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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Abstract

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) forniscono un potente strumento per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro. Le registrazioni multi-electrode array (MEA) sono un mezzo per registrare i potenziali di campo elettrico da grandi popolazioni di neuroni e analizzare l'attività della rete nel tempo. È stato precedentemente dimostrato che la presenza di hiPSC-A che sono differenziati utilizzando tecniche per promuovere un fenotipo astrocitario del midollo spinale ha migliorato la maturazione e l'attività elettrofisiologica dei motoneuroni (MN) del midollo spinale specifici a livello regionale rispetto a quelli coltivati senza hiPSC-A o in presenza di astrociti roditori. Qui è descritto un metodo per co-coltivare il midollo spinale hiPSC-A con hiPSC-MN e registrare l'attività elettrofisiologica utilizzando registrazioni MEA. Mentre i protocolli di differenziazione qui descritti sono particolari per astrociti e neuroni che sono specifici a livello regionale per il midollo spinale, la piattaforma di co-coltura può essere applicata ad astrociti e neuroni differenziati con tecniche specifiche per altri destini, tra cui hiPSC-A corticale e hiPSC-N. Questi protocolli mirano a fornire un saggio elettrofisiologico per informare sulle interazioni glia-neurone e fornire una piattaforma per testare farmaci con potenziale terapeutico nella SLA.

Introduzione

Gli astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC-A) e i neuroni (hiPSC-N) sono potenti strumenti per modellare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in vitro e forniscono un paradigma traslazionale per le strategie di scoperta di farmaci1. I ricercatori hanno dimostrato che la co-coltura di hiPSC-A con hiPSC-N migliora la maturazione morfologica, molecolare, elettrofisiologica e farmacologica di entrambi i tipi di cellule, generando complesse reti neuronali e interazioni astrocita-neurone che assomigliano alle loro controparti in vivo 2,3

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura cellulare

  1. Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando le composizioni menzionate nella Tabella 1.
  2. Miscelare e sterilizzare il materiale filtrato in flaconi filtrati da 500 ml e conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Mantenimento e passaggio delle cellule staminali pluripotenti indotte umane non confluenti (hiPSC)

  1. Scongelare la matrice della membrana basale (conservata in aliquote a -80 °C) in un frigorifero a 2-8 °C durante la notte.
  2. Diluire la matrice della membrana basale a 1:100 (v/v) in....

Risultati

Il protocollo di pattern del midollo spinale per la generazione di hiPSC-MN e hiPSC-A del midollo spinale è delineato nella Figura 1. In questo protocollo, le hiPSC sono mantenute e fatte passare come colonie non confluenti (Figura 2A). La neurogenesi viene iniziata (induzione neurale) attraverso la doppia inibizione della SMAD con l'aggiunta di LDN193189 e SB431542, inattivando rispettivamente la proteina morfogenetica ossea (BMP) e le vie del fattore di cresc.......

Discussione

Ad oggi, i metodi basati su hiPSC e MEA per le registrazioni elettrofisiologiche di co-colture astrocita-neurone hanno trovato un'applicazione limitata nel campo della SLA6 e ancora non in piattaforme completamente umane, in contrasto con il loro uso più diffuso per la modellazione in vitro dell'epilessia9. Questa piattaforma, tuttavia, ha il potenziale per affrontare questioni fisiopatologicamente rilevanti nella ricerca sulla SLA, come i meccanismi di ipereccita.......

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo manoscritto è stato supportato da quanto segue: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Ringraziamo il Dr. Raha Dastgheyb e il Dr. Norman Haughey per aver fornito la piattaforma MEA e il software di analisi dei dati che abbiamo utilizzato per convalidare la piattaforma elettrofisiologica descritta. Vorremmo ringraziare Khalil Rust per la loro assistenza con la dimostrazione del protocollo e le riprese.

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm sterile culture platesFalcon353003
25 cm2 sterile culture flasksFalcon353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)Thermofisher21985023Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter SystemCorning430769
5 mL pipetteFalcon357543
6 well sterile culture platesFalcon3046
Amphotericine BGibco15290018Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC)SigmaA4403Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)AxionOPT-24
Axion Edge MEA platformAxionMaestro Edge
Basement Membrane matrix - MatrigelCorning354277Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF)Peprotech450-13Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion EdgeAirGas/Harris9296NC
Compound EAbcamab142164Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)Sigma AldrichC239Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK)Tocris111Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12Thermofisher113300Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 SupplementThermofisherA1517001Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermofisher16140071Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)Peprotech450-10Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
HemocytometerElection Microscopy Sciences63510-20
HeparinMillipore-sigmaH3149-100KUDissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubatorThermoFisher370set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)R&D systems291-G1-200Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acidAbcamab144490Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR)Thermofisher10828Working concentration 1x
LamininThermofisher23017-015Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189Stemgent04-0074Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-GlutamineThermofisher25030Working concentration 100x
MEA glass platesMultiChannel Systems60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200GilsonPJ22224
NeurobasalThermofisher21103049Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Thermofisher11140050Working concentration 100x
Pencillin/StreptomycinThermofisher15140122Working concentration 100x
Polyornithine (PLO)Sigma-AldrichP3655Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl)NANAWorking concentration100 mM
Purmorphamine (PMN)Millipore-Sigma540223Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA)SigmaR2625Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitorPeprotech1293823Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542SigmaS4317Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoodsBaker CompanySG-600
Supplement B - B27 SupplementThermofisher21985023Working concentration 50x
Supplement N - N2 SupplementThermofisher17502048Working concentration 100x
Table top cell culture centrifugeThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - ParafilmPARAFILMP7793
Tissue dissociation protease - DispaseStemCell Technologies7923Working concentration 1x
Trypsin InhibitorSigmaT6522-1GDissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermofisher2530054Working concentration 1x
WaterbathThermoFisher2332Isotemp

Riferimenti

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al.

Ristampe e Autorizzazioni

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