JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) لتجاوز حد الحيود النموذجي للتنظير المجهري للضوء وعرض الاكسوسومات على مقياس النانومتر. ويمكن استخدامه في كل من البعدين وثلاثة لتوصيف exosomes.

Abstract

يتم تحرير الحويصلات خارج الخلية (EVs) من قبل جميع أنواع الخلايا وتلعب دورا هاما في إشارات الخلايا و التوازن. غالبا ما يتطلب تصور المركبات الكهربائية طرقا غير مباشرة بسبب قطرها الصغير (40-250 نانومتر) ، والذي هو تحت حد الحيود للتنظير الضوئي النموذجي. لقد طورنا تصورا فائق الدقة قائم على المجهر للمركبات الكهربائية لتجاوز حد الحيود في بعدين وثلاثة أبعاد على حد سواء. باستخدام هذا النهج، يمكننا حل شكل ثلاثي الأبعاد من المركبات الكهربائية إلى داخل +/- 20 نانومتر القرار على محور س ص و +/- 50 نانومتر القرار على طول المحور Z. في الختام، نقترح أن يعتبر الفحص المجهري فائق الدقة كطريقة توصيف للمركبات الكهربائية، بما في ذلك الإكسوسومات، وكذلك الفيروسات المغلفة.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات المرتبطة بالغشاء الصادرة عن جميع أنواع الخلايا. أنها تحتوي على الدهون والبروتينات والأيض والأحماض النووية ونقل هذه المواد محليا بين الخلايا وdistally بين الأنسجة والأعضاء. هناك ثلاثة أنواع فرعية أساسية من المركبات الكهربائية: الهيئات المبرمج، microvesicles، وإكسوسومات1،2. هنا، نركز مناقشتنا على الإكسوسومات والبروتينات المرتبطة بها.

يتم إفراز الحويصلات الخارجية الناشئة من الداخل الناشئة من الاندوسومات المبكرة في الجسم متعدد المركبات (MVB). ثم يندمج MVB مع غشاء البلازما ، ويطلق الإكسوسومات في الفضاء خارج الخلية للسفر إلى خلايا أخرى3،4. Exosomes موجودة على مجموعة من الأحجام تتراوح بين 40 إلى 150 نانومتر ويتم إثراء مع بروتينات ترانسممبران الاندوسومال المعروفة باسم tetraspanins (CD9، CD63، CD81)، مجمع الفرز الاندوسومالية المرتبطة بالغشاء المطلوبة للنقل (ESCRT)، والبروتينات المرتبطة طوف الدهون1،2،5،6،7.

أصبح توصيف التركيبة الكيميائية الحيوية للإكسوسومات مجالا شائعا للباحثين لفهم طبيعتهم الوظيفية بشكل أفضل. توجد العديد من الطرق لتصور وتميز exosomes ، بما في ذلك قياس التدفق النانوي ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، والمسح الضوئي ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) ، وصدى البلازمون السطحي ، واستشعار النبض المقاوم ، والمجهر الخفيف التقليدي ، كل منها يحتوي على إيجابيات وسلبيات جوهرية8،9. TEM و cryo-EM يمكن تحقيق القرار القائم على نانومتر، ولكن غالبا ما تتطلب الجفاف وتجميد كسر الخطوات، وبالتالي تقليص أو lysing المركبات الكهربائية10،11. يعتمد NTA على تشتت الضوء ، مما يسمح بتحديد خصائص مئات المركبات الكهربائية في وقت واحد ، ولكنه قياس غير مباشر لحجم الجسيمات ولا يمكنه التمييز بسهولة بين المركبات الكهربائية والفيروساتومجاميع البروتين12و13و14و15و16. يستخدم قياس التدفق الخلوي النانوي الضوء المتناثر من مسار الإثارة ، والذي يمكن ترجمته بعد ذلك إلى قياسات الحجم ، ولكنه تقنية ناشئة ، وهناك القليل من الإجماع حول حجم الجسيمات ضمن النطاق الخطي للكشف عن الأدوات المختلفة12و17و18.

كان المجهر الخفيف التقليدي باستخدام البروتينات الفلورية أو الأصباغ أحد التقنيات الأكثر توظيفا لتصور المقصورات دون الخلوية ومجمعات البروتين وآلات الإشارات داخل الخلية. في حين أن هذه التقنية تثبت فائدتها في تصور توطين المجمعات ، فإن حد الحيود للتنظير المجهري الخفيف التقليدي (حوالي 250-400 نانومتر) يمنع الدقة الواضحة للبروتينات أو الهياكل في نطاق الحجم النموذجي للإكسوسوم (40-150 نانومتر)12،19،20.

المجهر فائق الدقة ، وهي المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) ، يميز نفسه عن المجهر الضوئي التقليدي من خلال توظيف الخصائص القابلة للضوء للفلوروفوريس المحددة والكشف عن هذه الأحداث الوامضة لإعادة بناء الصور وصولا إلى الدقة نانومتر21. يتم جمع أحداث Photoswitching باستخدام كاميرا كشف عالية الإطار على مدار عشرات الآلاف من التعرض الفردي ، ويتم استخدام وظيفة انتشار نقطة لرسم خريطة بثقة عالية الموقع الدقيق للفلوروفور الساحرللضوء 19،20،22. وهذا يسمح dSTORM لتجاوز الحد الحيود من المجهر الخفيفة. وأفادت عدة مجموعات استخدام تقنيات فائقة الدقة لتصور وتتبع exosomes والبروتينات المرتبطة بها22،23،24،25. يعتمد القرار النهائي على الخصائص الفيزيائية الحيوية للفلوروفور ، ولكنه يتراوح في كثير من الأحيان من +/-10-100 نانومتر على طول محور XY ، مما يسمح بدقة جزيء واحد.

القدرة على حل الفلوروفوريس الفردية على هذا النطاق على محور XY قد أحدثت ثورة في المجهر. ومع ذلك ، هناك القليل من البيانات عن ثلاثي الأبعاد (3 - D) dSTORM من exosome. لذلك ، سعينا إلى إنشاء إجراء تشغيل قياسي (SOP) للتصور القائم على dSTORM وتوصيف المركبات الكهربائية النقية ، بما في ذلك exosomes إلى الدقة نانومتر في 3-D.

Protocol

1 نشر وصيانة خطوط الخلايا

  1. الحصول على خلايا هشاشة العظام البشرية (U2OS) ووضع الخلايا في المتوسط النمو تستكمل مع 10٪ خالية من المصل البقري الجنين و1x البنسلين / Streptomycin الحل.
    ملاحظة: تم إنشاء مصل الأبقار الجنينية الخالية من Exosome بعد البروتوكول المقدم في مكنمارا وآخرون. آل26.
  2. الحفاظ على خلايا U2OS في حاضنة النحاس المغلفة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 وخلايا المرور في قوارير T17526،27. يجب الحفاظ على الخلايا في مرحلة النمو في منتصف اللوغاريتمي لمنع الملوثات الفرعية من النشأة، أو من تراكم الحطام المبرمج خلال المرحلة الثابتة.

2 عزلة إكسوسوم وتنقية

  1. تنمو خطوط الخلية U2OS إلى التقاء كامل في 10 قوارير T175 منفصلة مع 50 مل من وسائل الإعلام لكل قارورة. إزالة supernatant الخلية وتمريرها على التوالي من خلال جهاز الترشيح فراغ 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر.
  2. تخضع supernatant لترشيح التدفق العرضي (المعروف أيضا باسم ترشيح تدفق عرضي) على نظام الترشيح مجهزة 750 كيلودا خرطوشة الألياف المجوفة من أجل إزالة أصغر البروتينات أو الأيض28.
    1. مرور supernatant من خلال عامل الترشيح تدفق عرضية في ضغط مستمر إلى الأمام من 30 psi، مع الحفاظ على ضغط الاحتفاظ من <20 psi لإنتاج ضغط Δ من 10 أو أكثر من psi. ضع شريط تحريك مغناطيسي في خزان الرتنة وحدد إلى 150 دورة في الدقيقة26.
    2. حافظ على معدل التغذية عند 40 مل/دقيقة أو أعلى. جمع تتخلل في خزان والتخلص منه.
  3. ركز الفائق إلى 30 مل، ثم توازن مع أربعة مجلدات من برنامج تلفزيوني 1x. جمع حل التدفق العرضي تصفية ومتوازنة في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. عجل المركبات الكهربائية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في تركيز نهائي من 40 ملغ / مل البولي ايثيلين غليكول مع الوزن الجزيئي من 8000 دا. الطرد المركزي في EVs في 1200 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وإعادة الإنفاق في 500 ميكروغرام من 1x PBS.
  5. احتضان المركبات الكهربائية مع 50 ميكروغرام / مل من صبغة الغشاء الأحمر القابلة للوورية المتشابكة و 50 ميكروغرام / مل من RNase A في برنامج تلفزيوني 1x عند 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  6. إزالة الصبغة الزائدة من خلال عمود على نظام تنقية البروتين تعلق على جامع كسر. تحديد الكسور EV من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية وتجمع لهم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق26.
  7. تقارب اختيار ما مجموعه 200 ميكرولتر من المركبات الكهربائية باستخدام الخرز المغناطيسي المضادة CD81 متساوية في برنامج تلفزيوني 1x.
    1. تمييع 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد للCD81 في برنامج تلفزيوني 1x إلى حجم إجمالي قدره 1 مل والسماح لهم بربط في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 مل مع هزاز مستمر.
  8. غسل الخرز المضادة CD81 وEV ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. Elute CD81 + EV من الحل مع 100 mM الجليسين في درجة الحموضة 2.0 لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  9. ماصة CD81 + EV تنقية في حجم متساو من 100 mM تريس-HCl في الرقم الحموضة 7.5 في برنامج تلفزيوني 1x.
    ملاحظة: قد يتم حجز a aliquot من محلول CD81 + EV المنقى لتحليل تتبع الجسيمات النانوية أو المجهر الإلكتروني من أجل تأكيد نقاء الحل ووجود المركبات الكهربائية26.

3 التثبيت والإعداد

  1. ضع المركبات الكهربائية المنقية للتقارب على لوحات 8-well ذات القاع الزجاجي μ بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر (يمكن أن تمييع عينة EV في 100 mM Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.5 في 1x PBS) والسماح بالتمسك بالسطح بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
  2. دون إزالة الحل الحالي من لوحة 8-جيدا، إصلاح المركبات الكهربائية على لوحات بإضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني 1x إلى الحل المحتوي على EV في كل بئر والسماح لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة21.
  3. إزالة بارافورمالدهيد بعناية والحل الزائد مع micropipette من أجل عدم إزعاج المركبات الكهربائية. غسل EV مع برنامج تلفزيوني 1x لإزالة paraformaldehyde الزائدة. إجراء عملية الغسيل ثلاث مرات. إزالة فائض 1x برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد 250 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت dSTORM B-مكعبات لكل عينة عن طريق إنشاء حل من 5 mM protocatechuate ديوكسيجيناز (الجزء أ) المخفف في المخزن المؤقت التصوير (الجزء باء) لكل بروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قد يتضاعف تركيز الإنزيم في العازلة إلى 10 mM في حالة حدوث photobleaching.
    1. أضف 250 ميكرولتر من العازلة المعدة لكل بئر لكل بروتوكول الشركة المصنعة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير لمسح جزيئات مؤأكسدة.
      ملاحظة: يمكن بعد ذلك عرض EV على الفور أو تخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. استبدال المخزن المؤقت التالي التخزين قبل كل التصور.

4 معايرة المجهر البصري المباشر لإعادة الإعمار العشوائي

  1. إعداد الخرز اللازمة لمعايرة المجهر فائقة الدقة عن طريق تمييع 100 نانومتر ميكروسفير إلى تركيز 0.5٪ في البيولوجيا الجزيئية درجة المياه والأنابيب 200 ميكرولتر في كل بئر من الزجاج القاع μ الشريحة 8-لوحة جيدا.
    1. السماح للخرزات لتسوية في الآبار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. دون إزالة الحل الحالي، إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر إلى حل حبة المعايرة والسماح لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بعناية paraformaldehyde مع micropipette لعدم إزعاج الخرز وغسل الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. قم بإعداد المخزن المؤقت وفقا للخطوة 3.4.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني 1x وإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعدة لكل بئر. السماح للمخزن المؤقت بالجلوس لمدة 20 دقيقة قبل التصور.
  5. قبل وضع أي شيء على المسرح، اتصل بالمجهر ثلاثي الأبعاد باستخدام زر توصيل المجهر. إضافة 100x النفط إلى الهدف ووضع مركز البئر على رأس الهدف. في الإعداد اكتساب، بدوره على الليزر 473 و 640 نانومتر الإثارة وانقر على عرض.
    1. بدون تنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد، اعرض الخرز أسفل إعداد تشبع الفوتون بالنقر على عدد الفوتونات في خيارات عرض الصور. تعيين القوى الليزر الأولية إلى 8.4 كيلوواط لليزر 473 نانومتر و 11.6 كيلوواط لليزر 640 نانومتر.
    2. تقليل تركيز الليزر إلى حوالي -300 نانومتر أو المستوى البؤري من حبات المعايرة لإنتاج دقة واضحة من الخرز الفردية. بمجرد تركيز الطائرة Z، قم بتعديل مستويات طاقة الليزر بشكل أكبر لمراعاة التباين في كل مجال من مجالات الرؤية.
  6. تحت وظائف الجهاز ، واستكمال معايرة رسم الخرائط ثلاثية الأبعاد ومعايرة رسم خرائط القناة للحصول على الأخطاء على المحور س ، ص ، و ض. تعيين الحد الأقصى لعدد FOVs إلى 20، والعدد المستهدف من النقاط إلى 4000، والمسافة القصوى بين القنوات إلى 5.0 بكسل، ونصف قطر الاستبعاد بين القنوات إلى 10.0 بكسل أثناء معايرة رسم خرائط القناة.
  7. تأكد من أن المعايرة تنتج تغطية نقطة من >90٪ ونوعية رسم الخرائط التي هي جيدة. حفظ بيانات المعايرة المعطاة لاكتساب الصور في المستقبل.

5 تصور EV في ثلاثة أبعاد

  1. إضافة 100x النفط على الهدف ووضع المركبات الكهربائية المعدة في المجهر. دون تنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد، قم بتشغيل ليزر الإثارة 640 نانومتر ورفعه في البداية إلى ما بين 1.2 كيلوواط و 12.5 كيلوواط اعتمادا على كثافة الإشارة ومجال الرؤية لإثارة صبغة الغشاء الأحمر المتشابكة الملون المركبات الكهربائية.
    1. ضمن خيارات عرض الصور، قم بتبديل طريقة العرض من تشبع الفوتون إلى المئينات لتصور المركبات الكهربائية بشكل أفضل. ضبط طاقة الليزر لتقليل الضوضاء، مع تعظيم الإشارة. الاحتفاظ بكافة المعلمات الأخرى.
    2. ضبط التركيز من Z-الطائرة بالنقر فوق رمز أعلى أو أسفل على المحور Z.
      ملاحظة: يجب أن يكون مركزة Z-plane بين -200 و-350 نانومتر، ولكن سوف تختلف تبعا لحقل الرؤية.
  2. تعيين وقت التعرض إلى 20 مللي ثانية، والتقاط الإطار إلى 10،000 إطار، وقوة الليزر الأولية إلى ما بين 1.2 كيلوواط و 12.5 كيلوواط، أو قوة الليزر المحددة في الخطوة 5.1، اعتمادا على كثافة الإشارة ومجال الرؤية.
    1. قم بتنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد باستخدام الرمز وابدأ عملية الاستحواذ بالنقر على زر الحصول.
  3. في جميع أنحاء الحصول على الصورة، ورفع قوة الليزر من قبل 3 زيادات من 10 كل 1000 إطارات، أو ما يكفي للحفاظ على نسبة عالية من إشارة إلى الضوضاء. لا تقم بضبط الطائرة Z أثناء عملية الامتلاك.
    ملاحظة: قد يتم رفع الليزر إلى طاقة ليزر 90 كيلوواط كحد أقصى.

6 تعديل ما بعد الاستحواذ وتتبع EV

  1. بعد الحصول على الصورة، قم بالتبديل إلى نافذة تحليل العرض. قم بإجراء تصحيح الانجراف على الصورة غير المصفاة، ثم قم بتنشيط عوامل التصفية. ضبط عدد الفوتونات ودقة التعريب و sigmas و فهرس الإطار وفقا للجدول 1.
  2. تراكب أداة عرض طائرة XYZ على طول المحور X من المركبات الكهربائية الفردية من مجال الرؤية والتصدير . ملفات CSV للأحداث الضوئية.
  3. تقسيم المركبات الكهربائية الفردية على محور XY في حقل X حسب Y من العرض باستخدام أداة مخطط تكراري خط، الذي صناديق الأحداث photoswitching في مجموعات المسافة المحددة.
  4. التقاط صور من المركبات الكهربائية واحدة وحفظها كملفات .tiff.
  5. إنشاء مقاطع فيديو ثلاثية الأبعاد لمركبات EVs الفردية باستخدام أداة مرئية ثلاثية الأبعاد ولون وفقا للموضع على طول المحور Z.

النتائج

كان الهدف من هذه الدراسة تقييم فعالية المجهر فائق الدقة في تصور المركبات الكهربائية الفردية بدقة نانومتر في ثلاثة أبعاد (ثلاثي الأبعاد). لتحليل شكل وحجم المركبات الكهربائية الفردية، قمنا بتوظيف صبغة قابلة للسحر الضوئي واحتضان المركبات الكهربائية بصبغة حمراء بعيدة التشفير، وإزالة الصبغ?...

Discussion

أصبحت المركبات الكهربائية مجال الدراسة شعبية نظرا لدورها الهام في العديد من العمليات داخل الخلايا والخلايا إلى الخلية الإشارات1،30. ومع ذلك ، فإن تصورها يثبت أن يكون صعبا كما حجمها الصغير يقع تحت الحد الحيود من المجهر الخفيفة. المباشرة الاستوشاستيك البصرية...

Disclosures

ليس لدى .C تضارب في المصالح للإعلان عنه. R.P.M وD.P.D. تلقي الدعم المادي من أكسفورد Nanoimaging (ONI) وشركة Cytiva (سابقا جنرال الكتريك للرعاية الصحية). وتعلن .M وجمهورية جمهورية الولايات المتحدة مصالح متنافسة على إمكانية تسويق بعض المعلومات المقدمة. وتدار هذه من قبل جامعة كارولينا الشمالية. لم تشارك مصادر التمويل في تفسير أو كتابة هذه المخطوطة.

Acknowledgements

نود أن نشكر أكسفورد Nanoimaging على ردود فعلهم البناءة والتوجيه. تم تمويل هذا العمل من قبل 5UM1CA121947-10 إلى R.P.M و1R01DA040394 إلى D.P.D.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin solutionGibco15140-122
50 mL conical tubeThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatusGenesee25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beadsThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnCytiva17548151
Molecular Biology Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingCustom
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
Polyethylene glycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlasksGenesee25-211
Tetraspek microspheresInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved