Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

Riepilogo

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Abstract

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) forniscono un potente strumento per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro. Le registrazioni multi-electrode array (MEA) sono un mezzo per registrare i potenziali di campo elettrico da grandi popolazioni di neuroni e analizzare l'attività della rete nel tempo. È stato precedentemente dimostrato che la presenza di hiPSC-A che sono differenziati utilizzando tecniche per promuovere un fenotipo astrocitario del midollo spinale ha migliorato la maturazione e l'attività elettrofisiologica dei motoneuroni (MN) del midollo spinale specifici a livello regionale rispetto a quelli coltivati senza hiPSC-A o in presenza di astrociti roditori. Qui è descritto un metodo per co-coltivare il midollo spinale hiPSC-A con hiPSC-MN e registrare l'attività elettrofisiologica utilizzando registrazioni MEA. Mentre i protocolli di differenziazione qui descritti sono particolari per astrociti e neuroni che sono specifici a livello regionale per il midollo spinale, la piattaforma di co-coltura può essere applicata ad astrociti e neuroni differenziati con tecniche specifiche per altri destini, tra cui hiPSC-A corticale e hiPSC-N. Questi protocolli mirano a fornire un saggio elettrofisiologico per informare sulle interazioni glia-neurone e fornire una piattaforma per testare farmaci con potenziale terapeutico nella SLA.

Introduzione

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) sono potenti strumenti per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro e forniscono un paradigma traslazionale per le strategie di scoperta di farmaci¹. I ricercatori hanno dimostrato che la co-coltura di hiPSC-A con hiPSC-N migliora la maturazione morfologica, molecolare, elettrofisiologica e farmacologica di entrambi i tipi di cellule, generando complesse reti neuronali e interazioni astrocita-neurone che assomigliano alle loro controparti in vivo ^2,3

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura cellulare

1. Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando le composizioni menzionate nella Tabella 1.
2. Miscelare e sterilizzare il materiale filtrato in flaconi filtrati da 500 ml e conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Mantenimento e passaggio delle cellule staminali pluripotenti indotte umane non confluenti (hiPSC)

1. Scongelare la matrice della membrana basale (conservata in aliquote a -80 °C) in un frigorifero a 2-8 °C durante la notte.
2. Diluire la matrice della membrana basale a 1:100 (v/v) in....

Risultati

Il protocollo di pattern del midollo spinale per la generazione di hiPSC-MN e hiPSC-A del midollo spinale è delineato nella Figura 1. In questo protocollo, le hiPSC sono mantenute e fatte passare come colonie non confluenti (Figura 2A). La neurogenesi viene iniziata (induzione neurale) attraverso la doppia inibizione della SMAD con l'aggiunta di LDN193189 e SB431542, inattivando rispettivamente la proteina morfogenetica ossea (BMP) e le vie del fattore di cresc.......

Discussione

Ad oggi, i metodi basati su hiPSC e MEA per le registrazioni elettrofisiologiche di co-colture astrocita-neurone hanno trovato un'applicazione limitata nel campo della SLA⁶ e ancora non in piattaforme completamente umane, in contrasto con il loro uso più diffuso per la modellazione in vitro dell'epilessia⁹. Questa piattaforma, tuttavia, ha il potenziale per affrontare questioni fisiopatologicamente rilevanti nella ricerca sulla SLA, come i meccanismi di ipereccita.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm sterile culture plates	Falcon	353003
25 cm2 sterile culture flasks	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System	Corning	430769
5 mL pipette	Falcon	357543
6 well sterile culture plates	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)	Sigma	A4403	Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA platform	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator	ThermoFisher	370	set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R&D systems	291-G1-200	Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Working concentration 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine	Thermofisher	25030	Working concentration 100x
MEA glass plates	MultiChannel Systems	60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermofisher	11140050	Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)	NA	NA	Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542	Sigma	S4317	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Supplement B - B27 Supplement	Thermofisher	21985023	Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement	Thermofisher	17502048	Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm	PARAFILM	P7793
Tissue dissociation protease - Dispase	StemCell Technologies	7923	Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522-1G	Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher	2530054	Working concentration 1x
Waterbath	ThermoFisher	2332	Isotemp