astrocytes et aux neurones qui sont régionalement spécifiques à la moelle épinière, la plateforme de co-culture peut être appliquée aux astrocytes et aux neurones différenciés avec des techniques spécifiques à d’autres destins, y compris l’hiPSC-A cortical et l’hiPSC-N. Ces protocoles visent à fournir un test électrophysiologique pour informer sur les interactions glia-neurones et fournir une plate-forme pour tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans la SLA.

Introduction

Les astrocytes et les neurones (hiPSC-A) et les neurones (hiPSC-N) sont des outils puissants pour modéliser la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) in vitro et fournissent un paradigme translationnel pour les stratégies de découverte de médicaments¹. Les chercheurs ont démontré que la co-culture de l’hiPSC-A avec l’hiPSC-N améliore la maturation morphologique, moléculaire, électrophysiologique et pharmacologique des deux types cellulaires, générant des réseaux neuronaux complexes et des interactions astrocyte-neurones qui ressemblent à leurs homologues in vivo ^2,3. Des expériences de co-culture similaires peuvent récapituler les caractéristiques de la pathobiologie de la SLA telles que la neurotoxicité médiée par les astrocytes ^4,5 et l’hyperexcitabilité neuronale⁶. De plus, avec les progrès des protocoles de différenciation, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) peuvent être différenciées en sous-types neuronaux spécifiques à la région, y compris les cellules souches corticales et épinières hiPSC-A et hiPSC-N ^7,8. Ces stratégies offrent le potentiel de modélisation de la pathologie des motoneurones corticaux et spinaux dans la SLA, ainsi que l’influence astrocytaire sur les deux. Cependant, cela nécessite qu’il existe un essai fonctionnel reproductible pour déterminer ces effets.

Récemment, il a été démontré que l’enregistrement multi-électrodes (MEA) est particulièrement adapté à la caractérisation électrophysiologique des co-cultures neurone-astrocyte². Contrairement aux analyses électrophysiologiques unicellulaires, ces réseaux d’électrodes à haute densité enregistrent passivement les potentiels de champ extracellulaire de grandes populations de neurones sans perturber les conditions de culture et préserver l’intégrité des membranes cellulaires. Ces plateformes sont particulièrement utiles pour enregistrer l’activité cellulaire et en réseau des cultures au fil du temps et en réponse à des manipulations pharmacologiques. Enfin, lorsque la présence d’astrocytes est une variable de culture, les enregistrements MEA peuvent fournir des informations fonctionnelles sur les interactions bidirectionnelles astrocyte-neurone ^2,9.

Présenté ici est un protocole optimisé pour la différenciation de l’hiPSC en hiPSC-A de la moelle épinière et hiPSC-motoneurones (MN) qui a été précédemment validé². Le protocole de différenciation hiPSC-A de la moelle épinière aboutit systématiquement à des cultures d’astrocytes, qui sont positives pour la protéine B liant le calcium S100 (S100β), la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et l’Homeobox B4 (HOXB4) dans jusqu’à 80 %, 50 % et 90 % des cellules, respectivement, ce qui indique une spécification gliale et moelle épinière en cours de maturation ^2,10 . Le protocole de différenciation hiPSC-MN génère des neurones positifs à >90% pour la choline acétyltransférase (ChAT), suggérant une identité de motoneurone alpha^{mature 2}. En outre, le protocole décrit des techniques pour la génération de co-cultures hiPSC-A/MN dont il a été démontré précédemment qu’elles aboutissaient à des neurones présentant une complexité morphologique accrue par analyse Scholl et microscopie immunofluorescente par rapport à des cultures neuronales sans astrocytes ou avec des astrocytes de rongeurs². Bien que ces descriptions soient spécifiques à la moelle épinière hiPSC-A et hiPSC-N, un avantage unique est que la culture indépendante initiale d’astrocytes et de neurones suivie d’étapes de co-culture à des moments ultérieurs peut être traduite pour étudier les effets des interactions neurone-astrocyte d’autres régions spécifiques ainsi que des cellules spécifiques à la maladie ^7,8 . Enfin, le protocole décrit comment cultiver ces cultures sur des plaques MEA afin que l’activité fonctionnelle en tant que facteur de composition de co-culture puisse être étudiée dans le temps avec la capacité de manipuler la composition cellulaire ainsi que les conditions de culture.

L’objectif de ces protocoles est de fournir un test fonctionnel pour étudier les interactions astrocyte-neurone, examiner les changements spécifiques à la maladie et tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans le domaine de la SLA. Des instructions vidéo sont fournies pour les étapes les plus difficiles de ce protocole.

Protocole

1. Préparation des milieux de culture cellulaire

1. Préparer les milieux de culture cellulaire individuels en utilisant les compositions mentionnées dans le tableau 1.
2. Mélanger et filtrer stérilement le média dans des flacons filtrés de 500 ml et conserver à l’abri de la lumière à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 2 semaines.

2. Maintien et transmission des cellules souches pluripotentes induites par l’homme non confluentes (CSPhi)

1. Décongeler la matrice membranaire basale (conservée dans des aliquotes à -80 °C) dans un réfrigérateur à 2-8 °C pendant une nuit.
2. Diluer la matrice de la membrane basale à 1:100 (v/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) ou dans le milieu Eagles modifié de Dulbecco (DMEM).
3. Ajouter suffisamment de matrice membranaire basale pour recouvrir le fond de la plaque de culture tissulaire (5 mL pour une plaque de 10 cm, 2 mL pour les puits simples de plaque de 6 puits) et incuber à 37 °C pendant un minimum de 30 minutes pendant la nuit ou à température ambiante pendant au moins 1 h.
4. Aspirer la matrice membranaire basale diluée et laver la plaque une fois avec du PBS avant d’ajouter des milieux de culture et des cellules d’ensemencement.
5. Examinez les plaques quotidiennement pour déterminer et anticiper quand elles sont prêtes à être passées. Plaques de passage de hiPSC une fois que la majorité des colonies sont devenues suffisamment denses pour que le centre des colonies affiche des zones blanches dispersées. Ne laissez pas les plaques mûrir au-delà de ce point. Il provoquera une différenciation excessive conduisant à l’apparition d’une zone jaune au centre des colonies en raison de la multicouche cellulaire, de la surabondance de cellules allongées sur les bords, de la compacité lâche au sein des colonies ou de l’augmentation de la mort cellulaire.
6. Le jour du passage, tracez des lignes de grille sur la surface extérieure inférieure des plaques avec un marqueur pour faciliter une couverture précise de l’ensemble de la plaque.
7. Détacher les colonies différenciées dans une hotte de culture à l’aide d’un microscope à contraste de phase (grossissement 10x) en grattant manuellement avec un embout de pipette de 200 μL.
8. Rincer les assiettes deux fois avec du PBS (5 mL par lavage pour des assiettes de 10 cm).
9. Ajouter 5 mL de protéase de dissociation tissulaire préchauffée (Table des matières) et incuber les cellules à 37 °C jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à s’arrondir (4-7 min), mais avant que les colonies ne se soulèvent de la plaque.
10. Aspirez soigneusement la protéase de dissociation. Rincez doucement la plaque deux fois avec du PBS, en prenant soin de ne pas déloger les colonies.
11. Ajouter 5 mL de milieu hiPSC préchauffé (tableau 1) dans la plaque de culture.
12. Soulevez les colonies tout en les divisant en agrégats cellulaires plus petits en grattant toute la plaque avec l’extrémité d’une pipette de 5 ml en effectuant un mouvement de va-et-vient de haut en bas.
13. Tournez la plaque de 90° et répétez l’étape ci-dessus.
14. Triturer doucement les agrégats cellulaires en pipetant de haut en bas avec une pipette de 5 ml et vérifier périodiquement la taille des agrégats au microscope jusqu’à ce que la majorité des agrégats cellulaires soient d’environ 50 à 100 cellules.
15. Ensemencer les agrégats cellulaires dans les plaques matricielles membranaires basales pré-revêtues, en utilisant un milieu hiPSC supplémentaire pour laver la plaque d’origine. Recueillir et transférer la plupart des agrégats cellulaires sur les nouvelles plaques à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    NOTA : Si le protocole est appliqué de façon uniforme, la plaque d’origine doit contenir des colonies de CSPi couvrant environ 50 % de la surface de culture avant le passage. Dans ce cas, le rapport de division doit être d’une plaque à cinq nouvelles plaques. Cependant, cela peut devoir être ajusté en fonction des conditions de croissance et des taux de croissance spécifiques à la lignée cellulaire.
16. Secouez les plaques nouvellement ensemencées d’avant en arrière pour répartir uniformément les agrégats.
17. Transférer les plaques dans un incubateur (37 °C et 5% de CO₂) et les laisser intactes pendant la nuit pour permettre une bonne adhérence cellulaire.
18. Effectuez un changement de milieu complet tous les jours avec 10 ml de milieu hiPSC. S’il y a un excès de débris cellulaires le jour suivant le passage, laver une fois avec 5 mL du milieu avant le changement de milieu.
19. Prévoyez de passer ensuite lorsque des zones blanches apparaîtront au centre de la majorité des colonies de CSPi (étape 2.5). Cela se produira 4-6 jours après chaque passage.

3. Congélation de hiPSC

1. Effectuez les étapes initiales comme dans les étapes 2.5-2.14 pour le passage hiPSC.
2. Recueillir les agrégats cellulaires dans un tube de 15 mL et faire tourner à 200 x g pendant 2 min.
3. Aspirer le surnageant, remettre la pastille en suspension dans un milieu de congélation et transférer dans des cryotubes à l’aide d’une pipette de 5 mL.
   REMARQUE: Semblable aux étapes de passage, le rapport de division habituel est d’une plaque iPSC pour cinq cryotubes, selon la densité des colonies. Utilisez un volume total de 1 mL de milieu de congélation pour chaque cryotube.
4. Placez les cryotubes dans un récipient de cryoconservation réfrigéré et transférez-le à -80 °C pendant la nuit.
5. Transférer les cellules à l’azote liquide après 24 h.

4. Décongélation des CSP

1. Enduire une plaque de 10 cm de la matrice de la membrane basale (voir 2.1-2.3).
2. Retirez un cryotube iPSC de l’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à 2 minutes pour le décongeler rapidement. Agiter le flacon dans le bain jusqu’à ce qu’il soit partiellement décongelé et qu’il contienne un petit morceau de glace entouré de liquide.
3. Transférer les agrégats cellulaires du cryotube dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Ajouter jusqu’à 15 mL de milieu hiPSC préchauffé pour diluer le diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le milieu de congélation.
4. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 200 x g pendant 2 min.
5. Aspirer le surnageant et utiliser une pipette de 5 mL pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu hiPSC contenant 20 μM d’inhibiteur de la protéine sérine/thréonine kinase de la protéine enroulée associée à Rho (ROCK-I, composé Y-27632) afin d’éviter une trituration supplémentaire des agrégats cellulaires.
6. Transférer les agrégats cellulaires sur une plaque de 10 cm recouverte d’une matrice membranaire basale à l’aide d’une pipette de 5 mL.
   REMARQUE: Si le protocole est appliqué de manière cohérente, les cellules d’un cryotube peuvent être transférées sur une seule plaque de 10 cm.
7. Secouez la plaque pour répartir les agrégats uniformément.
8. Transférez la plaque dans un incubateur et laissez-la intacte pendant la nuit pour permettre une bonne adhérence cellulaire.
9. Effectuer un changement de milieu complet le lendemain de la décongélation avec 10 ml de milieu hiPSC sans ROCK-I.

5. Différencier les hiPSC en cellules progénitrices neurales (NPC) de la moelle épinière

1. Assurez-vous que les plaques à 6 puits revêtues de matrice membranaire basale sont prêtes à l’emploi avant de commencer la différenciation.
2. Commencez par les CSPi qui ont été passés au moins une fois et de préférence deux fois après décongélation et avec au moins quatre plaques de 10 cm (voir explication à l’étape 5.11).
3. Effectuez les étapes initiales comme dans les étapes 2.5-2.14 pour le passage hiPSC.
4. Transférer les agrégats cellulaires d’au moins deux plaques de 10 cm dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette de 5 ml.
5. Centrifuger à 200 x g pendant 2 min.
6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec 10 mL de milieu hiPSC à l’aide d’une pipette de 10 mL, puis centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 2 minutes pour desserrer les adhérences de cellule à cellule dans chaque agrégat.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu hiPSC contenant 20 μM de ROCK-I à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
8. Pipeter de haut en bas avec une pipette de 1000 μL pour triturer les agrégats cellulaires. Vérifiez périodiquement la taille des agrégats au microscope jusqu’à ce que la majorité de la suspension cellulaire comprenne des cellules simples ou de petits agrégats de <10 cellules.
9. Comptez les cellules avec un hémocytomètre (de préférence) ou un compteur cellulaire automatisé et calculez la densité cellulaire dans la suspension cellulaire.
10. Plaque 3,0 x 10 6 cellules dans chaque puits d’une plaque de⁶ puits pré-revêtue d’une matrice membranaire basale. Utilisez une pipette de 1000 μL pour transférer la suspension cellulaire.
    NOTE: Si le protocole est appliqué de manière cohérente, cela correspond à un rapport de deux plaques de 10 cm dans un seul puits d’un puits / plaque de 6.
11. Répétez les étapes 5.3 à 5.10 avec un deuxième lot de deux plaques de 10 cm et plaquez le produit final dans une matrice membranaire basale recouverte d’un deuxième puits à 6 puits. Utilisez une pipette de 1000 μL pour transférer la suspension cellulaire.
    REMARQUE: L’achèvement idéal du protocole NPC de la moelle épinière nécessite deux puits égaux à quatre plaques de 10 cm. Pour faciliter le flux de travail, effectuez les étapes 5.3 à 5.10 avec deux lots de deux plaques, chacune avec le produit final étant deux plaques séparées à 6 puits et chacune avec un puits contenant 3,0 x 10⁶ cellules.
12. Maintenir la monocouche iPSC humaine résultante dans un milieu hiPSC contenant 20 μM de ROCK-I jusqu’à ce que la confluence atteigne >90%, généralement le lendemain, mais pas plus de 3 jours après le placage initial pour éviter une différenciation spontanée (non contrôlée).
13. Si la différenciation ne peut pas être commencée le lendemain du placage cellulaire, laver les cellules une fois avec du PBS et changer de milieu quotidiennement pour un milieu hiPSC frais contenant 20 μM de ROCK-I. S’il ne conflue pas >90% dans les 3 jours suivant le placage, jetez les cellules et recommencez le protocole.
14. Une fois que > confluence de 90% est atteinte, commencez la différenciation. Il s’agit du jour in vitro 1 (DIV1) du protocole de différenciation.
15. Sur DIV 1, jeter le milieu hiPSC contenant 20 μM ROCK-I et rincer deux fois avec du PBS pour éliminer le facteur de croissance fœtale (FGF) et le facteur de croissance transformant bêta (TGFβ) présents dans le milieu de cellules souches.
16. Changez le milieu en milieu WiCell (tableau 1) complété par 0,2 μM de LDN193189 (LDN) et 10 μM de SB431542 (SB) pendant 48 h.
17. Sur DIV 3, laver une fois avec du PBS et changer le milieu en milieu WiCell complété par LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + acide rétinoïque (RA; 1μM) pendant 48 h.
18. Sur DIV 5, laver une fois avec PBS et changer le support pour WiCell : Neural induction medium (NIM) base (Tableau 1) (50%:50%, v/v) complété par LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) pendant 48 h.
19. Sur DIV 7, effectuez un échange de milieu avec le même milieu que dans l’étape 5.18.
20. Sur DIV 8, laver une fois avec PBS et changer de milieu en WiCell:NIM base (50%:50%) complété par RA (1 μM) + puromorphamine (PMN) (1 μM) + facteur neurotrophique recombinant dérivé du cerveau humain (BDNF) (10 ng / mL) + acide ascorbique (ASAC) (0,4 μg / mL) pendant 48 h.
21. Sur DIV 10, laver une fois avec du PBS et changer de milieu à base NIM (100%) complété comme mentionné à l’étape 5.20 pendant 48 h.
22. Sur DIV 11 ou 12, enduire une fiole de culture stérile de 25 cm² de matrice membranaire basale en vue du passage.
23. Aspirer le milieu de chaque puits de la plaque l à 6 puits et rincer les cellules une fois avec du PBS.
24. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,05 % dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 5 à 15 min; Secouer les plaques par intermittence peut aider au détachement cellulaire.
25. Si les cellules ne sont toujours pas en suspension, détachez-les mécaniquement en éjectant le média NIM d’une pointe de pipette de 1000 μL sur les cellules avec un mouvement circulaire (assurez-vous de couvrir toute la surface), ou en grattant avec un racleur de cellule (non préféré).
26. Transférer les cellules de 2 puits dans un tube de 15 mL et ajouter l’inhibiteur de la trypsine dans une proportion appropriée à la quantité de trypsine utilisée à l’aide d’une pipette de 5 mL.
27. Centrifuger à 200 x g pendant 2 min, aspirer le surnageant, puis remettre en suspension avec 10 mL de base NIM à l’aide d’une pipette de 10 mL.
28. Centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 2 min pour desserrer les adhérences de cellule à cellule.
29. Après la deuxième étape de centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 1 mL de milieu NIM (100%) complété par RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / mL) + ASAC (0,4 μg / mL) et ROCK-I (20 μM). À l’aide d’un embout de pipette de 1000 μL, triturer les cellules de haut en bas environ cinq fois jusqu’à l’obtention d’une suspension trouble.
30. Réensemencer les agrégats dans ce milieu dans le flacon de culture stérile de 25 cm 2 revêtu de matrice membranaire basale de sorte que le résultat final soit la combinaison des cellules de deux puits d’une plaque de 6 puits à un seul flacon de culture stérile de 25 cm 2 revêtu de matrice membranaire basale (passage²:1). Utilisez une pipette de 1000 μL pour transférer la suspension cellulaire.
    REMARQUE: Les cellules doivent être confluentes à >90% sur DIV 13, et aucune autre étape n’est nécessaire avant le jour 14. Si les cellules ne sont pas confluentes, conservez ROCK-I dans le milieu pendant 1 ou 2 jours supplémentaires.
31. Sur DIV 14, remplacer le milieu par un milieu NIM frais + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL).
32. Sur DIV 15, remplacer le milieu par NIM : Neural differentiation medium (NDM) base (Tableau 1) (50 % : 50 %) avec PR (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/mL) + Supplément B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + Lignée cellulaire gliale neurotrophique dérivée (GDNF) (10 ng/mL) + Facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) (10 ng/mL) + Facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) (10 ng/mL). Changez avec des médias frais tous les deux jours.
33. Sur DIV 21, changer le milieu à la base NDM (100%) complété comme à l’étape 5.32, et changer avec un milieu frais tous les deux jours.
34. Sur DIV 25-30, collectez les PNJ et les congelez ou les passez sur une plaque de 10 cm pour la différenciation terminale.
35. Rincer la fiole T-25 avec du PBS et ajouter 0,05% de trypsine.
36. Incuber pendant 5 min à 37 °C.
37. Rincer la trypsine et les cellules avec la base NDM et transférer dans un tube conique de 15 mL. Ajouter l’inhibiteur de trypsine dans une proportion appropriée à la trypsine et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
38. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec un motoneurone ou un milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1) et utilisez une pipette de 1000 μL pour triturer de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire (généralement jusqu’à 5 fois).
39. Compter les cellules et les transférer sur une plaque de 10 cm revêtue comme décrit au point 6, en utilisant l’un ou l’autre milieu de différenciation +Rock-I, pour différencier hiPSC-MN et hiPSC-A.
40. Sinon, congeler les cultures en les remettant en suspension dans un milieu de congélation composé à 90% de milieu NDM avec des facteurs de croissance (comme aux étapes 5.32-5.33) et de 10% de DMSO, triturer de la même manière, puis transférer dans un cryotube. Aliquote 6 x 10⁶ NPC par cryotube.

6. Décongélation des cultures PNJ

1. Enduisez les plaques de 10 cm de polyornithine (PLO) et de laminine la veille de la décongélation des cellules.
   1. Ajouter 5 mL de PLO dilué à 100 μg/mL dans du PBS ou de l’eau distillée (_dH2O) dans des assiettes. Incuber à 37 °C pendant au moins 1 h jusqu’à la nuit.
   2. Aspirer la solution PLO et rincer les plaques trois fois avec du PBS. (L’OLP est toxique s’il n’est pas correctement lavé.)
   3. Ajouter la laminine diluée dans du PBS à une concentration de 10 μg/mL aux plaques revêtues de PLO. Incuber à 37 °C pendant un minimum de 1 h, de préférence pendant une nuit. Après l’incubation, aspirer la solution de laminine sans rinçage pour améliorer l’adhérence cellulaire.
      NOTE: Les plaques peuvent être enduites de PLO à l’avance, lavées trois fois à l’eau, séchées dans une hotte stérile et stockées à 4 ° C.
2. Décongeler un flacon de NPC (c.-à-d. DIV 25 ou 30) contenant 6 x 10⁶ cellules/flacon pour chaque plaque de culture cellulaire de 10 cm.
3. Retirer le cryotube NPC de l’azote liquide et placer immédiatement dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 minutes maximum. Décongeler rapidement en secouant le flacon jusqu’à ce qu’il y ait un petit morceau de glace entouré de liquide.
4. Transférer les agrégats cellulaires dans un conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 1000 μL et ajouter jusqu’à 15 mL de NDM préchauffé ou de supplément Modified Eagles Medium (DMEM) de Dulbecco / F21 F12 de Ham pour diluer le DMSO.
5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
6. Aspirer le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu de différenciation astrocytaire ou MN (tableau 1) + ROCK-I (20 μM) et utiliser une pipette de 1000 μL pour triturer de haut en bas jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire (jusqu’à 5 fois).
7. Transférer la suspension unicellulaire sur une plaque de 10 cm revêtue de PLO-Laminin.
8. Transférez la plaque dans un incubateur et laissez-la intacte pendant la nuit pour permettre une bonne adhérence cellulaire.

7. Différenciation de la NPC de la moelle épinière en motoneurones

1. Effectuer les étapes initiales mentionnées aux étapes 6.1 à 6.8, le milieu final étant le milieu de différenciation MN + ROCK-I (20 μM).
2. Le lendemain du placage, effectuer un échange complet du milieu avec le milieu de différenciation MN sans ROCK-I, puis changer le support tous les deux jours. Pendant le week-end, nourrissez les cellules le vendredi, puis à nouveau le lundi. Rincez les cellules avec du PBS au besoin pour éliminer les débris cellulaires.
3. Changez le milieu avec le milieu de différenciation MN + cytosine arabinoside (ARA-C) (0,02 μM) et incuber pendant 48 h lorsque les progéniteurs engagés gliaux émergent sous forme de cellules plates proliférantes uniques sous des progéniteurs MN post-mitotiques agrégés en grappes cellulaires.
   REMARQUE: Habituellement, cela se produit dans les 7 premiers jours après le placage initial, bien qu’il puisse y avoir une variabilité en fonction de la lignée cellulaire.
4. Après 48 h, aspirer le milieu contenant de l’ARA-C, rincer doucement les cultures avec du PBS trois fois et remplacer le milieu par un milieu MN frais sans ARA-C.
5. Après le traitement par ARA-C, effectuez des échanges de milieu tous les deux jours (ou lundi, mercredi et vendredi) en retirant l’ancien milieu avec une pipette manuelle plutôt qu’un aspirateur à vide pour prévenir le décollement prématuré des amas neuronaux. De plus, enrichir le milieu MN avec de la laminine 1 μg/mL une fois par semaine pour améliorer davantage l’attachement neuronal aux plaques de culture.

8. Différencier les NPC en astrocytes de la moelle épinière

1. Décongeler les cultures de NPC comme dans la section 6, en utilisant le milieu de différenciation des astrocytes (tableau 1) avec l’ajout de sérum fœtal bovin (FBS) avec un volume pour la concentration volumique de 1% (NS + 1% FBS) ainsi que ROCK-I (20 μM) pour le placage.
   NOTA : Le FBS par le remplacement du sérum disponible dans le commerce (tableau 1) peut être substitué au FBS en utilisant les mêmes facteurs de dilution.
2. Le lendemain du placage, changer le milieu de culture avec un milieu FBS NS + 1% sans inhibiteur de ROCK, puis changer le milieu tous les deux jours. Pendant les fins de semaine, nourrissez les cellules le vendredi, puis à nouveau le lundi. Rincez les cellules avec du PBS au besoin pour éliminer les débris cellulaires. Si les cellules continuent de mourir, compléter le milieu avec ROCK-I (10 μM) pour favoriser la survie des cellules. Veillez à ne pas utiliser ROCK-I trop souvent ou trop longtemps, étant donné le potentiel de sélectionner des cellules immortelles.
3. Laissez les astrocytes devenir confluents avant de les passer.
   REMARQUE: La taille de la cellule augmentera avec le temps, il n’y a donc pas de nombre défini à passer. Le ratio de réussite typique est de 1:2 ou 1:3. En cas de mauvaise survie ou de passage à un trop grand nombre de plaques, combiner deux plaques (ou plus, au besoin) de 10 cm en une seule plaque de 10 cm pour maintenir la confluence.
4. Pour faire passer les cultures de progéniteurs d’astrocytes , laver les plaques une fois avec du PBS (pour éliminer le FBS), incuber avec 0,05% de trypsine pendant 5 min, recueillir les cellules dans le milieu NS + 1% FBS (FBS inactivera la trypsine), puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans le milieu NS + 1% FBS, puis triturer en une suspension unicellulaire. Distribuer les cellules en NS + 1% FBS sur de nouvelles plaques de 10 cm.
   REMARQUE: En plus d’étendre les cultures d’astrocytes, le passage répété de plaques sert à tuer toutes les cellules progénitrices restantes qui ont choisi un destin neuronal. Par conséquent, même s’il n’y a pas un taux mitotique très élevé, les plaques peuvent être passées à un rapport de 1: 1 s’il semble y avoir une contamination neuronale.
5. Changez le revêtement au cours de la différenciation pour augmenter le rendement comme suit.
   1. Plaquez les cultures NPC initialement décongelées et les premiers passages après le placage initial sur PLO/Laminin.
   2. Plaquer les astrocytes immatures sur des plaques revêtues de matrice membranaire basale.
   3. Plaquez des astrocytes plus matures (c.-à-d. après le jour 90) sur une matrice membranaire basale, des plaques recouvertes de PLO / laminine (généralement pour la co-culture avec des neurones) ou sur des plaques non revêtues.
6. Congeler les progéniteurs des astrocytes à tout moment au cours de la période de maturation de 60 jours pour synchroniser les cultures ou les conserver pour des expériences ultérieures. Lors de la décongélation au-delà du stade NPC, décongelez les progéniteurs astrocytaires sur les plaques recouvertes de matrice membranaire basale plutôt que sur PLO / laminine.
7. À la DIV 90 et par la suite, passer du milieu de NS + 1% FBS à NS + 5% FBS pour favoriser la survie des astrocytes et diminuer leur prolifération.

9. Co-culture d’astrocytes MN et de la moelle épinière dans des plaques multi-électrodes

1. Différencier et plaquer les motoneurones et les astrocytes lorsqu’ils sont prêts à être utilisés le même jour et vieillis à DIV 60 pour les motoneurones et DIV 90 pour les astrocytes.
2. Enduisez les plaques MEA la veille ou le jour du placage comme suit si vous travaillez avec des plaques en plastique à 24 puits (tableau des matériaux).
3. Diluer le PLO dans de l’eau ou du PBS à 100 μg/mL.
   1. Ajouter 15-20 μL à chaque puits (selon le niveau de confort de la pipette), formant une gouttelette au centre du puits couvrant la zone des électrodes et la zone environnante, mais pas la totalité du puits.
   2. Veillez à ne pas endommager les électrodes avec l’embout de la pipette. Être cohérent avec le volume d’un puits à l’autre pour assurer la couverture de la même surface dans chaque puits.
   3. Incuber le PLO à 37 °C pendant un minimum de 1 h (de préférence 2 h).
      REMARQUE: Les petits volumes sècheront s’il n’y a pas suffisamment d’humidité dans les plaques. Ajoutez de l’eau dans les compartiments entourant les puits pour assurer une humidité suffisante tout au long du revêtement et des enregistrements.
4. Aspirez autant de PLO que possible à l’aide d’une pointe de micropipette en plastique. Veillez à ne pas toucher les électrodes. Laver trois fois avec 250 μL d’eau. Si vous utilisez un aspirateur à vide pour les lavages, ne laissez pas l’embout près du réseau d’électrodes. Après le troisième lavage, retirez autant d’eau que possible, en utilisant une pointe de pipette si nécessaire. Laissez la surface sécher sous le capot de culture cellulaire avec le couvercle retiré.
5. Une fois que les surfaces des plaques sont sèches, ajouter de la laminine diluée à 10 μg/mL dans du PBS. Utilisez 15-20 μL pour couvrir chaque réseau d’électrodes. Ajouter de l’eau dans les compartiments d’humidité, replacer le couvercle et remettre la plaque à 37 °C pendant au moins 2 h jusqu’à la nuit.
6. Le jour du placage, rincer une fois les cultures de MN et d’astrocytes avec du PBS et ajouter de la trypsine à 0,05 % à 37 °C pour soulever les cellules (5 min). Recueillir dans un tube conique de 15 mL contenant un inhibiteur de trypsine et laver les plaques avec un milieu ou une base pour s’assurer que toutes les cellules sont recueillies. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et remettre en suspension avec une pipette de 1000 μL pour générer 1 mL d’une suspension unicellulaire. Lors de la remise en suspension de MN et d’astrocytes, passer au milieu de coculture (tableau 1), avec l’ajout de 20 μM de ROCK-I.
7. Compter le MN et les astrocytes en parallèle à l’aide d’un hémocytomètre. Pendant le comptage et les calculs, coiffez les suspensions cellulaires et placez-les dans un support en polystyrène expansé à 4 °C.
8. Calculer le volume nécessaire pour remettre les cultures en suspension à une concentration de 5 x 10 4 cellules par 5 μL pour les motoneurones et de 2,5 x 10⁴ cellules par 5 μL pour les astrocytes. Centrifuger les suspensions cellulaires de 1 mL à 300 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans le volume calculé.
9. Calculez le nombre de puits souhaités à ensemencer et multipliez-le par 5 μL de chaque suspension cellulaire. Combinez le volume requis de suspensions de neurones et d’astrocytes dans un rapport de 1:1 et mélangez en pipetant jusqu’à ce qu’ils soient bien combinés (généralement deux fois), mais évitez d’être trop agressif.
10. Retirez la laminine de chaque puits de la plaque MEA à l’aide d’un embout de pipette. Transférer 10 μL de la suspension cellulaire combinée finale à chaque puits, formant une petite gouttelette recouvrant le réseau d’électrodes pour fournir une densité cellulaire de 5 x 10 4 MN et 2,5 x 10⁴ astrocytes par puits.
    REMARQUE : Une densité cellulaire élevée dans la suspension combinée nécessite une remise en suspension fréquente entre les puits pendant l’étape de semis pour assurer un comptage précis et cohérent des cellules.
11. Remettre les assiettes dans l’incubateur pendant 20-30 min. Veillez à ne pas déranger la gouttelette cellulaire et laissez les cellules former des attaches initiales sur les plaques.
12. Après 20-30 min, ajouter des milieux de coculture chauds + ROCK-I à chaque puits en pipetant 250 μL sur la paroi de chaque puits, suivi de 250 μL supplémentaires le long de la paroi du même puits du côté opposé. Remettez l’assiette dans l’incubateur.
13. Examiner les assiettes le lendemain de l’ensemencement (Co-culture Jour 1). S’il y a des débris cellulaires importants ou des cellules mortes, échangez le milieu avec un milieu de coculture frais contenant du ROCK-I. Sinon, changez le milieu le deuxième jour après l’ensemencement (Co-Culture Day 2) pour le milieu de co-culture sans ROCK-I. Effectuer des échanges demi-moyens (aspirer 50% et ajouter 60% du volume final pour tenir compte de l’évaporation) deux fois par semaine.
14. Si vous utilisez des systèmes MEA avec des plaques de verre à puits unique de 30 mm (table des matériaux), la préparation de la plaque peut prendre 2 jours ou plus. Suivez les étapes ci-dessous pour effectuer cette opération.
15. Soulevez les cellules et les débris cellulaires des cultures MEA précédentes avec 0,05% de trypsine pendant 5-15 min.
16. Aspirer la trypsine et rincer trois fois à l’eau.
17. Stériliser en ajoutant 70% d’éthanol et incuber dans la hotte pendant 10 min. Aspirez l’éthanol, puis rincez à l’eau trois fois.
18. Appliquez un détergent anionique à 1% avec l’enzyme protéase dans l’eau. Couvrez les assiettes avec un couvercle et enveloppez-les d’un film thermoplastique et d’une feuille d’aluminium, puis laissez-les sur une bascule à température ambiante pendant la nuit.
19. Aspirez le détergent, puis rincez trois fois à l’eau.
20. Si vous prévoyez de stocker les plaques, ajoutez un volume d’eau suffisant. Couvrez les assiettes avec un couvercle et enveloppez-les d’un film thermoplastique et d’une feuille d’aluminium, et laissez-les au réfrigérateur jusqu’à la prochaine utilisation.
21. Si vous prévoyez d’enduire, laissez sécher la surface sous le capot de culture cellulaire.
22. Si une stérilisation supplémentaire est nécessaire (p. ex. infection antérieure ou utilisation non récente), à ce stade seulement, exposez les plaques d’AEM à la lumière ultraviolette (UV) sous le capot pendant 30 à 60 minutes.
    REMARQUE: Éviter les rayons UV fréquents empêchera d’endommager les électrodes. L’utilisation de la lumière UV lorsque les plaques ont du sérum sur elles entraînera des électrodes non fonctionnelles, c’est pourquoi elle ne devrait être utilisée que sur des plaques nettoyées.
23. Lorsque les plaques sont complètement sèches, procéder au nettoyage au plasma pendant 1 min pour charger la surface en verre des plaques MEA et améliorer l’efficacité du revêtement. Nettoyer au plasma au moins une fois tous les 4-5 cycles de nettoyage de plaques MEA.
    1. Comme alternative, lorsque le nettoyage au plasma n’est pas possible ou n’est pas justifié, ajoutez un volume suffisant de milieu contenant du FBS pour couvrir la surface des plaques MEA et les retourner dans l’incubateur pendant la nuit.
24. Utilisez le revêtement OLP/laminine comme décrit ci-dessus dans la section 6. Ajouter la solution de PLO (100 μg dans du PBS) immédiatement après le nettoyage au plasma ou l’aspiration et rincer le milieu contenant du FBS.
25. Plaquer les cellules comme ci-dessus aux densités suivantes : 1 x 10 5 hiPSC-A/plaque et 5 x 10⁵ hiPSC-MN/plaque.

10. Enregistrement multi-électrodes

1. Extrayez les données de tension brutes à une fréquence d’échantillonnage de 12,5 kHz, à l’aide d’un filtre Butterworth avec un filtre passe-haut de 200 Hz et un filtre passe-bas de 3 kHz. Définissez la reconnaissance des pics comme des points de temps instantanés de tensions ≥6 écarts-types par rapport à la ligne de base. Identifiez les rafales comme une activité avec >5 pics en 100 ms. Définissez l’activité du réseau lorsque plus de 35 % du total des électrodes actives se déclenchent dans un rayon de 100 ms avec un minimum de 50 pics par rafale de réseau.
2. Commencez à enregistrer dès que possible après le jour 1 de la Co-Culture (CC).
   REMARQUE: L’activité électrique sera rarement notée avant le jour 3 du CC.
3. Cultures parallèles sur plaques à des densités similaires et se réplique dans les plaques de culture ou les lames de couverture appropriées pour les essais biochimiques, l’immunocytochimie (ICC) ou la qPCR.
4. Effectuer des enregistrements avec la température réglée à 37 °C et CO₂ à 5%. Transférer les plaques dans la machine et les laisser s’équilibrer pendant au moins 5 minutes avant l’enregistrement.
5. Enregistrer l’activité de base tous les deux jours ou toutes les semaines, sur 1 à 15 minutes selon le plan expérimental. N’enregistrez pas pendant au moins 1 h après un échange moyen, et attendez idéalement 24 h après chaque échange média.
6. Pour prévenir la contamination, changer le milieu (c.-à-d. échange demi-milieu comme à l’étape 9.14) après tout enregistrement dans lequel le couvercle de la plaque stérile doit être ouvert à l’extérieur de la hotte stérile (c.-à-d. l’application de composés médicamenteux). Effectuer des échanges complets de milieu et des lavages pour laver les médicaments si les plaques doivent continuer à être utilisées au-delà du traitement médicamenteux.
7. À des fins d’analyse, utiliser au moins trois répétitions techniques et biologiques pour chaque condition. Exprimer les données électrophysiologiques comme moyens de n ≥ 3 répliques.

11. Dosages pharmacologiques sur réseau multi-électrodes

1. Utilisez une combinaison différente de co-cultures en fonction de la question expérimentale : neurones de la SLA avec astrocytes témoins, neurones témoins avec astrocytes SLA, neurones et astrocytes SLA, neurones et astrocytes témoins.
2. Lorsque vous étudiez les effets électrophysiologiques transitoires de composés ciblant les neurones ou les astrocytes, consigner l’activité de base pendant au moins 1 minute avec le couvercle de la plaque enlevé mais le couvercle de la machine fermé.
3. Ouvrez manuellement le couvercle de la machine sans arrêter l’enregistrement électrophysiologique et échangez 25 μL de milieu avec le véhicule médicamenteux approprié (généralement un milieu frais) à l’aide d’une pipette multicanal si vous traitez plusieurs puits. Fermez le couvercle manuellement.
4. Enregistrer pendant 1 minute supplémentaire (ou plus s’il y a des changements importants induits par le véhicule dont la culture doit se remettre).
5. Ouvrez à nouveau manuellement le couvercle et échangez 25 μL de milieu avec le médicament d’intérêt dans le même véhicule. Fermez le couvercle de la machine et poursuivez l’enregistrement.
   REMARQUE : La durée de l’enregistrement et le volume du médicament ou du véhicule administré peuvent varier ou doivent être optimisés selon la question expérimentale.
6. À des fins d’analyse, s’assurer que l’ajout du véhicule ne provoque pas de modifications importantes des paramètres électrophysiologiques. Calculer les variations en pourcentage de l’activité après la drogue par rapport à après l’ajout du véhicule et comparer entre les conditions.
7. Pour étudier les effets électrophysiologiques longitudinaux, tels que les médicaments candidats modificateurs de la maladie, consigner l’activité de base décrite à l’étape 11.2. Pour cela, utilisez soit le milieu de coculture contenant le ou les médicaments d’intérêt dans le véhicule approprié, soit le milieu contenant uniquement le véhicule.
8. À des fins d’analyse, comparer les enregistrements temporels de la SLA ou des co-cultures témoins traitées longitudinalement avec des médicaments entre elles et les conditions de contrôle.

Résultats

Le protocole de structuration de la moelle épinière pour la génération de hiPSC-MN et d’hiPSC-A de la moelle épinière est décrit à la figure 1. Dans ce protocole, les CSPhi sont maintenues et transmises sous forme de colonies non confluentes (figure 2A). La neurogenèse est initiée (induction neuronale) par une double inhibition SMAD par l’ajout de LDN193189 et SB431542, inactivant respectivement la protéine morphogénétique osseuse (BMP) et les v...

Discussion

À ce jour, les méthodes basées sur les HIPSC et MEA pour les enregistrements électrophysiologiques des co-cultures astrocyte-neurones ont trouvé une application limitée dans le domaine de la SLA⁶ et toujours pas dans des plates-formes entièrement humaines, contrairement à leur utilisation plus répandue pour la modélisation in vitro de l’épilepsie⁹. Cette plateforme a toutefois le potentiel de répondre à des questions pathophysiologiquement pertinente...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp