Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Zusammenfassung

Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen (MEA) sind ein Mittel, um elektrische Feldpotentiale von großen Populationen von Neuronen aufzuzeichnen und die Netzwerkaktivität im Laufe der Zeit zu analysieren. Es wurde bereits gezeigt, dass das Vorhandensein von hiPSC-A, das unter Verwendung von Techniken zur Förderung eines Rückenmarks-Astrozyten-Phänotyps differenziert wird, die Reifung und elektrophysiologische Aktivität von regional spezifischen spinalspezifischen hiPSC-Motoneuronen (MN) des Rückenmarks im Vergleich zu denen verbessert, die ohne hiPSC-A oder in Gegenwart von Nagetier-Astrozyten kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um das Rückenmark hiPSC-A mit hiPSC-MN zu kokulturieren und die elektrophysiologische Aktivität mittels MEA-Aufzeichnungen aufzuzeichnen. Während die hier beschriebenen Differenzierungsprotokolle spezifisch für Astrozyten und Neuronen sind, die regional spezifisch für das Rückenmark sind, kann die Co-Cultureing-Plattform auf Astrozyten und Neuronen angewendet werden, die mit Techniken differenziert werden, die für andere Schicksale spezifisch sind, einschließlich kortikaler hiPSC-A und hiPSC-N. Diese Protokolle zielen darauf ab, einen elektrophysiologischen Assay bereitzustellen, um über Glia-Neuronen-Interaktionen zu informieren und eine Plattform für die Erprobung von Medikamenten mit therapeutischem Potenzial bei ALS zu bieten.

Einleitung

Aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnene Astrozyten (hiPSC-A) und Neuronen (hiPSC-N) sind leistungsfähige Werkzeuge für die Modellierung der Pathophysiologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) in vitro und bieten ein translationales Paradigma für Strategien zur Arzneimittelforschung¹. Forscher haben gezeigt, dass die Co-Kultur von hiPSC-A mit hiPSC-N die morphologische, molekulare, elektrophysiologische und pharmakologische Reifung beider Zelltypen verbessert und komplexe neuronale Netzwerke und Astrozyten-Neuronen-Interaktionen erzeugt, die ihren In-vivo-Gegenstücken ähneln ^2,3. Ähnliche Co-Kultur-Experimente können Kennzeichen der ALS-Pathobiologie wie Astrozyten-vermittelte Neurotoxizität ^4,5 und neuronale Hypererregbarkeit⁶ rekapitulieren. Darüber hinaus können humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) mit Fortschritten bei den Differenzierungsprotokollen in regionalspezifische neuronale Subtypen differenziert werden, einschließlich kortikaler und Rückenmarks-hiPSC-A und hiPSC-N ^7,8. Diese Strategien bieten das Potenzial für die Modellierung der kortikalen und spinalen Motoneuron-Pathologie bei ALS sowie des astrozytären Einflusses auf beide. Dies setzt jedoch voraus, dass es einen reproduzierbaren funktionellen Assay gibt, um diese Effekte zu bestimmen.

Kürzlich wurde gezeigt, dass die Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnung (MEA) besonders geeignet für die elektrophysiologische Charakterisierung von Neuron-Astrozyten-Cokulturen^{ist 2}. Im Gegensatz zu elektrophysiologischen Einzelzellanalysen zeichnen diese hochdichten Elektrodenarrays passiv extrazelluläre Feldpotentiale von großen Neuronenpopulationen auf, ohne die Kulturbedingungen zu stören und die Integrität der Zellmembranen zu erhalten. Diese Plattformen sind besonders nützlich, um die Zell- und Netzwerkaktivität von Kulturen im Laufe der Zeit und als Reaktion auf pharmakologische Manipulationen aufzuzeichnen. Schließlich, wenn das Vorhandensein von Astrozyten eine Kulturvariable ist, können MEA-Aufzeichnungen funktionelle Einblicke in bidirektionale Interaktionen zwischen Astrozyten und Neuronen liefern ^2,9.

Hier wird ein optimiertes Protokoll für die Differenzierung von hiPSC in Rückenmark-hiPSC-A und hiPSC-Motoneuronen (MN) vorgestellt, das zuvor validiert wurde². Das hiPSC-A-Differenzierungsprotokoll des Rückenmarks führt durchweg zu Astrozytenkulturen, die in bis zu 80%, 50% bzw. 90% der Zellen positiv für S100-Calcium-bindendes Protein B (S100β), Gliafibrillen-saures Protein (GFAP) und Homöobox B4 (HOXB4) sind, was auf eine reifende Glia- und Rückenmarksspezifikation hinweist ^2,10 . Das hiPSC-MN-Differenzierungsprotokoll erzeugt Neuronen, die zu >90% positiv für Cholin-Acetyltransferase (ChAT) sind, was auf eine reife alpha-motorische Neuronenidentität^{hindeutet 2}. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll Techniken zur Erzeugung von hiPSC-A/MN-Cokulturen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie im Vergleich zu neuronalen Kulturen ohne Astrozyten oder mit Nagetier-Astrozyten^zu Neuronen mit erhöhter morphologischer Komplexität führen. Während diese Beschreibungen spezifisch für das Rückenmark hiPSC-A und hiPSC-N sind, besteht ein einzigartiger Vorteil darin, dass die anfängliche unabhängige Kultur von Astrozyten und Neuronen, gefolgt von Schritten zur Kokultur zu späteren Zeitpunkten, übersetzt werden kann, um die Auswirkungen von Neuron-Astrozyten-Interaktionen aus anderen spezifischen Regionen sowie krankheitsspezifischen Zellen zu untersuchen ^7,8 . Schließlich beschreibt das Protokoll, wie diese Kulturen auf MEA-Platten gezüchtet werden können, so dass die funktionelle Aktivität als Faktor der Kokulturzusammensetzung im Laufe der Zeit untersucht werden kann, mit der Fähigkeit, die zelluläre Zusammensetzung sowie die Kulturbedingungen zu manipulieren.

Das Ziel dieser Protokolle ist es, einen funktionellen Assay zur Verfügung zu stellen, um Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen, krankheitsspezifische Veränderungen zu untersuchen und Medikamente mit therapeutischem Potenzial im Bereich ALS zu testen. Für die anspruchsvollsten Schritte dieses Protokolls werden Videoanweisungen bereitgestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung von Zellkulturmedien

1. Die einzelnen Zellkulturmedien werden unter Verwendung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzungen hergestellt.
2. Mischen und sterilisieren Sie die Medien in 500 ml filtrierten Flaschen und lagern Sie sie bis zu 2 Wochen lichtgeschützt bei 4 °C.

2. Aufrechterhaltung und Weitergabe nicht-konfluenter humaninduzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC)

1. Die Basalmembranmatrix (in Aliquots bei -80 °C gelagert) über Nacht in einem 2-8 °C Kühlschrank auftauen.
2. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix bei 1:100 (v/v) in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM).
3. Fügen Sie eine ausreichende Basalmembranmatrix hinzu, um den Boden der Gewebekulturplatte zu beschichten (5 ml für eine 10-cm-Platte, 2 ml für einzelne Vertiefungen einer 6-Well-Platte) und inkubieren Sie bei 37 °C für mindestens 30 Minuten über Nacht oder bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
4. Saugen Sie die verdünnte Basalmembranmatrix ab und waschen Sie die Platte einmal mit PBS, bevor Sie Nährmedien und Impfzellen hinzufügen.
5. Untersuchen Sie die Platten täglich, um festzustellen und zu antizipieren, wann sie bereit sind, übergeben zu werden. Durchgangsplatten von hiPSC, sobald die Mehrzahl der Kolonien so dicht geworden ist, dass das Zentrum der Kolonien verstreute weiße Flächen aufweist. Lassen Sie die Platten nicht über diesen Punkt hinaus reifen. Es wird zu einer übermäßigen Differenzierung führen, die zum Auftreten eines gelben Bereichs in der Mitte der Kolonien führt, der auf Zellmehrschichtung, den Überfluss an länglichen Zellen an den Rändern, die lose Kompaktheit innerhalb der Kolonien oder den erhöhten Zelltod zurückzuführen ist.
6. Zeichnen Sie am Tag der Passage mit einem Marker Gitterlinien auf die untere Außenfläche der Platten, um eine genaue Abdeckung der gesamten Platte zu ermöglichen.
7. Lösen Sie differenzierte Kolonien in einer Kulturhaube mit einem Phasenkontrastmikroskop (10-fache Vergrößerung) und kratzen Sie manuell mit einer 200 μL Pipettenspitze ab.
8. Spülen Sie die Platten zweimal mit PBS (5 ml pro Waschgang für 10 cm Platten).
9. Fügen Sie 5 ml vorgewärmte Gewebedissoziationsprotease hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sich die Ränder der Kolonien aufrunden (4-7 min), jedoch bevor sich die Kolonien von der Platte heben.
10. Die Dissoziationsprotease vorsichtig absaugen. Spülen Sie die Platte vorsichtig zweimal mit PBS ab und achten Sie darauf, die Kolonien nicht zu entfernen.
11. 5 ml vorgewärmtes hiPSC-Medium (Tabelle 1) auf die Kulturplatte geben.
12. Heben Sie die Kolonien an, während Sie sie in kleinere Zellaggregate zerlegen, indem Sie die gesamte Platte mit der Spitze einer 5-ml-Pipette mit einer Hin- und Herbewegung von oben nach unten zerkratzen.
13. Drehen Sie die Platte um 90° und wiederholen Sie den obigen Schritt.
14. Tritularieren Sie die Zellaggregate vorsichtig, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette auf und ab pipettieren und die Größe der Aggregate regelmäßig unter einem Mikroskop überprüfen, bis die Mehrheit der Zellaggregate etwa 50-100 Zellen beträgt.
15. Säen Sie die Zellaggregate in die vorbeschichteten Matrixplatten der Basalmembran ein und waschen Sie die ursprüngliche Platte mit einem zusätzlichen hiPSC-Medium. Sammeln Sie die meisten Zellaggregate und übertragen Sie sie mit einer 5-ml-Pipette auf die neuen Platten.
    ANMERKUNG: Wenn das Protokoll konsequent angewendet wird, sollte die Originalplatte iPSC-Kolonien enthalten, die vor der Passage etwa 50% der Kulturoberfläche bedecken. In diesem Fall sollte das Split-Verhältnis von einer Platte zu fünf neuen Platten betragen. Dies muss jedoch in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen und den zelllinienspezifischen Wachstumsraten angepasst werden.
16. Schütteln Sie die frisch gesäten Platten hin und her, um die Aggregate gleichmäßig zu verteilen.
17. Übertragen Sie die Platten in einen Inkubator (37 °C und 5%_CO2) und lassen Sie sie über Nacht ungestört, um eine ordnungsgemäße Zellhaftung zu ermöglichen.
18. Führen Sie täglich einen kompletten Mediumwechsel mit 10 ml hiPSC-Medium durch. Wenn am Tag nach der Passage überschüssige Zellablagerungen vorhanden sind, waschen Sie vor dem Medienwechsel einmal mit 5 ml des Mediums.
19. Planen Sie die nächste Passage ein, wenn weiße Flächen in der Mitte der Mehrheit der iPSC-Kolonien erscheinen (Schritt 2.5). Dies geschieht 4-6 Tage nach jeder Passage.

3. Einfrieren von hiPSC

1. Führen Sie die ersten Schritte wie in den Schritten 2.5 bis 2.14 für die hiPSC-Passage durch.
2. Sammeln Sie die Zellaggregate in einem 15 ml Röhrchen und schleudern Sie bei 200 x g für 2 min.
3. Saugen Sie den Überstand ab, resuspendieren Sie das Pellet in einem Gefriermedium und übertragen Sie es mit einer 5-ml-Pipette in Kryoröhrchen.
   ANMERKUNG: Ähnlich wie bei den Passageschritten ist das übliche Split-Verhältnis eine iPSC-Platte zu fünf Kryoröhrchen, abhängig von der Dichte der Kolonien. Verwenden Sie für jede Kryoröhre ein Gesamtvolumen von 1 ml Gefriermedium.
4. Legen Sie die Kryoröhren in einen gekühlten Kryokonservierungsbehälter und bringen Sie ihn über Nacht auf -80 °C.
5. Überführen Sie die Zellen nach 24 h in flüssigen Stickstoff.

4. Auftauen von hiPSC

1. Eine 10 cm lange Platte wird mit der Basalmembranmatrix bestreichen (siehe 2.1-2.3).
2. Nehmen Sie eine iPSC-Kryoröhre aus flüssigem Stickstoff und stellen Sie sie sofort für bis zu 2 min in ein 37 °C heißes Wasserbad, um schnell aufzutauen. Schütteln Sie die Durchstechflasche im Bad, bis sie teilweise aufgetaut ist und ein kleines Stück Eis enthält, das von Flüssigkeit umgeben ist.
3. Übertragen Sie die Zellaggregate aus der Kryoröhre mit einer 1000 μL-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie bis zu 15 ml vorgewärmtes hiPSC-Medium hinzu, um das Dimethylsulfoxid (DMSO) im Gefriermedium zu verdünnen.
4. Zentrifugieren Sie das konische 15-ml-Röhrchen bei 200 x g für 2 min.
5. Der Überstand wird abgesaugt und mit einer 5-ml-Pipette das Zellpellet in einem hiPSC-Medium, das 20 μM Rho-assoziiertes Coiled-Coil-bildendes Protein Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor (ROCK-I, Verbindung Y-27632) enthält, resuspendiert, um eine weitere Verreibung der Zellaggregate zu vermeiden.
6. Übertragen Sie die Zellaggregate mit einer 5-ml-Pipette auf eine 10-cm-matrixbeschichtete Platte mit Basalmembran.
   HINWEIS: Wenn das Protokoll konsequent angewendet wird, können Zellen in einer Kryoröhre auf eine einzige 10-cm-Platte übertragen werden.
7. Schütteln Sie die Platte, um die Aggregate gleichmäßig zu verteilen.
8. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ungestört, um eine ordnungsgemäße Zellhaftung zu ermöglichen.
9. Führen Sie am Tag nach dem Auftauen einen vollständigen Mediumwechsel mit 10 mL hiPSC-Medium ohne ROCK-I durch.

5. Differenzierung von hiPSC in neuronale Vorläuferzellen (NPC) des Rückenmarks

1. Stellen Sie sicher, dass die mit einer Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platten gebrauchsfertig sind, bevor Sie mit der Differenzierung beginnen.
2. Beginnen Sie mit iPSC-Platten, die mindestens ein- und vorzugsweise zweimal nach dem Auftauen und mit mindestens vier 10-cm-Platten passiert wurden (siehe Erläuterung in Schritt 5.11).
3. Führen Sie die ersten Schritte wie in den Schritten 2.5-2.14 für die hiPSC-Passage durch.
4. Übertragen Sie die Zellaggregate von mindestens zwei 10-cm-Platten mit einer 5-ml-Pipette in ein 15-ml-Röhrchen.
5. Zentrifuge bei 200 x g für 2 min.
6. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet mit 10 ml hiPSC-Medium unter Verwendung einer 10-ml-Pipette resuspendiert und dann erneut bei 200 x g für 2 min zentrifugiert, um die Zell-Zell-Adhäsionen in jedem Aggregat zu lösen.
7. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet in 1 ml hiPSC-Medium, das 20 μM ROCK-I enthält, mit einer 1000 μL Pipette resuspendiert.
8. Pipettieren Sie mit einer 1000 μL Pipette auf und ab, um die Zellaggregate zu trituieren. Die Größe der Aggregate wird regelmäßig unter dem Mikroskop überprüft, bis der Großteil der Zellsuspension aus Einzelzellen oder kleinen Aggregaten von <10 Zellen besteht.
9. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer (bevorzugt) oder einem automatisierten Zellzähler und berechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension.
10. Platte 3,0 x 10 6 Zellen in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte, die mit Basalmembranmatrix vorbeschichtet ist. Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um die Zellsuspension zu übertragen.
    HINWEIS: Wenn das Protokoll konsequent angewendet wird, entspricht dies einem Verhältnis von zwei 10-cm-Platten zu einer einzigen Vertiefung einer 6-Well/Platte.
11. Wiederholen Sie die Schritte 5.3-5.10 mit einer zweiten Charge von zwei 10-cm-Platten und plattieren Sie das Endprodukt in eine mit einer Basalmembranmatrix beschichtete Vertiefung einer zweiten 6-Well-Platte. Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um die Zellsuspension zu übertragen.
    HINWEIS: Die ideale Ergänzung des Rückenmarks-NPC-Protokolls erfordert zwei Vertiefungen, die vier 10-cm-Platten entsprechen. Um den Arbeitsablauf zu vereinfachen, führen Sie die Schritte 5.3 bis 5.10 mit zwei Chargen von zwei Platten durch, wobei das Endprodukt jeweils aus zwei separaten 6-Well-Platten besteht und jeweils eine Vertiefung 3,0 x 10⁶ Zellen enthält.
12. Die resultierende humane iPSC-Monoschicht wird in einem hiPSC-Medium, das 20 μM ROCK-I enthält, aufrechterhalten, bis die Konfluenz >90 % erreicht, typischerweise am folgenden Tag, jedoch nicht länger als 3 Tage nach der ersten Beschichtung, um eine spontane (unkontrollierte) Differenzierung zu vermeiden.
13. Wenn die Differenzierung am Tag nach der Zellplattierung nicht begonnen werden kann, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und wechseln Sie das Medium täglich auf ein frisches hiPSC-Medium, das 20 μM ROCK-I enthält. Wenn es nicht innerhalb von 3 Tagen nach der Beschichtung >90% zusammenfließt, verwerfen Sie die Zellen und beginnen Sie das Protokoll von vorne.
14. Sobald >90% Konfluenz erreicht ist, beginnen Sie mit der Differenzierung. Dies ist Day in vitro 1 (DIV1) des Differenzierungsprotokolls.
15. Bei DIV 1 wird das hiPSC-Medium, das 20 μM ROCK-I enthält, verworfen und zweimal mit PBS gespült, um den im Stammzellmedium vorhandenen fetalen Wachstumsfaktor (FGF) und den transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGFβ) zu entfernen.
16. Wechseln Sie das Medium für 48 h in WiCell-Medium (Tabelle 1), ergänzt mit 0,2 μM LDN193189 (LDN) und 10 μM SB431542 (SB).
17. Bei DIV 3 einmal mit PBS waschen und das Medium 48 h lang auf WiCell-Medium umstellen, das mit LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + Retinsäure (RA; 1 μM) angereichert ist.
18. Bei DIV 5 einmal mit PBS waschen und das Medium 48 h lang auf WiCell: Neuronales Induktionsmedium (NIM) Base (Tabelle 1) (50%:50%, v/v) ergänzt mit LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) umstellen.
19. Führen Sie in DIV 7 einen Medienaustausch mit demselben Medium wie in Schritt 5.18 durch.
20. Auf DIV 8 einmal mit PBS waschen und das Medium 48 h lang auf WiCell:NIM-Base (50%:50%) umstellen, ergänzt mit RA (1 μM) + Puromorphamin (PMN) (1 μM) + Rekombinanter human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (10 ng/ml) + Ascorbinsäure (ASAC) (0,4 μg/ml).
21. Bei DIV 10 einmal mit PBS waschen und das Medium 48 h lang auf NIM-Basis (100%) umstellen, ergänzt wie in Schritt 5.20 beschrieben.
22. Auf DIV 11 oder 12 wird ein 25 cm² steriler Kulturkolben mit Basalmembranmatrix beschichtet, um die Passage vorzubereiten.
23. Das Medium wird aus jeder Vertiefung der 6-Well-Platte l abgesaugt und die Zellen einmal mit PBS gespült.
24. 2 ml 0,05%iges Trypsin in jede Vertiefung geben und bei 37 °C für 5-15 min inkubieren; Das intermittierende Schütteln der Platten kann bei der Zellablösung helfen.
25. Wenn die Zellen immer noch nicht in Suspension sind, lösen Sie sich mechanisch, indem Sie NIM-Medien aus einer 1000-μl-Pipettenspitze mit kreisförmiger Bewegung auf die Zellen ausstoßen (achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche zu bedecken) oder indem Sie mit einem Zellabstreifer abkratzen (nicht bevorzugt).
26. Übertragen Sie die Zellen aus 2 Vertiefungen in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie Trypsin-Inhibitor in geeignetem Verhältnis zur verwendeten Trypsinmenge mit einer 5-ml-Pipette hinzu.
27. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 2 min, saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie dann mit 10 mL NIM-Base unter Verwendung einer 10 mL Pipette.
28. Zentrifugieren Sie erneut bei 200 x g für 2 min, um die Zell-zu-Zell-Verwachsungen zu lösen.
29. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wird der Überstand entfernt und das Pellet mit 1 ml NIM-Medium (100 %), ergänzt mit RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml) und ROCK-I (20 μM), erneut suspendiert. Mit einer 1000-μl-Pipettenspitze werden die Zellen etwa fünfmal auf und ab trituuliert, bis eine trübe Suspension entsteht.
30. Die Aggregate in diesem Medium werden erneut in den mit einer Basalmembranmatrix beschichteten 25 cm 2 sterilen Kulturkolben ausgesät, so dass das Endergebnis die Kombination der Zellen aus zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte zu einem einzigen mit einer Basalmembran überzogenen 25^cm2 sterilen Kulturkolben (²:1-Durchgang) ist. Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um die Zellsuspension zu übertragen.
    HINWEIS: Die Zellen sollten zu >90% konfluent auf DIV 13 sein, und bis zum Tag 14 sind keine weiteren Schritte erforderlich. Wenn die Zellen nicht konfluent sind, bewahren Sie ROCK-I für weitere 1 oder 2 Tage in den Medien auf.
31. Bei DIV 14 wechseln Sie das Medium auf frisches NIM-Medium + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml).
32. Bei DIV 15 ändern Sie das Medium in NIM: Neural Differentiation Medium (NDM) Base (Tabelle 1) (50%:50%) mit RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/ml) + Supplement B (50x) + BDNF (10 ng/ml) + Gliazelllinien-abgeleitete neurotrophe (GDNF) (10 ng/ml) + Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) (10 ng/ml) + Ciliary neurotrophic factor (CNTF) (10 ng/ml). Wechseln Sie jeden zweiten Tag mit frischen Medien.
33. Bei DIV 21 wird das Medium wie in Schritt 5.32 auf NDM-Basis (100%) ergänzt und jeden zweiten Tag mit frischem Medium gewechselt.
34. Sammelt auf DIV 25-30 die NPCs ein und friert sie entweder ein oder führt sie zur Enddifferenzierung auf eine 10-cm-Platte.
35. Spülen Sie den T-25-Kolben mit PBS und fügen Sie 0,05% Trypsin hinzu.
36. 5 min bei 37 °C inkubieren.
37. Spülen Sie das Trypsin und die Zellen mit der NDM-Base und geben Sie es in ein konisches Röhrchen mit 15 ml. Der Trypsininhibitor wird in geeignetem Verhältnis zu Trypsin gegeben und bei 300 x g 5 min zentrifugiert.
38. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einem Motoneuron- oder Astrozytendifferenzierungsmedium (Tabelle 1) und verwenden Sie eine 1000-μl-Pipette, um nach oben und unten zu triturotieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten (normalerweise bis zu 5-mal).
39. Die Zellen werden gezählt und auf eine 10 cm lange Platte übertragen, die wie in Abschnitt 6 beschrieben beschichtet ist, wobei entweder das Differenzierungsmedium +Rock-I verwendet wird, um hiPSC-MN und hiPSC-A zu unterscheiden.
40. Alternativ können die Kulturen eingefroren werden, indem man sie in einem Gefriermedium resuspendiert, das aus 90% NDM-Medium mit Wachstumsfaktoren (wie in den Schritten 5.32-5.33) und 10% DMSO besteht, auf ähnliche Weise trituieren und dann in eine Kryoröhre überführen. Aliquot 6 x 10⁶ NPC pro Kryoröhre.

6. NPC-Kulturen auftauen

1. Beschichten Sie 10 cm Platten mit Polyornithin (PLO) und Laminin am Tag vor dem Auftauen der Zellen.
   1. 5 ml PLO verdünnt auf 100 μg/ml in PBS oder destilliertem Wasser (_dH2O) auf die Platten geben. Bei 37 °C mindestens 1 h bis über Nacht inkubieren.
   2. Saugen Sie die PLO-Lösung ab und spülen Sie die Platten dreimal mit PBS ab. (PLO ist giftig, wenn es nicht richtig gewaschen wird.)
   3. In PBS verdünntes Laminin in einer Konzentration von 10 μg/ml auf die PLO-beschichteten Platten geben. Bei 37 °C mindestens 1 h, vorzugsweise über Nacht, inkubieren. Nach der Inkubation die Lamininlösung ohne Spülen absaugen, um die Zelladhäsion zu verbessern.
      HINWEIS: Die Platten können vorab mit PLO beschichtet, dreimal mit Wasser gewaschen, in einer sterilen Haube getrocknet und bei 4 °C gelagert werden.
2. Eine NPC-Durchstechflasche (d. h. DIV 25 oder 30) mit 6 x 10⁶ Zellen/Durchstechflasche für jede 10-cm-Zellkulturplatte auftauen.
3. Entfernen Sie die NPC-Kryoröhre aus flüssigem Stickstoff und stellen Sie sie sofort für bis zu 2 min in ein 37 °C heißes Wasserbad. Tauen Sie schnell auf, indem Sie die Durchstechflasche schütteln, bis ein kleines Eisstück von Flüssigkeit umgeben ist.
4. Übertragen Sie die Zellaggregate mit einer 1000-μL-Pipette in einen 15-ml-Konus und fügen Sie bis zu 15 ml vorgewärmtes NDM oder Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 Supplement hinzu, um das DMSO zu verdünnen.
5. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
6. Saugen Sie den Überstand ab, resuspendieren Sie das Zellpellet entweder mit Astrozyten oder MN-Differenzierungsmedium (Tabelle 1) + ROCK-I (20 μM) und verwenden Sie eine 1000-μL-Pipette, um auf und ab zu trituieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird (bis zu 5-mal).
7. Übertragen Sie die einzellige Suspension auf eine 10 cm PLO-Laminin-beschichtete Platte.
8. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ungestört, um eine ordnungsgemäße Zellhaftung zu ermöglichen.

7. Differenzierung von Rückenmarks-NPC in Motoneuronen

1. Führen Sie die ersten Schritte wie in den Schritten 6.1-6.8 beschrieben durch, wobei das letzte Medium MN-Differenzierungsmedium + ROCK-I (20 μM) ist.
2. Führen Sie am Tag nach der Beschichtung einen vollständigen Austausch des Mediums mit einem MN-Differenzierungsmedium ohne ROCK-I durch und wechseln Sie dann das Medium jeden zweiten Tag. Am Wochenende ernähren Sie die Zellen am Freitag und dann wieder am Montag. Spülen Sie die Zellen bei Bedarf mit PBS ab, um Zelltrümmer zu entfernen.
3. Wechseln Sie das Medium mit MN-Differenzierungsmedium + Cytosin-Arabinosid (ARA-C) (0,02 μM) und inkubieren Sie für 48 h, wenn gliale Vorläuferzellen als einzelne proliferierende flache Zellen unter post-mitotischen MN-Vorläuferzellen auftreten, die in Zellclustern aggregiert sind.
   HINWEIS: In der Regel tritt dies innerhalb der ersten 7 Tage nach der ersten Beschichtung auf, obwohl es je nach Zelllinie zu Schwankungen kommen kann.
4. Nach 48 h wird das ARA-C-haltige Medium abgesaugt, die Kulturen dreimal vorsichtig mit PBS gespült und das Medium auf frisches MN-Medium ohne ARA-C umgestellt.
5. Führen Sie nach der Behandlung mit ARA-C jeden zweiten Tag (oder Montag, Mittwoch und Freitag) einen Mediumsaustausch durch, indem Sie das alte Medium mit einer manuellen Pipette anstelle eines Vakuumsaugers entfernen, um eine vorzeitige Ablösung der neuronalen Cluster zu verhindern. Darüber hinaus wird das MN-Medium einmal wöchentlich mit Laminin 1 μg/ml angereichert, um die neuronale Bindung an die Kulturplatten weiter zu verbessern.

8. Unterscheidung von NPC in Rückenmarks-Astrozyten

1. Auftauen von NPC-Kulturen wie in Abschnitt 6 unter Verwendung von Astrozyten-Differenzierungsmedium (Tabelle 1) unter Zugabe von fetalem Rinderserum (FBS) mit einem Volumen für die Volumenkonzentration von 1% (NS + 1% FBS) sowie ROCK-I (20 μM) für die Beschichtung.
   HINWEIS: Kommerziell erhältlicher Serumersatz (Tabelle 1) kann FBS mit den gleichen Verdünnungsfaktoren ersetzen.
2. Am Tag nach der Beschichtung das Kulturmedium mit NS + 1% FBS-Medium ohne ROCK-Inhibitor wechseln und dann das Medium jeden zweiten Tag wechseln. Am Wochenende die Zellen am Freitag und dann wieder am Montag füttern. Spülen Sie die Zellen bei Bedarf mit PBS ab, um Zelltrümmer zu entfernen. Wenn die Zellen weiter absterben, ergänzen Sie Medien mit ROCK-I (10 μM), um das Überleben der Zellen zu fördern. Seien Sie vorsichtig, ROCK-I nicht zu oft oder zu lange zu verwenden, da das Potenzial besteht, unsterbliche Zellen auszuwählen.
3. Lassen Sie die Astrozyten konfluent werden, bevor Sie sie passieren.
   HINWEIS: Die Zellengröße nimmt im Laufe der Zeit zu, daher gibt es keine festgelegte Anzahl für den Durchgang. Das typische Passaging-Verhältnis ist 1:2 oder 1:3. Im Falle eines schlechten Überlebens oder des Passierens von zu vielen Platten, kombinieren Sie zwei (oder mehr, je nach Bedarf) 10-cm-Platten zu einer 10-cm-Platte, um die Konfluenz zu erhalten.
4. Um Astrozyten-Vorläuferkulturen zu passieren, waschen Sie die Platten einmal mit PBS (um FBS zu entfernen), inkubieren Sie mit 0,05% Trypsin für 5 min, sammeln Sie die Zellen in NS-Medium + 1% FBS (FBS inaktiviert Trypsin) und zentrifugieren Sie dann bei 300 x g für 5 min. Saugen Sie den Überstand ab, resuspendieren Sie die Zellen in NS-Medium + 1% FBS und trituieren Sie dann zu einer einzelligen Suspension. Verteilen Sie Zellen in NS + 1% FBS auf neue 10 cm Platten.
   HINWEIS: Neben der Erweiterung von Astrozytenkulturen dient das wiederholte Passieren von Platten dem Zweck, alle verbleibenden Vorläuferzellen zu töten, die sich für ein neuronales Schicksal entschieden haben. Selbst wenn es keine sehr hohe Mitoserate gibt, können Platten im Verhältnis 1:1 durchquert werden, wenn eine neuronale Kontamination vorliegt.
5. Wechseln Sie die Beschichtung im Laufe der Differenzierung, um die Ausbeute wie folgt zu erhöhen.
   1. Die anfänglich aufgetauten NPC-Kulturen und die ersten Passagen nach der ersten Plattierung auf PLO/Laminin plattieren.
   2. Platten Sie die unreifen Astrozyten auf mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten.
   3. Platten reifere Astrozyten (d.h. nach Tag 90) entweder auf Basalmembranmatrix, PLO / Laminin-beschichteten Platten (typischerweise für Co-Kultur mit Neuronen) oder auf unbeschichteten Platten.
6. Frieren Sie die Vorläuferzellen der Astrozyten zu einem beliebigen Zeitpunkt während der 60-tägigen Reifezeit ein, um Kulturen zu synchronisieren oder für spätere Experimente aufzubewahren. Wenn Sie über das NPC-Stadium hinaus auftauen, tauen Sie die Vorläuferzellen der Astrozyten auf die mit der Basalmembranmatrix beschichteten Platten auf und nicht auf PLO / Laminin.
7. Bei DIV 90 und danach wird das Medium von NS + 1% FBS auf NS + 5% FBS umgestellt, um das Überleben der Astrozyten zu fördern und ihre Proliferation zu verringern.

9. Co-Kultivierung von MN- und Rückenmarks-Astrozyten in Multi-Elektroden-Array-Platten

1. Differenzieren und plattieren Sie die Motoneuronen und Astrozyten, wenn sie am selben Tag einsatzbereit sind und auf DIV 60 für die Motoneuronen und DIV 90 für die Astrozyten gealtert sind.
2. Beschichten Sie die MEA-Platten am Tag vor oder am Tag der Beschichtung wie folgt, wenn Sie mit 24-Well-Kunststoffplatten arbeiten (Materialtabelle).
3. PLO in Wasser oder PBS auf 100 μg/ml verdünnen.
   1. Geben Sie 15-20 μL in jede Vertiefung (abhängig vom Pipettenkomfortniveau) und bilden Sie einen Tropfen in der Mitte der Vertiefung, der den Bereich der Elektroden und die Umgebung, aber nicht die gesamte Vertiefung bedeckt.
   2. Achten Sie darauf, die Elektroden mit der Pipettenspitze nicht zu beschädigen. Achten Sie auf das Volumen von Bohrloch zu Bohrloch, um sicherzustellen, dass in jedem Bohrloch die gleiche Oberfläche abgedeckt wird.
   3. PLO wird bei 37 °C für mindestens 1 h (vorzugsweise 2 h) inkubiert.
      HINWEIS: Die kleinen Volumina trocknen aus, wenn nicht genügend Feuchtigkeit in den Platten vorhanden ist. Geben Sie Wasser in die Kammern rund um die Brunnen, um eine ausreichende Feuchtigkeit während der gesamten Beschichtung und Aufzeichnung zu gewährleisten.
4. Saugen Sie so viel PLO wie möglich mit einer Mikropipettenspitze aus Kunststoff ab. Achten Sie darauf, die Elektroden nicht zu berühren. Dreimal mit 250 μL Wasser waschen. Wenn Sie einen Vakuumsauger zum Waschen verwenden, lassen Sie die Spitze nicht in die Nähe des Elektrodenarrays. Entfernen Sie nach der dritten Wäsche so viel Wasser wie möglich und verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze. Lassen Sie die Oberfläche unter der Zellkulturhaube trocknen, wobei der Deckel entfernt wurde.
5. Sobald die Plattenoberflächen trocken sind, fügen Sie auf 10 μg/ml verdünntes Laminin in PBS hinzu. Verwenden Sie 15-20 μL, um jedes Elektrodenarray abzudecken. Geben Sie Wasser in die Feuchtigkeitsfächer, setzen Sie den Deckel wieder auf und stellen Sie die Platte für mindestens 2 h bis über Nacht auf 37 °C Inkubation.
6. Am Tag der Beschichtung werden die MN- und Astrozytenkulturen einmal mit PBS gespült und 0,05 % Trypsin bei 37 °C zugegeben, um die Zellen zu straffen (5 min). Sammeln Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit Trypsin-Inhibitor und waschen Sie Platten mit Medium oder Basis, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min und resuspendieren Sie mit einer 1000 μL Pipette, um 1 ml einer einzelligen Suspension zu erzeugen. Wechseln Sie bei der Resuspension von MN und Astrozyten auf das Co-Kulturmedium (Tabelle 1) unter Zugabe von 20 μM ROCK-I.
7. Zählen Sie die MN und die Astrozyten parallel mit einem Hämozytometer. Während des Zählens und Rechnens verschließen Sie die Zellsuspensionen und legen Sie sie bei 4 °C in ein Styroporgestell.
8. Berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um die Kulturen auf eine Konzentration von 5 x 10 4 Zellen pro 5 μL für Motoneuronen und 2,5 x 10⁴ Zellen pro 5 μL für Astrozyten zu resuspendieren. Die 1-ml-Zellsuspensionen werden bei 300 x g 5 min lang zentrifugiert und im berechneten Volumen resuspendiert.
9. Berechnen Sie die Anzahl der gewünschten Vertiefungen, die ausgesät werden sollen, und multiplizieren Sie sie mit 5 μL jeder Zellsuspension. Kombinieren Sie das erforderliche Volumen an Neuronen- und Astrozytensuspensionen im Verhältnis 1: 1 und mischen Sie durch Pipettieren, bis es vollständig vermischt ist (normalerweise zweimal), aber vermeiden Sie es, zu aggressiv zu sein.
10. Entfernen Sie das Laminin mit einer Pipettenspitze aus jeder Vertiefung der MEA-Platte. Übertragen Sie 10 μL der endgültigen kombinierten Zellsuspension in jede Vertiefung und bilden Sie ein kleines Tröpfchen, das das Elektrodenarray bedeckt, um eine Zelldichte von 5 x 10 4 MN und 2,5 x 10⁴ Astrozyten pro Vertiefung zu erhalten.
    HINWEIS: Eine hohe Zelldichte in der kombinierten Suspension erfordert eine häufige Resuspension zwischen den Vertiefungen während des Seeding-Schritts, um genaue und konsistente Zellzahlen zu gewährleisten.
11. Geben Sie die Platten für 20-30 Minuten in den Inkubator zurück. Achten Sie darauf, das Zelltröpfchen nicht zu stören und lassen Sie die Zellen erste Anhaftungen auf den Platten bilden.
12. Nach 20-30 Minuten fügen Sie warme Co-Culture-Medien + ROCK-I zu jeder Vertiefung hinzu, indem Sie 250 μl auf die Wand jeder Vertiefung pipettieren, gefolgt von weiteren 250 μl an der Wand derselben Vertiefung auf der gegenüberliegenden Seite. Legen Sie die Platte zurück in den Inkubator.
13. Untersuchen Sie die Platten am Tag nach der Aussaat (Co-Kultur Tag 1). Wenn signifikante Zelltrümmer oder abgestorbene Zellen vorhanden sind, tauschen Sie das Medium gegen ein frisches Co-Kulturmedium aus, das ROCK-I enthält. Andernfalls wechseln Sie das Medium am zweiten Tag nach der Aussaat (Co-Culture Day 2) auf das Co-Kulturmedium ohne ROCK-I. Führen Sie zweimal pro Woche einen Austausch zwischen halbem und mittlerem Medium durch (50% aspirieren und 60% des Endvolumens hinzufügen, um die Verdunstung zu berücksichtigen).
14. Bei Verwendung von MEA-Systemen mit 30-mm-Glasplatten mit einer Vertiefung (Materialtabelle) kann die Plattenvorbereitung 2 oder mehr Tage dauern. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um dies auszuführen.
15. Heben Sie die Zellen und Zelltrümmer aus den vorherigen MEA-Kulturen mit 0,05% Trypsin für 5-15 Minuten an.
16. Trypsin absaugen und dreimal mit Wasser abspülen.
17. Mit 70% Ethanol sterilisieren und 10 Minuten in der Haube inkubieren. Saugen Sie das Ethanol ab und spülen Sie es dann dreimal mit Wasser ab.
18. Tragen Sie 1% anionisches Reinigungsmittel mit Protease-Enzym in Wasser auf. Decken Sie die Teller mit einem Deckel ab und wickeln Sie sie mit thermoplastischer Folie und Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie dann über Nacht bei Raumtemperatur auf einer Wippe stehen.
19. Das Reinigungsmittel absaugen und dann dreimal mit Wasser abspülen.
20. Wenn Sie die Platten aufbewahren möchten, fügen Sie eine ausreichende Menge Wasser hinzu. Decken Sie die Teller mit einem Deckel ab und wickeln Sie sie mit thermoplastischer Folie und Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie bis zum nächsten Gebrauch im Kühlschrank.
21. Wenn Sie beschichten möchten, lassen Sie die Oberfläche unter der Zellkulturhaube trocknen.
22. Wenn eine zusätzliche Sterilisation erforderlich ist (z. B. bei früherer Infektion oder nicht kürzlicher Verwendung), setzen Sie die MEA-Platten nur an dieser Stelle 30-60 Minuten lang ultraviolettem (UV) Licht unter der Haube aus.
    HINWEIS: Durch die Vermeidung von häufigem UV-Licht werden Schäden an den Elektroden vermieden. Die Verwendung von UV-Licht, wenn Platten Serum enthalten, führt zu nicht funktionsfähigen Elektroden, weshalb es nur auf gereinigten Platten verwendet werden sollte.
23. Wenn die Platten vollständig trocken sind, fahren Sie mit der Plasmareinigung für 1 Minute fort, um die Glasoberfläche der MEA-Platten aufzuladen und die Wirksamkeit der Beschichtung zu verbessern. Plasmareinigung mindestens einmal alle 4-5 Zyklen der MEA-Plattenreinigungs- und Beschichtungszyklen.
    1. Wenn eine Plasmareinigung nicht möglich oder nicht gerechtfertigt ist, fügen Sie alternativ eine ausreichende Menge FBS-haltiges Medium hinzu, um die Oberfläche der MEA-Platten zu bedecken, und bringen Sie sie über Nacht in den Inkubator zurück.
24. Verwenden Sie die PLO/Laminin-Beschichtung wie oben in Abschnitt 6 beschrieben. Unmittelbar nach der Plasmareinigung oder dem Absaugen und Ausspülen des FBS-haltigen Mediums PLO-Lösung (100 μg in PBS) zugeben.
25. Die Zellen werden wie oben beschrieben mit folgenden Dichten plattiert: 1 x 10 5 hiPSC-A / Platte und 5 x 10⁵ hiPSC-MN/Platte.

10. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnung

1. Extrahieren Sie die Rohspannungsdaten mit einer Abtastfrequenz von 12,5 kHz mit einem Butterworth-Filter mit einem 200-Hz-Hochpass- und einem 3-kHz-Tiefpassfilter. Legen Sie die Spitzenerkennung als momentane Zeitpunkte von Spannungen ≥6 Standardabweichungen von der Basislinie fest. Identifizieren Sie Bursts als Aktivität mit >5 Spitzen in 100 ms. Definieren Sie die Netzwerkaktivität, wenn mehr als 35 % der gesamten aktiven Elektroden innerhalb von 100 ms mit mindestens 50 Spitzen pro Netzwerk-Burst ausgelöst werden.
2. Beginnen Sie so schnell wie möglich nach Co-Culture (CC) Tag 1 mit der Aufnahme.
   HINWEIS: Elektrische Aktivität wird selten vor CC Tag 3 festgestellt.
3. Plattenparallele Kulturen mit ähnlichen Dichten und Replikationen in den entsprechenden Kulturplatten oder Deckgläsern für biochemische Assays, Immunzytochemie (ICC) oder qPCR.
4. Führen Sie Aufnahmen mit einer Temperatur von 37 °C ad CO₂ bei 5 % durch. Übergeben Sie die Platten an das Gerät und lassen Sie sie vor der Aufzeichnung mindestens 5 Minuten lang äquilibrieren.
5. Aufzeichnung der Baseline-Aktivität entweder jeden zweiten Tag oder wöchentlich, je nach Versuchsdesign über 1-15 Minuten. Nehmen Sie nach einem Medienaustausch mindestens 1 Stunde nicht auf und warten Sie idealerweise nach jedem Medienaustausch 24 Stunden.
6. Um eine Kontamination zu vermeiden, ist das Medium (d. h. halber Medienwechsel wie in Schritt 9.14) nach jeder Aufzeichnung zu wechseln, bei der der Deckel der sterilen Platte außerhalb der sterilen Haube geöffnet werden muss (d. h. das Auftragen von Arzneimittelverbindungen). Führen Sie einen vollständigen Medienaustausch und Waschen durch, um Medikamente auszuwaschen, wenn die Platten über die medikamentöse Behandlung hinaus weiterhin verwendet werden.
7. Zu Analysezwecken sind für jeden Zustand mindestens drei technische und biologische Wiederholungen zu verwenden. Drücken Sie elektrophysiologische Daten als Mittel von n ≥ 3 Replikationen aus.

11. Pharmakologische Assays auf Multi-Elektroden-Arrays

1. Verwenden Sie je nach experimenteller Fragestellung eine andere Kombination von Kokulturen: ALS-Neuronen mit Kontroll-Astrozyten, Kontrollneuronen mit ALS-Astrozyten, ALS-Neuronen und Astrozyten, Kontrollneuronen und Astrozyten.
2. Bei der Untersuchung vorübergehender elektrophysiologischer Wirkungen von Verbindungen, die entweder auf Neuronen oder Astrozyten abzielen, ist die Basisaktivität für mindestens 1 Minute aufzuzeichnen, wobei der Plattendeckel abgenommen, der Maschinendeckel jedoch geschlossen ist.
3. Öffnen Sie den Deckel der Maschine manuell, ohne die elektrophysiologische Aufzeichnung zu unterbrechen, und tauschen Sie 25 μl Medium mit dem entsprechenden Medikamentenvehikel (in der Regel frisches Medium) mit einer Mehrkanalpipette aus, wenn Sie mehrere Vertiefungen behandeln. Schließen Sie den Deckel manuell.
4. Zeichnen Sie für weitere 1 Minute auf (oder länger, wenn es signifikante fahrzeugbedingte Veränderungen gibt, von denen sich die Kultur erholen muss).
5. Öffnen Sie den Deckel manuell wieder und tauschen Sie 25 μL Medium mit dem interessierenden Medikament im selben Vehikel aus. Schließen Sie den Deckel des Geräts und setzen Sie die Aufzeichnung fort.
   HINWEIS: Die Dauer der Aufzeichnung und das Volumen des verabreichten Arzneimittels/Vehikels können je nach experimenteller Fragestellung variieren oder müssen optimiert werden.
6. Zu Analysezwecken ist sicherzustellen, dass die Zugabe des Fahrzeugs keine signifikanten Änderungen der elektrophysiologischen Parameter hervorruft. Berechnen Sie prozentuale Veränderungen der Aktivität nach der Droge im Vergleich zu nach der Zugabe des Vehikels und vergleichen Sie die Bedingungen.
7. Um longitudinale elektrophysiologische Effekte, wie z. B. krankheitsmodifizierende Arzneimittelkandidaten, zu untersuchen, ist die in Schritt 11.2 beschriebene Basisaktivität aufzuzeichnen. Verwenden Sie dazu entweder das Co-Kulturmedium, das den/die interessierende(n) Wirkstoff(e) enthält, in dem entsprechenden Vehikel oder das Medium, das nur das Vehikel enthält.
8. Vergleichen Sie zu Analysezwecken die Zeitpunktaufzeichnungen von ALS- oder Kontroll-Cokulturen, die longitudinal mit Medikamenten behandelt wurden, miteinander und unter Kontrollbedingungen.

Ergebnisse

Das Protokoll zur Musterung des Rückenmarks für die Erzeugung von hiPSC-MN und hiPSC-A des Rückenmarks ist in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Protokoll werden hiPS-Zellen beibehalten und als nicht-konfluente Kolonien durchgelassen (Abbildung 2A). Die Neurogenese wird (neuronale Induktion) durch duale SMAD-Hemmung durch die Zugabe von LDN193189 und SB431542 initiiert, wodurch das knochenmorphogenetische Protein (BMP) bzw. der transformierende Wachstumsfakto...

Diskussion

Bisher haben hiPSC- und MEA-basierte Methoden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung von Astrozyten-Neuronen-Kokulturen im Bereich der ALS⁶ nur begrenzte Anwendung gefunden und sind im Gegensatz zu ihrer weiter verbreiteten Verwendung für die In-vitro-Modellierung von Epilepsie⁹ noch nicht vollständig auf humanen Plattformen anwendbar. Diese Plattform hat jedoch das Potenzial, pathophysiologisch relevante Fragen in der ALS-Forschung zu beantworten, wie z.B. die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp