Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

Riepilogo

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Abstract

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) forniscono un potente strumento per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro. Le registrazioni multi-electrode array (MEA) sono un mezzo per registrare i potenziali di campo elettrico da grandi popolazioni di neuroni e analizzare l'attività della rete nel tempo. È stato precedentemente dimostrato che la presenza di hiPSC-A che sono differenziati utilizzando tecniche per promuovere un fenotipo astrocitario del midollo spinale ha migliorato la maturazione e l'attività elettrofisiologica dei motoneuroni (MN) del midollo spinale specifici a livello regionale rispetto a quelli coltivati senza hiPSC-A o in presenza di astrociti roditori. Qui è descritto un metodo per co-coltivare il midollo spinale hiPSC-A con hiPSC-MN e registrare l'attività elettrofisiologica utilizzando registrazioni MEA. Mentre i protocolli di differenziazione qui descritti sono particolari per astrociti e neuroni che sono specifici a livello regionale per il midollo spinale, la piattaforma di co-coltura può essere applicata ad astrociti e neuroni differenziati con tecniche specifiche per altri destini, tra cui hiPSC-A corticale e hiPSC-N. Questi protocolli mirano a fornire un saggio elettrofisiologico per informare sulle interazioni glia-neurone e fornire una piattaforma per testare farmaci con potenziale terapeutico nella SLA.

Introduzione

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) sono potenti strumenti per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro e forniscono un paradigma traslazionale per le strategie di scoperta di farmaci¹. I ricercatori hanno dimostrato che la co-coltura di hiPSC-A con hiPSC-N migliora la maturazione morfologica, molecolare, elettrofisiologica e farmacologica di entrambi i tipi di cellule, generando complesse reti neuronali e interazioni astrocita-neurone che assomigliano alle loro controparti in vivo ^2,3. Simili esperimenti di co-coltura possono ricapitolare i segni distintivi della patobiologia della SLA come la neurotossicità mediata dagli astrociti ^4,5 e l'ipereccitabilità neuronale⁶. Inoltre, con i progressi nei protocolli di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) possono essere differenziate in sottotipi neurali specifici a livello regionale, tra cui hiPSC-A e hiPSC-N ^7,8 del midollo spinale e corticale. Queste strategie forniscono il potenziale per modellare la patologia del motoneurone corticale e spinale nella SLA, nonché l'influenza astrocitaria su entrambi. Tuttavia, ciò richiede che esista un saggio funzionale riproducibile per determinare questi effetti.

Recentemente è stato dimostrato che la registrazione multi-electrode array (MEA) è particolarmente adatta per la caratterizzazione elettrofisiologica di co-colture neurone-astrocitario². A differenza delle analisi elettrofisiologiche a singola cellula, questi array di elettrodi ad alta densità registrano passivamente i potenziali di campo extracellulare da grandi popolazioni di neuroni senza interrompere le condizioni di coltura e preservare l'integrità delle membrane cellulari. Queste piattaforme sono particolarmente utili per registrare l'attività cellulare e di rete delle colture nel tempo e in risposta alla manipolazione farmacologica. Infine, quando la presenza di astrociti è una variabile di coltura, le registrazioni MEA possono fornire informazioni funzionali sulle interazioni bidirezionali astrocita-neurone ^2,9.

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSC in hiPSC-A del midollo spinale e hiPSC-motoneuroni (MN) che è stato precedentemente convalidato². Il protocollo di differenziazione hiPSC-A del midollo spinale produce costantemente colture di astrociti, che sono positive per la proteina B legante il calcio S100 (S100β), la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l'omeobox B4 (HOXB4) fino all'80%, 50% e 90% delle cellule, rispettivamente, indicando una specifica della maturazione gliale e del midollo spinale ^2,10 . Il protocollo di differenziazione hiPSC-MN genera neuroni che sono positivi al >90% per la colina acetiltransferasi (ChAT), suggerendo un'identità matura del neurone alfa-motorio². Inoltre, il protocollo descrive le tecniche per la generazione di co-colture hiPSC-A/MN precedentemente dimostrate per produrre neuroni con maggiore complessità morfologica mediante analisi Scholl e microscopia immunofluorescente rispetto a colture neuronali senza astrociti o con astrociti roditori². Mentre queste descrizioni sono specifiche per il midollo spinale hiPSC-A e hiPSC-N, un vantaggio unico è che la coltura indipendente iniziale di astrociti e neuroni seguita da passaggi di co-coltura in momenti successivi può essere tradotta per studiare gli effetti delle interazioni neurone-astrocita da altre regioni specifiche e cellule specifiche della malattia ^7,8 . Infine, il protocollo descrive come coltivare queste colture su piastre MEA in modo che l'attività funzionale come fattore di composizione della co-coltura possa essere studiata nel tempo con la capacità di manipolare la composizione cellulare e le condizioni di coltura.

L'obiettivo di questi protocolli è quello di fornire un saggio funzionale per studiare le interazioni astrocita-neurone, esaminare i cambiamenti specifici della malattia e testare farmaci con potenziale terapeutico nel campo della SLA. Vengono fornite istruzioni video per i passaggi più impegnativi di questo protocollo.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura cellulare

1. Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando le composizioni menzionate nella Tabella 1.
2. Miscelare e sterilizzare il materiale filtrato in flaconi filtrati da 500 ml e conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Mantenimento e passaggio delle cellule staminali pluripotenti indotte umane non confluenti (hiPSC)

1. Scongelare la matrice della membrana basale (conservata in aliquote a -80 °C) in un frigorifero a 2-8 °C durante la notte.
2. Diluire la matrice della membrana basale a 1:100 (v/v) in soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) o DMEM (Modified Eagles Medium) di Dulbecco.
3. Aggiungere una quantità sufficiente di matrice di membrana basale per rivestire il fondo della piastra di coltura tissutale (5 ml per una piastra da 10 cm, 2 ml per pozzetti singoli di piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C per un minimo di 30 minuti durante la notte o a temperatura ambiente per un minimo di 1 ora.
4. Aspirare la matrice della membrana basale diluita e lavare la piastra una volta con PBS prima di aggiungere terreni di coltura e cellule di semina.
5. Esaminare le piastre ogni giorno per determinare e anticipare quando sono pronte per essere passate. Piastre di passaggio di hiPSC una volta che la maggior parte delle colonie sono diventate sufficientemente dense in modo che il centro delle colonie mostri aree bianche sparse. Non lasciare che le piastre maturino oltre questo punto. Causerà un'eccessiva differenziazione che porterà alla comparsa di un'area gialla al centro delle colonie a causa del multistrato cellulare, della sovrabbondanza di cellule allungate ai bordi, della compattezza sciolta all'interno delle colonie o dell'aumento della morte cellulare.
6. Il giorno del passaggio, disegna le linee della griglia sulla superficie esterna inferiore delle piastre con un pennarello per facilitare la copertura accurata dell'intera piastra.
7. Staccare le colonie differenziate in una cappa di coltura utilizzando un microscopio a contrasto di fase (ingrandimento 10x) raschiando manualmente con una punta per pipetta da 200 μL.
8. Risciacquare le piastre due volte con PBS (5 ml per lavaggio per piastre da 10 cm).
9. Aggiungere 5 mL di proteasi di dissociazione tissutale preriscaldata (Table of Materials) e incubare le cellule a 37 °C fino a quando i bordi delle colonie iniziano ad arrotondarsi (4-7 min), ma prima che le colonie si sollevino dalla piastra.
10. Aspirare con attenzione la proteasi di dissociazione. Risciacquare delicatamente la piastra due volte con PBS, facendo attenzione a non rimuovere le colonie.
11. Aggiungere 5 ml di terreno hiPSC preriscaldato (Tabella 1) alla piastra di coltura.
12. Sollevare le colonie mentre le si suddivide in aggregati cellulari più piccoli grattando l'intera piastra con la punta di una pipetta da 5 ml usando un movimento avanti e indietro dall'alto verso il basso.
13. Ruotare la piastra di 90° e ripetere il passaggio precedente.
14. Triturare delicatamente gli aggregati cellulari mediante pipettaggio su e giù con una pipetta da 5 ml e controllare periodicamente la dimensione degli aggregati al microscopio fino a quando la maggior parte degli aggregati cellulari sono circa 50-100 cellule.
15. Seminare gli aggregati cellulari nelle piastre della matrice della membrana basale pre-rivestite, utilizzando un mezzo hiPSC aggiuntivo per lavare la piastra originale. Raccogliere e trasferire la maggior parte degli aggregati cellulari nelle nuove piastre utilizzando una pipetta da 5 ml.
    NOTA: Se il protocollo viene applicato in modo coerente, la piastra originale deve contenere colonie di iPSC che coprono circa il 50% della superficie di coltura prima del passaggio. In questo caso, il rapporto di divisione dovrebbe essere da una piastra a cinque nuove piastre. Tuttavia, potrebbe essere necessario aggiustare questo a seconda delle condizioni di crescita e dei tassi di crescita specifici della linea cellulare.
16. Agitare le piastre appena seminate avanti e indietro per distribuire uniformemente gli aggregati.
17. Trasferire le piastre in un incubatore (37 °C e 5% di CO₂) e lasciarle indisturbate per una notte per consentire una corretta adesione cellulare.
18. Eseguire un cambio completo del fluido ogni giorno con 10 mL di mezzo hiPSC. Se c'è un eccesso di detriti cellulari il giorno successivo al passaggio, lavare una volta con 5 ml del mezzo prima del cambio del supporto.
19. Pianifica il passaggio successivo quando le aree bianche appaiono al centro della maggior parte delle colonie iPSC (passo 2.5). Ciò avverrà 4-6 giorni dopo ogni passaggio.

3. Congelamento hiPSC

1. Eseguire i passaggi iniziali come nei passaggi 2.5-2.14 per il passaggio hiPSC.
2. Raccogliere gli aggregati cellulari in una provetta da 15 ml e ruotare a 200 x g per 2 minuti.
3. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet in un mezzo di congelamento e trasferirlo ai criotubi utilizzando una pipetta da 5 ml.
   NOTA: Analogamente ai passaggi di passaggio, il solito rapporto di divisione è di una piastra iPSC per cinque criotubi, a seconda della densità delle colonie. Utilizzare un volume totale di 1 mL di mezzo di congelamento per ciascun criotubo.
4. Collocare i criotubi in un contenitore di crioconservazione refrigerato e trasferirlo a -80 °C durante la notte.
5. Trasferire le cellule in azoto liquido dopo 24 ore.

4. Scongelamento hiPSC

1. Rivestire una lastra di 10 cm con la matrice della membrana basale (vedi 2.1-2.3).
2. Rimuovere un criotubo iPSC dall'azoto liquido e metterlo immediatamente in un bagno d'acqua a 37 °C per un massimo di 2 minuti per scongelarsi rapidamente. Agitare il flaconcino nella vasca da bagno fino a quando non è parzialmente scongelato e contiene un piccolo pezzo di ghiaccio circondato da liquido.
3. Trasferire gli aggregati cellulari dal criotubo a un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta da 1000 μL. Aggiungere fino a 15 ml di mezzo hiPSC preriscaldato per diluire il dimetilsolfossido (DMSO) nel mezzo di congelamento.
4. Centrifugare il tubo conico da 15 mL a 200 x g per 2 minuti.
5. Aspirare il surnatante e utilizzare una pipetta da 5 mL per risospendere il pellet cellulare in mezzo hiPSC contenente 20 μM di inibitore della serina/treonina chinasi della proteina a bobina associata a Rho (ROCK-I, composto Y-27632) per evitare ulteriori triturazioni di aggregati cellulari.
6. Trasferire gli aggregati cellulari su una piastra da 10 cm rivestita con matrice di membrana basale utilizzando una pipetta da 5 ml.
   NOTA: Se il protocollo viene applicato in modo coerente, le cellule in un criotubo possono essere trasferite su una singola piastra di 10 cm.
7. Agitare la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati.
8. Trasferire la piastra in un'incubatrice e lasciarla indisturbata per tutta la notte per consentire una corretta adesione cellulare.
9. Eseguire un cambio completo del fluido il giorno dopo lo scongelamento con 10 mL di mezzo hiPSC senza ROCK-I.

5. Differenziazione dell'hiPSC in cellule progenitrici neurali del midollo spinale (NPC)

1. Assicurarsi che le piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale siano pronte all'uso prima di iniziare la differenziazione.
2. Iniziare con iPSC che sono state fatte passare almeno una volta e preferibilmente due volte dopo lo scongelamento e con almeno quattro piastre da 10 cm (vedere la spiegazione al punto 5.11).
3. Eseguire i passaggi iniziali come nei passaggi 2.5-2.14 per il passaggio hiPSC.
4. Trasferire gli aggregati cellulari da almeno due piastre da 10 cm in una provetta da 15 mL utilizzando una pipetta da 5 ml.
5. Centrifugare a 200 x g per 2 min.
6. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 mL di mezzo hiPSC utilizzando una pipetta da 10 ml, quindi centrifugare nuovamente a 200 x g per 2 minuti per allentare le aderenze cellula-cellula in ciascun aggregato.
7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo hiPSC contenente 20 μM di ROCK-I utilizzando una pipetta da 1000 μL.
8. Pipettare su e giù con una pipetta da 1000 μL per triturare gli aggregati cellulari. Controllare periodicamente la dimensione degli aggregati al microscopio fino a quando la maggior parte della sospensione cellulare comprende singole cellule o piccoli aggregati di <10 cellule.
9. Contare le cellule con un emocitometro (preferito) o un contatore cellulare automatizzato e calcolare la densità cellulare nella sospensione cellulare.
10. Piastra 3,0 x 10 6 celle in ciascun pozzetto di una piastra a⁶ pozzetti pre-rivestita con matrice di membrana basale. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per trasferire la sospensione cellulare.
    NOTA: Se il protocollo viene applicato in modo coerente, ciò corrisponde a un rapporto di due piastre da 10 cm in un singolo pozzetto di un 6 pozzetti/piastra.
11. Ripetere i passaggi 5.3-5.10 con un secondo lotto di due piastre da 10 cm e placcare il prodotto finale in un pozzetto rivestito di matrice a membrana basale di una seconda piastra a 6 pozzetti. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per trasferire la sospensione cellulare.
    NOTA: Il completamento ideale del protocollo NPC del midollo spinale richiede due pozzetti pari a quattro piastre da 10 cm. Per facilitare il flusso di lavoro, completare i passaggi 5.3-5.10 con due lotti di due piastre, ciascuno con il prodotto finale costituito da due piastre separate a 6 pozzetti e ciascuna con un pozzetto contenente 3,0 x 10⁶ celle al suo interno.
12. Mantenere il monostrato di iPSC umano risultante in mezzo hiPSC contenente 20 μM di ROCK-I fino a quando la confluenza raggiunge il >90%, tipicamente il giorno successivo ma non più di 3 giorni dopo la placcatura iniziale per evitare una differenziazione spontanea (incontrollata).
13. Se la differenziazione non può essere iniziata il giorno successivo alla placcatura cellulare, lavare le cellule una volta con PBS e cambiare il terreno ogni giorno con un nuovo mezzo hiPSC contenente 20 μM di ROCK-I. Se non confluisce >90% entro 3 giorni dalla placcatura, scartare le celle e ricominciare il protocollo.
14. Una volta raggiunta la confluenza del >90%, iniziare la differenziazione. Questo è il giorno in vitro 1 (DIV1) del protocollo di differenziazione.
15. Su DIV 1, scartare il mezzo hiPSC contenente 20 μM ROCK-I e risciacquare due volte con PBS per rimuovere il fattore di crescita fetale (FGF) e il fattore di crescita trasformante-beta (TGFβ) presenti nel mezzo delle cellule staminali.
16. Cambiare il mezzo in mezzo WiCell (Tabella 1) integrato con 0,2 μM di LDN193189 (LDN) e 10 μM di SB431542 (SB) per 48 ore.
17. Su DIV 3, lavare una volta con PBS e cambiare il mezzo in mezzo WiCell integrato con LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + acido retinoico (RA; 1μM) per 48 ore.
18. Su DIV 5, lavare una volta con PBS e cambiare il supporto in WiCell: base del mezzo di induzione neurale (NIM) (Tabella 1) (50%:50%, v/v) integrata con LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) per 48 ore.
19. Sul DIV 7, eseguire lo scambio del mezzo con lo stesso supporto del passaggio 5.18.
20. Su DIV 8, lavare una volta con PBS e cambiare il mezzo in base WiCell:NIM (50%:50%) integrato con RA (1 μM) + puromorfamina (PMN) (1 μM) + fattore neurotrofico ricombinante derivato dal cervello umano (BDNF) (10 ng/ml) + acido ascorbico (ASAC) (0,4 μg/ml) per 48 ore.
21. Su DIV 10, lavare una volta con PBS e cambiare il mezzo in base NIM (100%) integrato come indicato al punto 5.20 per 48 ore.
22. Su DIV 11 o 12, rivestire un pallone di coltura sterile di 25 cm² con matrice a membrana basale in preparazione del passaggio.
23. Aspirare il mezzo da ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti l e risciacquare le cellule una volta con PBS.
24. Aggiungere 2 mL di tripsina allo 0,05% in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 5-15 minuti; Scuotere a intermittenza le piastre può aiutare nel distacco delle cellule.
25. Se le celle non sono ancora in sospensione, staccarsi meccanicamente espellendo il mezzo NIM da una punta di pipetta da 1000 μL sulle celle con un movimento circolare (assicurarsi di coprire l'intera superficie) o raschiando con un raschietto cellulare (non preferito).
26. Trasferire le cellule da 2 pozzetti a una provetta da 15 ml e aggiungere l'inibitore della tripsina in proporzione appropriata alla quantità di tripsina utilizzata utilizzando una pipetta da 5 ml.
27. Centrifugare a 200 x g per 2 minuti, aspirare il surnatante e quindi risospendere con 10 mL di base NIM utilizzando una pipetta da 10 mL.
28. Centrifugare nuovamente a 200 x g per 2 minuti per allentare le aderenze cellula-cellula.
29. Dopo la seconda fase di centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 mL di mezzo NIM (100%) integrato con RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL) e ROCK-I (20 μM). Utilizzando una punta per pipetta da 1000 μL, triturare le cellule su e giù circa cinque volte fino ad ottenere una sospensione torbida.
30. Riseminare gli aggregati in questo mezzo al pallone di coltura sterile rivestito con matrice di membrana basale da 25 cm 2 in modo che il risultato finale sia la combinazione delle cellule da due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti a un singolo pallone di coltura sterile rivestito di matrice basale da 25 cm 2 (passaggio²:1). Utilizzare una pipetta da 1000 μL per trasferire la sospensione cellulare.
    NOTA: Le celle devono essere confluenti al >90% su DIV 13 e non sono necessari ulteriori passaggi fino al giorno 14. Se le cellule non sono confluenti, mantenere ROCK-I nel mezzo per altri 1 o 2 giorni.
31. Su DIV 14, cambiare il mezzo in fluidi NIM freschi + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL).
32. Su DIV 15, cambiare il mezzo in NIM: base del mezzo di differenziazione neurale (NDM) (Tabella 1) (50%:50%) con RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg/mL) + Supplemento B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + Neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF) (10 ng/mL) + Fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) (10 ng/mL) + Fattore neurotrofico ciliare (CNTF) (10 ng/mL). Cambia con nuovi media a giorni alterni.
33. Su DIV 21, cambiare il mezzo in base NDM (100%) integrato come nel passaggio 5.32 e cambiare con mezzo fresco a giorni alterni.
34. Su DIV 25-30, raccogliere gli NPC e congelarli o passarli su una piastra di 10 cm per la differenziazione terminale.
35. Risciacquare il pallone T-25 con PBS e aggiungere tripsina allo 0,05%.
36. Incubare per 5 min a 37 °C.
37. Risciacquare la tripsina e le cellule con la base NDM e trasferirle in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere l'inibitore della tripsina in proporzione appropriata alla tripsina e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
38. Risospendere il pellet cellulare con il motoneurone o il mezzo di differenziazione degli astrociti (Tabella 1) e utilizzare una pipetta da 1000 μL per triturare su e giù per ottenere una sospensione a singola cellula (di solito fino a 5 volte).
39. Contare le celle e trasferirle su una piastra rivestita di 10 cm come descritto nella sezione 6, utilizzando uno dei mezzi di differenziazione +Rock-I, per differenziare hiPSC-MN e hiPSC-A.
40. In alternativa, congelare le colture risospendendo in un mezzo di congelamento composto per il 90% da terreno NDM con fattori di crescita (come nei passaggi 5.32-5.33) e 10% di DMSO, triturare in modo simile e quindi trasferire in un criotubo. Aliquota 6 x 10⁶ NPC per criotubo.

6. Scongelare le culture NPC

1. Rivestire le piastre di 10 cm con poliornitina (PLO) e laminina il giorno prima dello scongelamento delle cellule.
   1. Aggiungere 5 mL di PLO diluito a 100 μg/mL in PBS o acqua distillata (dH₂O) alle piastre. Incubare a 37 °C per un minimo di 1 h fino a tutta la notte.
   2. Aspirare la soluzione PLO e sciacquare le piastre tre volte con PBS. (L'OLP è tossica se non adeguatamente lavata.)
   3. Aggiungere la laminina diluita in PBS ad una concentrazione di 10 μg/mL alle piastre rivestite PLO. Incubare a 37 °C per almeno 1 ora, preferibilmente durante la notte. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di laminina senza risciacquo per migliorare l'adesione cellulare.
      NOTA: Le piastre possono essere rivestite con PLO in anticipo, lavate tre volte con acqua, asciugate in una cappa sterile e conservate a 4 °C.
2. Scongelare un flaconcino NPC (cioè DIV 25 o 30) contenente 6 x 10⁶ cellule/flaconcino per ogni piastra di coltura cellulare da 10 cm.
3. Rimuovere il criotubo NPC dall'azoto liquido e metterlo immediatamente a bagnomaria a 37 °C per un massimo di 2 minuti. Scongelare rapidamente agitando la fiala fino a quando non c'è un piccolo pezzo di ghiaccio circondato da liquido.
4. Trasferire gli aggregati cellulari in una conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 1000 μL e aggiungere fino a 15 ml di NDM preriscaldato o DMEM (Modified Eagles Medium) di Dulbecco / F21 F12 di Ham per diluire il DMSO.
5. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
6. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare con astrociti o mezzo di differenziazione MN (Tabella 1) + ROCK-I (20 μM) e utilizzare una pipetta da 1000 μL per triturare su e giù fino ad ottenere una sospensione a singola cellula (fino a 5 volte).
7. Trasferire la sospensione monocellulare su una piastra rivestita di 10 cm con rivestimento PLO-Laminin.
8. Trasferire la piastra in un'incubatrice e lasciarla indisturbata durante la notte per consentire una corretta adesione cellulare.

7. Differenziare NPC del midollo spinale in motoneuroni

1. Eseguire i passi iniziali come indicato nei punti 6.1-6.8, con il mezzo finale di differenziazione MN + ROCK-I (20 μM).
2. Il giorno dopo la placcatura, eseguire uno scambio completo del mezzo con il mezzo di differenziazione MN senza ROCK-I, quindi cambiare il supporto a giorni alterni. Durante il fine settimana, nutrire le cellule il venerdì e poi di nuovo il lunedì. Risciacquare le cellule con PBS quando necessario per rimuovere i detriti cellulari.
3. Cambiare il mezzo con mezzo di differenziazione MN + citosina arabinoside (ARA-C) (0,02 μM) e incubare per 48 ore quando i progenitori gliali impegnati emergono come singole cellule piatte proliferanti sotto progenitori MN post-mitotici aggregati in cluster cellulari.
   NOTA: Di solito, questo si verifica entro i primi 7 giorni dopo la placcatura iniziale, anche se ci può essere variabilità a seconda della linea cellulare.
4. Dopo 48 ore, aspirare il terreno contenente ARA-C, sciacquare delicatamente le colture con PBS tre volte e cambiare il terreno in terreno MN fresco senza ARA-C.
5. Dopo il trattamento con ARA-C, eseguire scambi di mezzi a giorni alterni (o lunedì, mercoledì e venerdì) rimuovendo il vecchio mezzo con una pipetta manuale anziché un aspiratore a vuoto per prevenire il distacco prematuro dei cluster neuronali. Inoltre, arricchire il mezzo MN con Laminina 1 μg / mL una volta alla settimana per migliorare ulteriormente l'attaccamento neuronale alle piastre di coltura.

8. Differenziare gli NPC in astrociti del midollo spinale

1. Scongelare le colture di NPC come nella sezione 6, utilizzando il terreno di differenziazione astrocitaria (Tabella 1) con l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) con un volume per concentrazione volumetrica dell'1% (NS + 1% FBS) e ROCK-I (20 μM) per la placcatura.
   NOTA: La sostituzione del siero disponibile in commercio (Tabella 1) può essere sostituita con FBS utilizzando gli stessi fattori di diluizione.
2. Il giorno dopo la placcatura, cambiare il terreno di coltura con NS + 1% di terreno FBS senza inibitore ROCK, quindi cambiare il terreno a giorni alterni. Durante i fine settimana, nutrire le cellule il venerdì e poi di nuovo il lunedì. Risciacquare le cellule con PBS quando necessario per rimuovere i detriti cellulari. Se le cellule continuano a morire, integrare i mezzi con ROCK-I (10 μM) per promuovere la sopravvivenza cellulare. Fai attenzione a non usare ROCK-I troppo spesso o troppo a lungo, dato il potenziale di selezionare cellule immortali.
3. Lasciare che gli astrociti diventino confluenti prima di passarli.
   NOTA: la dimensione della cella aumenterà nel tempo, quindi non esiste un numero impostato per il passaggio. Il tipico rapporto di passaggio è 1:2 o 1:3. In caso di scarsa sopravvivenza o di passaggio a troppe piastre, unire due (o più, se necessario) piastre da 10 cm a una piastra da 10 cm per mantenere la confluenza.
4. Per far passare le colture progenitrici di astrociti, lavare le piastre una volta con PBS (per rimuovere FBS), incubare con tripsina allo 0,05% per 5 minuti, raccogliere le cellule in mezzo NS + 1% FBS (FBS inattiverà la tripsina) e quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in NS medio + 1% FBS, quindi triturare in una sospensione monocellulare. Distribuire le celle in NS + 1% FBS su nuove piastre da 10 cm.
   NOTA: Oltre ad espandere le colture di astrociti, il passaggio ripetuto delle placche serve allo scopo di uccidere tutte le cellule progenitrici rimanenti che hanno scelto un destino neuronale. Pertanto, anche se non c'è un tasso mitotico molto alto, le piastre possono essere fatte passare con un rapporto 1: 1 se sembra esserci contaminazione neuronale.
5. Cambiare il rivestimento nel corso della differenziazione per migliorare la resa come segue.
   1. Placcare le culture NPC inizialmente scongelate e i primi passaggi dopo la placcatura iniziale su OLP / Laminin.
   2. Placcare gli astrociti immaturi su piastre rivestite di matrice di membrana basale.
   3. Placcare astrociti più maturi (cioè dopo il giorno 90) su una matrice di membrana basale, piastre rivestite di PLO / Laminin (tipicamente per la co-coltura con i neuroni) o su piastre non rivestite.
6. Congelare i progenitori degli astrociti in qualsiasi momento durante il periodo di maturazione di 60 giorni per sincronizzare le colture o salvarli per esperimenti successivi. Quando si scongela oltre lo stadio NPC, scongelare i progenitori degli astrociti sulle piastre rivestite di matrice della membrana basale piuttosto che PLO / Laminin.
7. A DIV 90 e successivamente, passare il mezzo da NS + 1% FBS a NS + 5% FBS per promuovere la sopravvivenza degli astrociti e diminuire la loro proliferazione.

9. Co-coltura di MN e astrociti del midollo spinale in piastre multi-elettrodo

1. Differenziare e placcare i motoneuroni e gli astrociti quando sono pronti per essere utilizzati lo stesso giorno e invecchiati a DIV 60 per i motoneuroni e DIV 90 per gli astrociti.
2. Rivestire le lastre MEA il giorno prima o il giorno della placcatura come segue se si lavora con lastre di plastica a 24 pozzetti (Tabella dei materiali).
3. Diluire la PLO in acqua o PBS a 100 μg/ml.
   1. Aggiungere 15-20 μL a ciascun pozzetto (a seconda del livello di comfort della pipetta), formando una goccia al centro del pozzetto che copre l'area degli elettrodi e l'area circostante, ma non l'intero pozzetto.
   2. Fare attenzione a non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Essere coerenti con il volume da pozzo a pozzo per garantire la copertura della stessa superficie in ciascun pozzetto.
   3. Incubare PLO a 37 °C per un minimo di 1 ora (preferibilmente 2 ore).
      NOTA: I piccoli volumi si asciugheranno se non c'è sufficiente umidità nelle piastre. Aggiungere acqua ai compartimenti che circondano i pozzi per garantire un'umidità sufficiente durante tutto il corso del rivestimento e delle registrazioni.
4. Aspirare il più possibile PLO utilizzando una punta di micropipetta di plastica. Fare attenzione a non toccare gli elettrodi. Lavare con 250 μL di acqua tre volte. Se si utilizza un aspiratore a vuoto per i lavaggi, non consentire la punta vicino all'array di elettrodi. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere quanta più acqua possibile, utilizzando una punta di pipetta se necessario. Lasciare asciugare la superficie sotto il cappuccio di coltura cellulare con il coperchio rimosso.
5. Una volta che le superfici delle piastre sono asciutte, aggiungere Laminina diluita a 10 μg/mL in PBS. Utilizzare 15-20 μL per coprire ogni array di elettrodi. Aggiungere acqua nei compartimenti di umidità, sostituire il coperchio e riportare la piastra a 37 °C di incubazione per un minimo di 2 ore fino a tutta la notte.
6. Il giorno della placcatura, sciacquare le colture di MN e astrociti una volta con PBS e aggiungere tripsina 0,05% a 37 °C per sollevare le cellule (5 min). Raccogliere in un tubo conico da 15 mL contenente inibitore della tripsina e lavare le piastre con mezzo o base per assicurarsi che tutte le cellule siano raccolte. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e risospendere con una pipetta da 1000 μL per generare 1 mL di sospensione monocellulare. Quando si risospendono MN e astrociti, passare al terreno di coltura (Tabella 1), con l'aggiunta di 20 μM ROCK-I.
7. Contare il MN e gli astrociti in parallelo usando un emocitometro. Durante il conteggio e l'esecuzione dei calcoli, tappare le sospensioni delle celle e posizionarle in una griglia di polistirolo a 4 °C.
8. Calcolare il volume necessario per risospendere le colture a una concentrazione di 5 x 10 4 cellule per 5 μL per i motoneuroni e 2,5 x 10⁴ cellule per 5 μL per gli astrociti. Centrifugare le sospensioni di celle da 1 mL a 300 x g per 5 minuti e risospendere nel volume calcolato.
9. Calcola il numero di pozzetti desiderati da seminare e moltiplicalo per 5 μL di ciascuna sospensione cellulare. Combinare il volume richiesto di sospensioni di neuroni e astrociti in rapporto 1:1 e mescolare mediante pipettaggio fino a quando non si combinano completamente (di solito due volte), ma evitare di essere troppo aggressivi.
10. Rimuovere la laminina da ciascun pozzetto della piastra MEA utilizzando una punta per pipetta. Trasferire 10 μL della sospensione cellulare combinata finale in ciascun pozzetto, formando una piccola goccia che copre l'array di elettrodi per fornire una densità cellulare di 5 x 10 4 MN e 2,5 x 10⁴ astrociti per pozzetto.
    NOTA: L'elevata densità cellulare nella sospensione combinata richiede frequenti risospensioni tra i pozzetti durante la fase di semina per garantire conteggi cellulari accurati e coerenti.
11. Riportare le piastre nell'incubatrice per 20-30 minuti. Fare attenzione a non disturbare la goccia cellulare e consentire alle cellule di formare attaccamenti iniziali sulle piastre.
12. Dopo 20-30 minuti, aggiungere terreni di co-coltura caldi + ROCK-I a ciascun pozzetto pipettando 250 μL sulla parete di ciascun pozzetto, seguiti da altri 250 μL lungo la parete dello stesso pozzetto sul lato opposto. Riportare la piastra nell'incubatore.
13. Esaminare le lastre il giorno dopo la semina (Co-culture Day 1). Se ci sono detriti cellulari significativi o cellule morte, scambiare il terreno con un nuovo terreno di co-coltura contenente ROCK-I. Altrimenti, cambia il mezzo il secondo giorno dopo la semina (Co-Culture Day 2) al mezzo di co-coltura senza ROCK-I. Eseguire scambi medio-medi (aspirare il 50% e aggiungere il 60% del volume finale per tenere conto dell'evaporazione) due volte alla settimana.
14. Se si utilizzano sistemi MEA con lastre di vetro da 30 mm a pozzetto singolo (Table of Materials), la preparazione della piastra può richiedere 2 o più giorni. Seguire i passaggi seguenti per eseguire questa operazione.
15. Sollevare le cellule e i detriti cellulari dalle precedenti colture MEA con lo 0,05% di tripsina per 5-15 minuti.
16. Aspirare la tripsina e risciacquare tre volte con acqua.
17. Sterilizzare aggiungendo etanolo al 70% e incubare nella cappa per 10 minuti. Aspirare l'etanolo, quindi risciacquare con acqua tre volte.
18. Applicare detergente anionico all'1% con enzima proteasi in acqua. Coprire i piatti con un coperchio e avvolgere con pellicola termoplastica e foglio di alluminio, quindi lasciarli su un bilanciere a temperatura ambiente durante la notte.
19. Aspirare il detergente, quindi risciacquare tre volte con acqua.
20. Se si prevede di conservare i piatti, aggiungere un volume sufficiente di acqua. Coprire i piatti con un coperchio e avvolgerli con pellicola termoplastica e foglio di alluminio e lasciarli in frigorifero fino al prossimo utilizzo.
21. Se si prevede di rivestire, lasciare asciugare la superficie sotto il cappuccio della coltura cellulare.
22. Se è necessaria una sterilizzazione supplementare (ad esempio, infezione precedente o uso non recente), solo a questo punto, esporre le piastre MEA alla luce ultravioletta (UV) sotto il cofano per 30-60 minuti.
    NOTA: evitare frequenti raggi UV eviterà danni agli elettrodi. L'uso della luce UV quando le piastre hanno siero su di esse si tradurrà in elettrodi non funzionali, motivo per cui dovrebbe essere utilizzato solo su piastre pulite.
23. Quando le piastre sono completamente asciutte, procedere con la pulizia al plasma per 1 minuto per caricare la superficie del vetro delle lastre MEA e migliorare l'efficacia del rivestimento. Pulire al plasma almeno una volta ogni 4-5 cicli di cicli di pulizia-placcatura della piastra MEA.
    1. In alternativa, quando la pulizia al plasma non è fattibile o non è giustificata, aggiungere un volume sufficiente di mezzo contenente FBS per coprire la superficie delle piastre MEA e restituirle all'incubatore durante la notte.
24. Utilizzare il rivestimento PLO/Laminin come descritto sopra nella sezione 6. Aggiungere la soluzione di PLO (100 μg in PBS) immediatamente dopo la pulizia al plasma o l'aspirazione e il risciacquo del mezzo contenente FBS.
25. Placcare le celle come sopra alle seguenti densità: 1 x 10 5 hiPSC-A / piastra e 5 x 10⁵ hiPSC-MN / piastra.

10. Registrazione di array multi-elettrodo

1. Estrarre i dati grezzi di tensione a una frequenza di campionamento di 12,5 kHz, utilizzando un filtro Butterworth con un filtro passa-alto a 200 Hz e un filtro passa-basso da 3 kHz. Impostare il riconoscimento dei picchi come punti temporali istantanei delle tensioni ≥6 deviazioni standard rispetto al basale. Identificare le esplosioni come attività con >5 picchi in 100 ms. Definire l'attività di rete quando oltre il 35% degli elettrodi attivi totali si attiva entro 100 ms con un minimo di 50 picchi per burst di rete.
2. Inizia a registrare il prima possibile dopo Co-Culture (CC) Day 1.
   NOTA: L'attività elettrica sarà raramente notata prima del CC Day 3.
3. Colture parallele su piastre a densità simili e si replica nelle piastre di coltura appropriate o nei vetrini di copertura per saggi biochimici, immunocitochimica (ICC) o qPCR.
4. Eseguire registrazioni con temperatura impostata su 37 °C e CO₂ al 5%. Trasferire le piastre alla macchina e consentire loro di equilibrarsi per almeno 5 minuti prima della registrazione.
5. Registrare l'attività di base a giorni alterni o settimanalmente, nell'arco di 1-15 minuti a seconda del disegno sperimentale. Non registrare per almeno 1 ora dopo uno scambio medio e idealmente attendere 24 ore dopo ogni scambio multimediale.
6. Per evitare contaminazioni, cambiare il mezzo (cioè mezzo scambio di mezzo come al punto 9.14) dopo ogni registrazione in cui il coperchio della piastra sterile deve essere aperto al di fuori della cappa sterile (cioè l'applicazione di composti farmacologici). Eseguire scambi e lavaggi completi per lavare i farmaci se le piastre continueranno ad essere utilizzate oltre il trattamento farmacologico.
7. Ai fini dell'analisi, utilizzare almeno tre repliche tecniche e biologiche per ciascuna condizione. Esprimere i dati elettrofisiologici per mezzo di n ≥ 3 repliche.

11. Saggi farmacologici su array multi-elettrodo

1. Utilizzare una diversa combinazione di co-colture a seconda della domanda sperimentale: neuroni SLA con astrociti di controllo, neuroni di controllo con astrociti SLA, neuroni e astrociti SLA, neuroni di controllo e astrociti.
2. Quando si studiano gli effetti elettrofisiologici transitori di composti che colpiscono neuroni o astrociti, registrare l'attività basale per un minimo di 1 minuto con il coperchio della piastra rimosso ma il coperchio della macchina chiuso.
3. Aprire manualmente il coperchio della macchina senza interrompere la registrazione elettrofisiologica e scambiare 25 μL di mezzo con il veicolo farmacologico appropriato (di solito terreno fresco) utilizzando una pipetta multicanale se si trattano più pozzetti. Chiudere il coperchio manualmente.
4. Registrare per un ulteriore 1 minuto (o più se ci sono cambiamenti significativi indotti dal veicolo da cui la cultura deve riprendersi).
5. Riaprire manualmente il coperchio e scambiare 25 μL di terreno con il farmaco di interesse nello stesso veicolo. Chiudere il coperchio della macchina e continuare la registrazione.
   NOTA: La durata della registrazione e il volume del farmaco/veicolo somministrato possono variare o devono essere ottimizzati a seconda della domanda sperimentale.
6. Ai fini dell'analisi, assicurarsi che l'aggiunta del veicolo non provochi cambiamenti significativi nei parametri elettrofisiologici. Calcolare le variazioni percentuali dell'attività dopo il farmaco rispetto a dopo l'aggiunta del veicolo e confrontare tra le condizioni.
7. Per studiare gli effetti elettrofisiologici longitudinali, come i farmaci modificanti la malattia candidati, registrare l'attività basale delineata nella fase 11.2. Per questo, utilizzare il mezzo di co-coltura contenente i farmaci di interesse nel veicolo appropriato o il mezzo contenente solo il veicolo.
8. Ai fini dell'analisi, confrontare le registrazioni dei punti temporali della SLA o delle co-colture di controllo trattate longitudinalmente con farmaci tra loro e controllare le condizioni.

Risultati

Il protocollo di pattern del midollo spinale per la generazione di hiPSC-MN e hiPSC-A del midollo spinale è delineato nella Figura 1. In questo protocollo, le hiPSC sono mantenute e fatte passare come colonie non confluenti (Figura 2A). La neurogenesi viene iniziata (induzione neurale) attraverso la doppia inibizione della SMAD con l'aggiunta di LDN193189 e SB431542, inattivando rispettivamente la proteina morfogenetica ossea (BMP) e le vie del fattore di cresc...

Discussione

Ad oggi, i metodi basati su hiPSC e MEA per le registrazioni elettrofisiologiche di co-colture astrocita-neurone hanno trovato un'applicazione limitata nel campo della SLA⁶ e ancora non in piattaforme completamente umane, in contrasto con il loro uso più diffuso per la modellazione in vitro dell'epilessia⁹. Questa piattaforma, tuttavia, ha il potenziale per affrontare questioni fisiopatologicamente rilevanti nella ricerca sulla SLA, come i meccanismi di ipereccita...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp